Name: Meting van mRNA Decay tarieven in Saccharomyces cerevisiae Het gebruik van Rpb1-1 Stammen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer mRNA-afbraaksnelheden meten in Saccharomyces cerevisiae met behulp van temperatuurgevoelige Rpb1-1-stammen. Deze methode onthult genregulatie door mRNA-stabiliteit in gist te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in het laboratorium van de auteur wordt ondersteund door het Norman Hackerman Advanced Research Program van de Texas Higher Education Coordinating Board en startkapitaal van Baylor University.

1. Groei van gistcellen <ol><li> Selecteer de geschikte giststammen worden gebruikt voor het mRNA verval snelheidsmetingen. Om transcriptie te remmen met behulp van de temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II, gebruiken giststammen het herbergen van de rpb1-1 mutatie 1. Haal dit giststam uit een laboratorium dat al één of genereren in het laboratorium met behulp van standaardtechnieken als een specifieke genetische achtergrond vereist 9. </li><li> Met behulp van steriele techniek, bereiden gist media met behulp van standaard procedures 10. Als er geen selectie is nodig, voor te bereiden rijke media zoals YPD. Alternatief bereiden selectieve media als de gistcellen getransformeerd met plasmiden en selectie vereist. Autoclaaf de media. </li><li> Groeien de gistcellen bij 28 ° C, de permissieve temperatuur voor deze giststam. Doe dit in twee stappen: <ol><li> Voor de eerste O / N, groeien de gistcellen in 5 ml groeimedium tot verzadiging.</li><li> Stel de tweede O / N aan het eind van de tweede dag. Voor de tweede O / N, enten verschillende hoeveelheden gistcellen van de eerste O / N in 100 tot 150 ml groeimedium (van 100 pi tot 1 ml, 2 ml of meer, afhankelijk van wanneer de gistcellen moeten geoogst de volgende dag). Doe deze stap zodat een van de kweken op de juiste OD600 de volgende dag. </li></ol></li></ol> 2. Oogst de gistcellen <ol><li> Bereid je voor om de gistcellen te oogsten. De timing van deze stap is kritisch; labelen alle benodigde buizen en alle benodigde apparatuur en materialen op één plaats verzamelen. Verwarm een ​​waterbad tot 39 ° C en verwarm twee 15 ml reageerbuizen van het kweekmedium bij 28 ° C en bij 60 ° C. Opmerking: de 15 ml groeimedium volume kan worden gevarieerd afhankelijk van het aantal tijdstippen de cellen worden geoogst. </li><li> Oogst de gistcellen bij het ​​bereiken van een OD 600 van 0,4-0,7. Transfer de cellen 4-6 steriele 50 ml schroefdop flessen. Centrifugeer bij 7500 xg bij een hoge snelheid centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 15 ml kweekmedium dat werd equilibreren bij 28 ° C. Verzamel de gistcellen in een steriele 250 ml kolf en equilibreren hen ~ 5 minuten bij 28 ° C groeitemperatuur. </li><li> Nadat de gistcellen hebben geëquilibreerd bij de groeitemperatuur, voeg onmiddellijk 15 ml groeimedia geëquilibreerd bij 60 ° C om de temperatuur op 39 ° C (de niet-tolerante temperatuur) en zij plaatst de kolf 39 ° C waterbad . Zorg ervoor dat het kweekmedium blijft in het 39 ° C waterbad gedurende de resterende cellen geoogst maatregelen om transcriptie uitgeschakeld. </li><li> Oogst de cellen op verschillende tijdstippen na het plaatsen van de kolf in de 39 ° C waterbad. Voor de eerste testmoment, oogst de cellen direct na het plaatsen van de kolf op 39 &amp; #176; C. Oogst van een 3 ml monster en distribueren van de 3 ml in twee, 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Pellet de cellen gedurende 10 seconden in een mini-centrifuge of picofuge