Name: Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Leer subretinale injecties van RPE-cellen in knaagdieren met minimale trauma. Deze methode gebruikt scherpe en stompe naalden voor effectieve celafgifte en kan worden toegepast op preklinische retinale degeneratiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Alison Dorsey bedanken voor haar hulp bij het ontwikkelen van de subretinale injectietechniek. We erkennen ook het National Eye Institute (NEI-subsidies EY11254 en EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM-subsidie TR1-01219) en het Lowy Medical Research Institute (LMRI) voor zeer genereuze financiering voor dit project.

Opmerking: Alle dieren werden volgens de ethische richtlijnen die door de Scripps Research Institute behandeld. 1. Voorbereiding van Materialen voor de Injectie (~ 20 min) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Voorverwarmen cel dissociatie oplossing (bij voorkeur een die wordt geïnactiveerd door verdunning niet met serum), steriel PBS, en kweekmedia (Tabel 1). </li><li> Steriliseren van de spuit met een stompe naald door het demonteren en het koken van de onderdelen in water gedurende 15 min. </li></ol> 2. Bereiding van de RPE cellen voor injectie (~ 30 min tot 1 uur) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Maak de RPE cellen met voorverwarmd cel dissociatie oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C. </li><li> Schraap de cellen zachtjes om elke dat verbonden blijven los. </li><li> Verdun de cellen met een groot volume kweekmedium (vullen een 15 ml buisje) de dissociatie oplossing inactiveren en tellen. </li><li> Centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. </li><li> Resuspendeer de cellen bij 200.000 cellen / ul (100.000 cellen leveren een 0,5 pi volume) in steriele voorverwarmde PBS en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg desgewenst een levende cel voorbijgaande fluorescente merker en incubeer bij 37 ° C gedurende 30-45 min. </li><li> Plaats de spuit met een stompe naald met 0,5 ul van cellen. Injecteer de cellen zo spoedig mogelijk. </li></ol> 3. Sub-retinale Injectie (~ 5 min per injectie) OPMERKING: Als het mogelijk is, leren de techniek met volwassen albino ratten sinds de limbus schepen zijn veel gemakkelijker te visualiseren. Injecteer Fast Green oplossing bij het leren (voordat u cellen injecteren) visualisatie van de injectieplaats gemakkelijker vergemakkelijken. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verdoven van het knaagdier. Gebruik intraperitoneale injecties van 100 mg / ml ketamine en 10 mg / ml xylazine (20 gl / 10 g lichaamsgewicht wacht) over isofluorane inhalatie omdat het moeilijk is om het knaagdier manoeuvreren en injecteren in het oog met de snuit in de inhalator. <ol><li> Zorg ervoor dat het dier diep wordt verdoofd door knijpen een van zijn poten. Als het flinches, wacht u nog enkele minuten en probeer het opnieuw voor het begin van de subretinale injectie. </li></ol></li><li> Plaats het knaagdier op zijn zijkant zodat het oog, dat zal worden geïnjecteerd wordt geconfronteerd met het plafond. </li><li> Onder een dissectiemicroscoop voorzichtig rekken van de huid, zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (tijdelijke proptosis) en wordt meer toegankelijk te houden haar hoofd met twee vingers net boven het oor en door zijn kaak en voorzichtig rekken de huid parallel aan de oogleden zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (zie figuur 1C). Niet begrijpen het knaagdier te dicht bij de keel. </li><li> Met een 30 G scherpe wegwerp-pre gesteriliseerde naald, maak een gat direct onder de limbus (als de schepen worden getroffen, zal bloeden be significante en moeilijk zijn om het gat vinden later) en onder een hoek met raak de lens met de naald (figuur 1D). Raak de lens met de scherpe (of stompe) naald of onmiddellijke vorming cataract zal optreden. OPMERKING: Injecties werken beter met twee mensen. Op deze manier kan één persoon de spuit pas met de stompe naald naar de persoon die de injectie nadat ze het eerste gat hebt gemaakt met de scherpe naald voor eenmalig gebruik om de focus te houden op waar het gat is. </li><li> Trek de disposable scherpe naald uit het oog terwijl het handhaven van de grip op het hoofd. Vergeet niet precies waar het gat is. </li><li> Na ofwel de montage van de vooraf geladen spuit met een stompe naald op een micromanipulator vasthoudt of aan de hand, steek de punt van de spuit met de stompe naald door het gat, het verzorgen wederom de lens niet aanraakt en duw het door het oog heel zachtjes tot het gevoel weerstand (figuur 1D). </li><li> Keeping alle bewegingen tot een minimum voorzichtig injecteer de RPE cellen langzaam in de subretinale ruimte. OPMERKING: RPE / netvlies detachement zal worden opgewekt; dit onvermijdelijk is. Echter, een schonere injectie minimaliseert het losmaken en verbetert de kans heraanhechting (figuur 1E). Elke overdreven bewegingen kan de naald terug te gaan naar het netvlies, en zijwaartse bewegingen kan het netvlies beschadigen. Het gebruik van een injectiepomp optioneel, maar maakt een zeer nauwkeurige levering. </li><li> Trek de spuit langzaam. Solliciteer oog hydraterende daalt voor het oog gehydrateerd. </li><li> Blijven toezien op het dier totdat het herwint borstligging. Laat dier niet onbeheerd of terug te keren naar een kooi met andere alert dieren totdat hij herwint borstligging. </li></ol>

