Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van een luciferase-expresserende stam te valideren voor de niet-invasieve monitoring van in vivo biofilmvorming door candida albican-cellen. Dit wordt bereikt door fragmenten van katheters, gekoloniseerd met een luciferase-expresserende stam van candida albicans, in de rug van een muis te implanteren. Tijdens de tweede stap wordt de gist toegestaan om te groeien tot een dikke laag cellen ingebed in een extracellulair matrix, waardoor een volwassen biofilm ontstaat aan de binnenkant van de katheters.

Vervolgens wordt een substraat toegevoegd dat door het luciferase-enzym wordt omgezet. Deze reactie produceert meetbaar licht. Bioluminescente beeldvorming of BLI wordt vervolgens gebruikt om de vorming van de biofilm binnen de levende gastheer te registreren en te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande technieken, zoals het centrale Venmo-systeem, is dat we tot zes biofilms in één dier kunnen testen, waardoor het aantal dieren dat we nodig hebben voor statistische analyse aanzienlijk wordt verminderd.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van candida albicans-biofilmvorming, aangezien onze methode het eenvoudig maakt om bestaande en nieuwe antischimmelcomponenten te testen. Ook kan deze methode inzicht geven in candida albicans, schimmelbiofilms. Het kan ook worden toegepast op andere microben zoals bacteriën of andere schimmelsoorten.

De voorgestelde procedures zijn eenvoudig te implementeren in elk laboratorium dat 24 uur voorafgaand aan de chirurgische procedure toegang heeft tot een dierfaciliteit. Open de verpakking met de drie-lumen katheters binnen een biologische veiligheidskast. Gebruik steriele pincetten om alle onnodige onderdelen te verwijderen en een steriele scalpel om het deel dat aan de katheter is bevestigd te snijden. Plaats vervolgens een liniaal onder de plastic verpakking en snijd de polyurethaan katheter in stukken van één centimeter lang.

Vervolgens vult u elke katheter met ongeveer 1,8 milliliter 100% foetaal bovien serum en incubeert u de stukken bij 37 graden Celsius een nacht. De volgende ochtend brengt u elk serum-gecoate katheterstuk over naar individuele microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter en schraapt u C albicans van een YPD-plaat in één milliliter PBS in een aparte microcentrifugebuis bij een verdunning van één op honderd. Na het tellen, verdunt u de celsuspensie tot een eindconcentratie van vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter.

En voegt u één milliliter cellen toe aan elk van de serum-gecoate katheterstukken. Laat de cellen 90 minuten bij 37 graden Celsius aan de katheters hechten. Houd vervolgens de buisjes met steriele pincetten in een verticale positie.

Spoel voorzichtig elk stuk twee keer door het lumen met één milliliter PBS om de katheters te plaatsen. Begin met het scheren van de onderrug van een acht weken oude, anesthetische muis die op een verwarmingskussen is gepositioneerd. Desinfecteer vervolgens de huid en maak een kleine snede van 0,5 tot één centimeter aan elke kant van het dier.

Vervolgens dissecteert u het subcu met schaar om twee subcutane tunnels van ongeveer 1,5 centimeter lang en één centimeter breed te maken. Breng drie katheterstukken in elke tunnel in en zorg ervoor dat de stukken naast elkaar in een horizontale opstelling liggen zonder overlapping. Sluit de sneden met hechtingen en reinig vervolgens de wonden heel voorzichtig met een ontsmettingsmiddel.

Breng vervolgens een lokaal anestheticum direct aan op de sneden en toedien een anesthesie-reverserend middel en bewaak de dieren totdat ze volledig zijn hersteld. Om de biofilmvorming op het juiste experimentele tijdstip te beeld, injecteert u 100 microliter vers bereide coil en terezin subcutaan in elk gebied dat de katheters bevat in een anesthetiseerde dier. Vervolgens verwerft u opeenvolgende scans met acquisitietijden variërend van 20 tot 60 seconden totdat de maximale signaalintensiteit is bereikt.

Tijdens het verkrijgen van de volgende frame, plaatst u een interessegebied over elke trio katheters om de bioluminescente beeldvorming of BLI signaalintensiteit van de eerder verworven frames te meten. Plaats ook een rechthoekig interessegebied van vaste grootte op een controlegebied om de achtergrondsignaal in levende beeldsoftware te meten. Meet de fotonflux door de interessegebieden voor elke kathetertrio, evenals voor de achtergrond.

Na het herhalen van deze metingen voor elk dier en op verschillende tijdstippen tijdens de biofilmvorming, rapporteert u de BLI signaalintensiteit van elke kathetertrio als fotonflux per seconde. De gegevens kunnen direct worden gekopieerd en in een spreadsheetprogramma worden geplakt. Aan het einde van het longitudinale experiment, offert u elk dier op, snijdt u door het subcutane weefsel en gebruikt u steriele pincetten om de katheterfragmenten een voor een te verwijderen.

Was de katheters twee keer in één milliliter PBS zoals zojuist is gedemonstreerd. Soniceer vervolgens de stukken in een nieuwe microcentrifugebuis in één milliliter vers PBS bij 40.000 hertz in een waterbad. Soniceer na 10 minuten, plaats de buisjes met de katheters op ijs en plateer 100 microliter van de originele monsters bij één op tien en één op honderd verdunning op YPD-agarplaten.

In duplicaat. Plot uiteindelijk het gemiddelde en de standaardafwijking van de kolonievormingseenheden. En BLI signaal voor elk dier op een logaritmische schaal.

In deze afbeelding wordt een representatief dier getoond dat het bioluminescentie signaal samen met een interessegebied weergeeft, zes dagen na biofilmontwikkeling. Merk het gebrek aan signalering in het controle-achtergrondgebied op, wat de beperking van de biofilm tot de gebieden onmiddellijk naast de candida-gecoate katheters bevestigt. In dit representatieve experiment kan een duidelijke BLI signaal worden waargenomen dat wordt geproduceerd door de luciferase-expresserende biofilms, terwijl alleen achtergrondsignaal lijkt te worden geproduceerd door de wilde typestam.

Deze toename in signaal volgt dezelfde trend als de toename in kolonievormingseenheden per biofilm en de fotonfluxmetingen voor elke groep dieren samen genomen. Deze