met snelle vertraging en giet het supernatant. </li><li> Onmiddellijk invriezen pellet in een droogijs / ethanol bad of in vloeibare stikstof. Wijs het eerste tijdstip de cellen geoogst op het tijdstip nul. </li><li> Experimenteel bepalen tijdstippen worden de cellen geoogst bij later met proefproject, afhankelijk van het mRNA van belang. Normaal oogst gistcellen op de volgende tijdstippen: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 en 35 min (figuur 2B). Als het mRNA halfwaardetijd niet kan worden bepaald met de bovengenoemde tijdstippen Pas deze tijdstippen. Bijvoorbeeld voor mRNA met verwachte korte halfwaardetijden, gebruik kortere punten (dwz 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 en 18 min) en mRNA met verwachte lange halfwaardetijden verlengen de tijdstippen. </li><li> Nadat de cellen harvested, bewaar ze in een -80 ° C vriezer tot RNA-extractie wordt uitgevoerd. </li></ol> 3. Uittreksel RNA uit de gistcellen <ol><li> Voor de RNA-extractie deel van het protocol, gebruiken RNase vrij technieken om degradatie van het RNA te voorkomen door RNases. Bereid RNase vrij oplossingen, glaswerk en kunststofmateriaal voor gebruik in de extractie van het RNA. </li><li> Extraheer het RNA van de gistcellen volgens standaardprotocollen. Typisch, gebruik maken van de hot fenolmethode 12. Alternatief gebruik kits die kunnen worden gebruikt om RNA te extraheren uit gistcellen. </li><li> Bepaal de hoeveelheid en zuiverheid van het RNA, gewoonlijk door het meten van de absorptie bij A260 en A280 van 2 pi van RNA met een Nanodrop. Bepaal de concentratie van het RNA van de A 260. Op basis van de concentratie verdunnen RNA tot 1 ug / ul met DEPC behandeld water. OPMERKING: De verhouding van de A260 / A280 geeft informatie over tHij zuiverheid van het RNA. Een RNA monster zuiver als de A260 / A280 verhouding 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Northern blotanalyse OPMERKING: Northern blots met mRNA te kwantificeren en het verkrijgen van informatie over de grootte van de transcripten. Daarnaast gebruiken northern blots te mRNAs die meerdere isovormen van hetzelfde mRNA produceren detecteren. <ol><li> Bereid een 1,0% agarose-formaldehyde gel. Run gelijke hoeveelheden van het monster RNA op agarose formaldehyde gel met elektroforese volgens standaardprotocollen 12. Voer een RNA ladder langs het RNA-monsters en gebruiken om de grootte van de RNA die worden gedetecteerd op het noordelijke blot bepalen. Alvorens de RNA gescheiden op agarose formaldehyde gel op een membraan, snijd de laan met de RNA ladder uit de gel en visualiseren met ethidium bromide. Opmerking: Als alternatief kan de gehele gel worden gekleurd met ethidiumbromide voor overdracht van het RNA. </li><li> EenN a de RNA monsters overgezet naar een geschikte afstand op de gel, breng het RNA aan een membraan met RNase vrij technieken. Gebruik één van verscheidene protocols beschikbaar om over RNA membranen 12-13. Om het RNA naar een membraan, snijd het membraan ongeveer dezelfde grootte als de gel. Breng het RNA volgens standaardprotocollen 12. </li><li> UV verknopen het RNA aan het membraan met UV crosslinker volgens de instructies van de fabrikant. Alternatief bak het membraan in een oven op 80 ° C gedurende 1 uur. Bewaar het membraan bij -20 ° C in een plastic zak onbeperkt totdat gehybridiseerd aan probes. OPMERKING: De droge membraan kan ook bij RT worden opgeslagen tussen filter papieren. </li></ol> 5. hybridiseren Probes Complementair aan het RNA van belang zijn voor de Membrane OPMERKING: Een manier om