<ol><li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJong%2C+PT+%22Age-related+macular+degeneration%22">Age-related macular degeneration</a>. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto+iris+pigment+epithelial+cell+transplantation+in+patients+with+age-related+macular+degeneration%3A+short-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results.</a> The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+retina+for+management+of+subfoveal+choroidal+neovascularization+II%3A+a+preliminary+report+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans.</a> Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Joussen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+complete+is+successful+%27Autologous+retinal+pigment+epithelium+and+choriod+translocation+in+patients+with+exsudative+age-related+macular+degeneration%3A+a+short-term+follow-up%27+by+Jan+van+Meurs+and+P.R.+van+Biesen%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).</li>
<li>Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+outcomes+following+macular+translocation+with+360-degree+peripheral+retinectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy.</a> Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).</li>
<li>Machemer, R., Steinhorst, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+separation%2C+retinotomy%2C+and+macular+relocation%3A+II.+A+surgical+approach+for+age-related+macular+degeneration%3F+Graefes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes.</a> Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).</li>
<li>MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+transplantation+of+the+retinal+pigment+epithelium+and+choroid+in+the+treatment+of+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration.</a> Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa).</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+embryonic+stem+cell+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration.</a> Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+from+iPS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e50932(2014).</li>
<li>Huber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+mouse+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).</li>
<li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mouse+retinal+degeneration+with+high-resolution+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vision%22%5BJournal%5D)">Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography.</a> Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).</li>
<li>Pennesi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+retinal+degeneration+in+rd1+and+rd10+mice+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).</li>
<li>Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+remodeling+in+mammalian+retina%3A+results+from+studies+of+experimental+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment.</a> Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Diniz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft commerciële belangen die bekend moeten worden gemaakt.

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren subretinale injecties van RPE cellen in suspensie bij ratten en muizen. Het protocol is eenvoudig te leren en ervaring met de techniek zal vertalen in minder trauma (figuur 3; dit is een van de betere injecties), vooral een micromanipulator wordt gebruikt (figuur 1A). Elk trauma kan worden gevolgd in vivo met een cSLO en oktober (zie figuur 2), indien beschikbaar. Als afbeeld...