mRNA te detecteren op het membraan om 32P gemerkte DNA-probes hybridiseren. LET OP: Researchers werken met 32p moeten beschermende procedures gebruiken om besmetting te voorkomen. Volg institutionele richtlijnen over het gebruik van radioactief materiaal. <ol><li> Bereid de DNA-probe van etikettering 25-50 ng van het DNA wordt gehybridiseerd met het membraan volgens standaardprotocollen 12. Genereer het DNA-fragment door PCR of plasmide digestie. Bepaal de specifieke activiteit van de DNA probe door het tellen van 1 pl van het radioactief gemerkte DNA-probe nadat de opgenomen nucleotiden verwijderd 12. </li><li> Verwarm prehybridisatie / hybridisatiebuffer bij 42 ° C. Gebruik ~ 10 ml van de prehybridisatie / hybridisatiebuffer per 100 cm2 van het membraan 12. </li><li> Hybridiseren 1-5 x 10 6 cpm van radioactief gemerkte DNA probe per ml hybridisatiebuffer het membraan O / N in een hybridisatie oven aan het mRNA detecteren van belang 12. Zorg ervoor dat de rotatie hybridisatie oven tijdens de hybridisatie in een richting dieveroorzaakt het gehele membraan wordt blootgesteld aan de hybridisatie oplossing voor een goede hybridisatie waarborgen. </li><li> Was het membraan tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 15 min met 50 ml 2 x SSPE en één keer bij 65 ° C met 50 ml 2 x SSPE / 2% SDS gedurende 15 min 12. Wikkel de membraan in plastic folie te zorgen dat het niet uitdroogt of vervuilen het fosforscherm. </li><li> Met een geigerteller, een schatting van de intensiteit van de radioactiviteit op het membraan. OPMERKING: Deze schatting waarborgt dat het membraan wordt blootgesteld aan het fosforscherm de juiste tijd. Gebruik langere belichtingstijden voor membranen met lage hoeveelheden radioactiviteit. </li><li> Voor Noord-vlekken, gebruik een laad-controle om te bevestigen dat gelijke hoeveelheden RNA op elke plek worden geladen. Om dit te doen, strip de membraan en reprobe het met een RNA dat niet wordt beïnvloed door het proces wordt onderzocht. Strip de membraan door het te plaatsen in een glazen bak met 200 ml kokend stripoplossing (0,1% SDS / 0.01 XSSC) gedurende 2 min. Giet de stripoplossing en herhaal de procedure vijf keer 12. Opmerking. Een voorbeeld van een RNA als lading controle SCR1 SCR1 een RNA polymerase III transcript dat stabiel en overvloedig SCR1 RNA overvloed niet significant verandert gedurende korte periodes van RNA polymerase II remming.. </li></ol> 6. kwantificeren van de RNA dat is gebonden aan het membraan OPMERKING: Om de hoeveelheid radioactiviteit op membraan te kwantificeren, het membraan bloot aan een Phosphor scherm. Na de juiste belichtingstijd, scan de Phosphor-scherm met een fosforimager. <ol><li> Scan de Phosphor scherm met behulp van de instructies van de fabrikant van de fosforimager. </li><li> Kwantificeren van het mRNA op elk tijdstip. Kwantificeren mRNA niveaus met behulp van ImageQuant software of gerelateerde software. Normaliseren van de mRNA op elk tijdstip voor het laden controle. Als SCR1 werd gebruikt als het ladencontrole, normaliseren de halfwaardetijd northerns te SCR1. </li><li> De halfwaardetijd van het mRNA wordt berekend door de hoeveelheid mRNA nog op elk tijdstip door de hoeveelheid mRNA aanwezig op tijdstip 0 (het eerste tijdstip) delen. Grafiek het percentage mRNA resterende versus tijd op een semilogaritmisch perceel (figuur 2C). Bereken mRNA halfwaardetijden door de volgende vergelijking: t 1/2 = -0,693 / k (negatieve 0,693) </li><li> k is de helling van de best passende lijn en t 1/2 is de mRNA halfwaardetijd. </li></ol>

<ol><li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li>
<li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li>
<li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+thiolutin%2C+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.</li>
<li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li>
<li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li>
<li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li>
<li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMD%3A+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li>
<li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Polymerase+II+subunit+composition%2C+stoichiometry+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).</li>
<li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li>
<li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Remming van mRNA-synthese en controle in de afwezigheid van nieuwe synthese mRNA omzet een werkwijze die vaak wordt gebruikt om mRNA vervalsnelheid meten. In S. cerevisiae, meting van mRNA dempingssnelheden door remming van transcriptie met het temperatuurgevoelige allel van RNA polymerase II is een van de meest gebruikte methoden. Deze werkwijze remt specifiek RNA polymerase II. De belangrijkste stappen voor het bepalen van mRNA dempingssnelheden deze techniek zijn: 1) Voorafgaand aan het oogsten van de gistce...

De transcriptie en het verval van specifieke mRNA zijn cruciaal determinanten van genexpressie. De snelheid van synthese en afbraak van specifieke mRNAs bepaalt de steady-state niveau van dat mRNA. De steady state niveaus van mRNA regelen de overvloed aan mRNA en bepalen hoeveel van elk mRNA beschikbaar voor eiwitsynthese. Metingen van mRNA halfwaardetijden worden op grote schaal gebruikt om de vervalsnelheid van mRNA&#39;s te bepalen. Specifieke mRNA verval verschillende tarieven die betrekking hebben op functies van het mRNA, de functie van het eiwit gecodeerd door het mRNA en de omgevingsomstandigheden. Afhankelijk van de techniek gebruikt om mRNA verval tarieven te bepalen, kan vervalsnelheid metingen worden bepaald, hetzij globaal of voor afzonderlijke transcripten. In de gist S. cerevisiae, de technieken die het meest worden gebruikt om globale mRNA vervalsnelheden meten onder andere gebruik te maken van een giststam die het op temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II en chemische transcytoseriptional remmers zoals thiolutin en 1,10-fenantroline 1-5. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om individuele mRNA afstandsdempingssnelheden 4 meten. Andere werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om mRNA vervalsnelheid meten. Deze werkwijzen omvatten benadering steady state etikettering of gebruik van mRNA-moleculen die tot expressie van een gereguleerde promoter die expressie alleen in bepaalde omstandigheden. Elk van deze technieken heeft bepaalde voordelen en beperkingen. De hier beschreven techniek maakt gebruik van de temperatuur gevoelige allel van RNA polymerase II. Deze methode maakt gebruik van S. cerevisiae als model, maar kan gewijzigd en gebruikt in andere systemen met specifieke transcriptionele remming technieken 6. mRNA halfwaardetijd metingen met behulp van de temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II worden veel gebruikt voor zowel genoom-brede en individuele metingen van mRNA verval 4-5. Deze techniek vereist het gebruik van een specific giststam die een temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II, rpb1-1 1 herbergt. De reden voor deze techniek is dat blootstelling van de temperatuur gevoelige giststam de permissieve temperatuur remt synthese van mRNA. Vervolgens wordt verval van de reeds bestaande mRNA gecontroleerd op verschillende tijdstippen