Het sensorische netvlies is georganiseerd in functionele lagen van neuronen, gliacellen en endotheelcellen. Fotoreceptoren aan de achterkant van het netvlies worden geactiveerd door licht; via fototransductie zetten ze fotonen om in elektrische signalen die worden verfijnd door interneuronen en worden doorgegeven aan de visuele cortex in de hersenen. Fototransductie kan niet plaatsvinden zonder de gecoördineerde inspanningen van Mueller-glia en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE is georganiseerd in een monolaag direct achter de fotoreceptoren en vervult meerdere en diverse functies die essentieel zijn voor de functie en homeostase van fotoreceptoren. In feite zijn RPE en fotoreceptoren zo onderling afhankelijk dat ze worden beschouwd als één functioneel geheel. De dood of disfunctie van RPE leidt tot verwoestende secundaire effecten op fotoreceptoren en is geassocieerd met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van blindheid bij ouderen1,2.
Hoewel er nog geen remedie is ontdekt voor AMD, hebben verschillende klinische onderzoeken aangetoond dat RPE-celvervanging een veelbelovende therapeutische optie kan zijn3-13. Met de komst van stamceltechnologie is het nu mogelijk om grote aantallen RPE-cellen in vitro te genereren uit embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hES en hiPS) die functioneel en anatomisch sterk lijken op hun somatische tegenhangers14-26. Stamcel-afgeleide RPE is ook aangetoond te functioneren in vivo door meerdere onafhankelijke groepen, waaronder de onze, om retinale degeneratie in ratten- en muislijnen met spontane retinale degeneratie aanzienlijk te vertragen16,18,21,22,25,28,29. Deze combinatie van klinische en preklinische ondersteunende bewijzen is zo overtuigend dat er nu verschillende klinische onderzoeken aan de gang zijn om retinale degeneratie te voorkomen met behulp van stamcel-afgeleide RPE-cellen30,31.
RPE kan gemakkelijk worden afgeleid van hES en/of hiPS en geïmplanteerd in de subretinale ruimte van knaagdieren met behulp van verschillende afleidings- en injectietechnieken32,33. (Zie Westenskow et al. voor een methodenartikel in multimediaformaat dat het gedirigeerde differentiatieprotocol weergeven dat we hanteren)34. Er zijn kritische blijvende vragen met betrekking tot de veiligheid, overleving en functionele capaciteit van exogeen toegediende RPE-cellen na implantatie, daarom is het vermogen om subretinale injecties bij knaagdieren uit te voeren een kritische vaardigheid16,18,21,29,36,37. De levering van RPE is niet triviaal en het veld is verdeeld over de meest effectieve injectietechniek. Het protocol dat we hier beschrijven is een eenvoudige en effectieve manier om een bolus van RPE-cellen subretinaal af te leveren en werd gebruikt in het eerste klinische onderzoek voor stamcel-afgeleide RPE-transplantatie31. (De lezer kan ook verwijzen naar een ander JoVE-artikel door Eberle et al. voor een alternatieve weergave van subretinale injecties bij knaagdieren.38) 
De techniek die in dit manuscript wordt beschreven, kan niet worden gevisualiseerd en trauma is onvermijdelijk (zoals bij elke subretinale injectietechniek). Het wordt uitgevoerd door een gaatje te maken net onder de limbusvaten en een stompe naald langs een transsclerale route in te brengen om een bolus cellen onder de diametrisch tegenoverliggende retina te injecteren. De persoon die de injectie uitvoert zal weerstand voelen wanneer de stompe naald de retina raakt. De cellen kunnen echter direct na de injectie worden gevisualiseerd en de mate van de geïnduceerde retinale loslating kan worden bepaald door de RPE-cellen te labelen met een tijdelijke fluorescerende marker en ze te detecteren met een confocale scanrendoscoop (cSLO). Een optische coherentietomografie (OCT) systeem kan ook worden gebruikt om het trauma te bewaken en de injectieplaats gemakkelijk te identificeren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>50 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell Scapers</td><td>VWR</td><td>89260-222</td><td>Case x 1</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Molecular Probes</td><td>C34552</td><td>50 &micro;g x 20</td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>25 g x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops&nbsp;</td><td>Walmart</td><td>4060941</td><td>25 ml x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Spuit x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 0.5", punt 3 (304 roestvrij staal)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Naalden x 6</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Magnetische standaard</td><td>Leica Biosystems</td><td>39430216</td><td>Standaard x 1</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leica Biosystems</td><td>3943001</td><td>Manipulator x 1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Slip Tip Spuiten zonder naalden BD&nbsp; (3 ml)&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD309656</td><td>Verpakking x 1</td></tr><tr><td>Specialty-Use Naalden BD&nbsp; (30 G, 1")</td><td>VWR</td><td>BD305128</td><td>Doos x 1</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), geen fenol rood</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>100 ml x 1</td></tr></tbody></table>

presterende subretinal injecties in knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in suspension

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

De omzetting van licht in elektrische impulsen optreedt in de buitenste retina en is grotendeels bereikt door staafjes en kegeltjes fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE bieden kritische steun voor de fotoreceptoren en de dood of disfunctioneren van RPE cellen is kenmerkend voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de voornaamste oorzaak van permanent verlies van het gezichtsvermogen bij mensen van 55 jaar en ouder. Hoewel er geen remedie voor AMD is geïdentificeerd, kan implantatie van gezonde RPE in zieke ogen blijken een effectieve behandeling, en grote aantallen RPE cellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen. Verschillende interessante vragen over de veiligheid en werkzaamheid van RPE cellen levering kan nog worden onderzocht in diermodellen en goed aanvaarde protocollen gebruikt injecteren RPE ontwikkeld. De hier beschreven techniek is door meerdere groepen in diverse studies en omvat eerst een gat in het oog met een scherpe naald. Dan is een spuit met een blunt naald geladen met cellen wordt ingebracht door het gat en door het glasvocht, totdat deze net tegen de RPE. Met deze injectiemethode, die relatief eenvoudig en vereist minimale apparatuur, we consistente en efficiënte integratie van stamcellen afgeleide RPE cellen bereiken tussen de ontvangst RPE die aanzienlijke hoeveelheid fotoreceptor degeneratie voorkomt in dierlijke modellen. Hoewel geen onderdeel van de eigenlijke protocol, ook beschrijven hoe de omvang van het trauma veroorzaakt door de injectie en Controleren of de cellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte met in vivo beeldvormende modaliteiten. Tenslotte wordt het gebruik van dit protocol niet beperkt tot RPE cellen; kan worden gebruikt om een ​​verbinding of cel in de subretinale ruimte te injecteren.

We kunnen een opschorting van RPE cellen te leveren in de subretinale ruimte van knaagdieren snel en consistent gebruik van de in dit manuscript beschreven techniek. Terwijl het niet nodig is, kan trauma&#39;s sterk worden geminimaliseerd via het getoond met een micromanipulator in figuur 1A &amp; B-setup. Houd het knaagdier zoals getoond in figuur 1C tijdelijke proptosis. De stappen zijn hetzelfde als uitgevoerd met de micromanipulator of met de hand; deze worden afgebeeld in de cartoo...

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Het algemene doel van deze procedure is om retinale pigment-, epitheel- of RPE-cellen in de subretinale ruimte van knaagdieren te injecteren met minimale trauma. Dit wordt bereikt door eerst een scherpe naald te gebruiken om een gaatje in het oog van een sedate dier te prikken. Vervolgens worden de cellen met een stompe naald in de subretinale ruimte geïnjecteerd.In de laatste stap wordt het oog bedekt met vochtinbrengende crème om het gehydrateerd te houden. Uiteindelijk kunnen histologie en in vivo beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt om de effectiviteit van de injectie te controleren. Hoewel de methode die we u vandaag hebben laten zien speciaal is aangepast voor het leveren van RPE-cellen in de subretinale ruimte, is de techniek zelf breed toepasbaar voor het leveren van een verscheidenheid aan andere celtypen en chemicaliën in de subretinale ruimte voor gebruik in een verscheidenheid aan preklinische studies.Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het moeilijk is om te zien hoe goed de injectie is uitgevoerd. Visuele demonstraties van deze methode zijn cruciaal omdat de injectiestappen moeilijk te leren zijn zonder ze persoonlijk te

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Source: Park, S. W., et al. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)The video describes the method for subretinal injection of viral vectors into the retinal pigment epithelium (RPE) in a mouse model. It details the procedure from anesthesia and eye preparation to precise lentiviral vector delivery, ensuring gene integration and expression in the RPE.

Subretinal Injection of Viral Vectors into the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse Model

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space<i&gt; via</i&gt; Een Transcleral Posterior Approach

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

De subretinale implantatie van retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van degeneratieve retinale ziekten. De uitvoering van preklinische studies op diermodellen met grote ogen blijft echter een uitdaging. Dit rapport presenteert richtlijnen voor de subretinale transplantatie van RPE op een celdrager in minivarkens.

Subretinale implantatie van RPE op een drager in minivarkens: richtlijnen voor preoperatieve preparaten, chirurgische technieken en postoperatieve zorg

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Dit artikel beschrijft methoden voor subretinale injectie bij ratten, waarbij gebruik wordt gemaakt van intraoperatieve visualisatie om zowel de injectieplaats als het gebied van netvliesloslating te controleren.

Intraoperatieve visualisatie van subretinale injectie en netvliesloslating bij ratten

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer subretinale injecties van RPE-cellen in knaagdieren met minimale trauma. Deze methode gebruikt scherpe en stompe naalden voor effectieve celafgifte en kan worden toegepast op preklinische retinale degeneratiestudies.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Meer video's verkennen