na de transcriptie werd geremd. Het verdwijnen van de reeds bestaande mRNA wordt gevolgd door extractie van RNA uit de gistcellen op verschillende tijdstippen na transcriptie is uitgeschakeld. De tijdstippen waarop de gistcellen geoogst worden bepaald door proeffase, en afhankelijk van de transcripties en systeem onderzocht. Snellere tijdstippen worden gebruikt voor korte duur transcripties, terwijl langere tijdstippen worden gebruikt voor langere woonde transcripties. Daarna wordt het verval van het mRNA gevolgd door een Northern blot analyse, kwantitatieve PCR of RNAseq. Meting van mRNA halfwaardetijd met een temperature gevoelige allel van RNA-polymerase II heeft zo zijn voordelen. Ten eerste, deze techniek is eenvoudig en ongecompliceerd. Ten tweede, wanneer de giststam wordt verkregen of geproduceerd in het laboratorium de mRNA halfwaardetijd metingen kunnen verschillende kweekomstandigheden te bepalen; waardoor de bepaling van milieu-invloed op mRNA verval. Ten derde kan mRNA vervalsnelheden worden gecontroleerd genome-wide. Het gebruik van andere transcriptie remming technieken heeft ook voordelen en beperkingen. Bijvoorbeeld, het gebruik van een induceerbare promoter vereist subklonering van een mRNA dat onder controle van de gereguleerde promoter genereren. Thiolutin is niet direct beschikbaar en is duur, indien beschikbaar. Bovendien wordt werkingswijze thiolutin&#39;s niet volledig begrepen en er is gemeld beïnvloeden andere cellulaire processen waaronder remmen mRNA verval 7. Alternatief, 1,10-fenantroline, gemakkelijker beschikbaar. Bovendien alle technieken om transcriptie te remmen kan pertURB cellulaire functie en kan invloed hebben op verschillende mRNA&#39;s in verschillende manieren. Een onderzoeker moet de meest geschikte methode te gebruiken in hun experimentele omstandigheden de meest betrouwbare resultaten te bereiken bepalen. Om te bepalen welke methode het meest geschikt is voor hun toepassing, een onderzoeker moet de transcripten en de functie van de eiwitten waarvoor de transcripten onderzocht identificeren. De meest betrouwbare mRNA vervalsnelheid metingen zijn die zijn bepaald met behulp van meerdere technieken en vertonen dezelfde vervalsnelheid. Één techniek altijd de beste en de meest geschikte techniek afhankelijk van de specifieke situatie. Talrijke studies in S. cerevisiae hebben mRNA vervalsnelheden gemeten in verschillende omstandigheden en genetische achtergronden. De voorwaarden die mRNA afstanddemping gemeten afhankelijk van het specifieke experiment onderzocht. Het meten van mRNA vervalsnelheden in verschillende cellulaire omgevingen bepaalt of aan de voorwaarden wordtonderzocht bij voorkeur van invloed op de vervalsnelheid van specifieke mRNA&#39;s. De vervalsnelheid van mRNA&#39;s kunnen ook variëren afhankelijk van de giststam wordt gebruikt. Bijvoorbeeld kan mRNA vervalsnelheden bepaald wild-type gistcellen en gistcellen met een functioneel-nonsense gemedieerde mRNA afbraak (NMD) route. Dit mRNA afbraak route is te vinden in alles wat tot nu toe zijn onderzocht eukaryote organismen en activeert het de afbraak van mRNA&#39;s die voortijdig beëindigen vertaling 8. NMD werd aanvankelijk geïdentificeerd als een traject dat mRNA teruglopen bij voortijdige beëindiging codons of nonsense codons, maar wordt nu erkend als een pad dat ook de expressie van niet-nonsense bevattende natuurlijk mRNA. mRNA dat zijn doelwit van de route worden snel afgebroken in gistcellen met een functionele NMD route en gestabiliseerd in gistcellen met een niet-functionele NMD pad. Zo is de halfwaardetijden van mRNA dat de directe doelstellingen van deze route zijn korter zijn, wild-type gist cells vergeleken gistcellen met een functioneel NMD route.

<table><tbody><tr><td>High Speed Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus membrane</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternatief kan de membraan in een oven worden gebakken die is ingesteld op 80&deg; gedurende 1 uur</td></tr><tr><td>NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Giststammen die de rpb1-1 mutatie dragen</td><td></td><td>Giststammen kunnen worden verkregen uit een laboratorium of gemaakt met een specifieke achtergrond</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van mrna decay tarieven in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; het gebruik van<em&gt; rpb1-1</em&gt; stammen

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state niveaus variëren, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden. Regulering van de steady state niveaus accumulatie van mRNA zorgt dat de juiste hoeveelheid eiwit wordt gesynthetiseerd specifieke groeiomstandigheden van de cel. Eén benadering voor het meten van mRNA afstandsdempingssnelheden is remmen transcriptie en daaropvolgende toezicht het verdwijnen van de reeds aanwezige mRNA. Het tarief van mRNA verval kan dan worden gekwantificeerd, en een nauwkeurige halfwaardetijd kan worden bepaald met behulp van verschillende technieken. In S. cerevisiae, protocols die mRNA halfwaardetijden ontwikkeld meten en omvat de inhibitie transcriptie van mRNA met stammen die een temperatuur gevoelige allel van RNA polymerase II, rpb1-1 haven. Andere technieken voor het meten van mRNA halfwaardetijden omvatten remmende transcriptie met transcriptie- remmers zoals thiolutin of 1,10-fenantroline, of alternatief door gebruik mRNAs die onder de controle van een reguleerbare promoterzoals galactose induceerbare promoter en de TET-off systeem. We beschrijven hier meting van S. cerevisiae mRNA decay rates met behulp van de temperatuur gevoelige allel van RNA-polymerase II. Deze techniek kan worden gebruikt om mRNA afstandsdempingssnelheden van afzonderlijke mRNA of genoom-brede meten.

<html> Het vermogen van dit protocol om mRNA afstandsdempingssnelheden nauwkeurig afhankelijk remming van transcriptie, het oogsten van gistcellen op de juiste tijdstippen en het gebruik van RNase vrije technieken die RNA extractie en Northern blotting. Indringende voor twee controle mRNA bekend onstabiel en stabiel te zijn, respectievelijk, geeft vertrouwen dat het experiment werkte. Bijvoorbeeld kan dit worden bereikt door sonderen met een probe die zowel de CYH2 pre-mRNA en mRNA detecteert. Figuur 2B<...

Het steady state niveau van specifieke mRNA&#39;s wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA&#39;s kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om mRNA-vervalpercentages in de gist Saccharomyces visi te meten. Dit wordt bereikt door eerst gistcellen te laten groeien tot de logfase bij de permissieve temperatuur. Vervolgens worden de cellen overgebracht naar een hogere temperatuur waarbij de totale mRNA-synthese wordt geremd.Yeastmonsters worden vervolgens geoogst op vooraf bepaalde tijdstippen voor elk monster. Het totale RNA wordt geëxtraheerd, gescheiden door gelelektroforese en overgebracht naar een membraan. Ten slotte wordt noordelijke hybridisatie uitgevoerd om eventuele veranderingen in mRNA-niveaus als functie van de tijd vast te stellen.Uiteindelijk kan dit protocol worden gebruikt om mRNA-vervalpercentages van individuele mRNA's of op het hele genoom te meten onder verschillende groeiomstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het RNA-vervalveld, zoals of RNA-vervalpercentages variëren onder verschillende cellulaire omstandigheden en genetische achtergronden. Het uitvoeren van deze procedure zal Megan Pelli zijn, een afgestudeerde student uit mijn lab.Om te beginnen bereidt u een startercultuur voor door een enkele gistkol

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

We beschrijven een protocol voor genereren prolifererende en zwakke primaire menselijke dermale fibroblasten, monitoring transcript verval tarieven en differentieel rottend genen te identificeren.

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Hier introduceren en beschrijven we een niet-radioactieve en niet-invasieve methode om de novo-eiwitsynthese in vivo te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de nematode Caenorhabditis elegans en fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Deze methode kan worden gecombineerd met genetische en/of farmacologische schermen om nieuwe modulatoren van eiwitsynthese te identificeren.

Beoordeling van de novo Eiwit synthese tarieven in Caenorhabditis elegans

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

Leer mRNA-afbraaksnelheden meten in Saccharomyces cerevisiae met behulp van temperatuurgevoelige Rpb1-1-stammen. Deze methode onthult genregulatie door mRNA-stabiliteit in gist te analyseren.

Meting van mRNA Decay tarieven in

Meer video's verkennen