Nabij Infrarood (NIR) Licht Verhoogt Expressie van een marker van de mitochondriale functie in de Muis Vestibular Sensory epitheel

Het algemene doel van het volgende experiment is om het mogelijke neuroprotectieve effect van nabij infrarood licht op het muis vestibulaire sensorische epitheel te onderzoeken. Dit wordt bereikt door een eenvoudige, korte transcraniële toepassing van nabij infrarood licht op de muizen in verschillende ontwikkelingsstadia. Als tweede stap worden de botten van de binnenooren van de behandelde dieren gedisseceerd, waardoor het vestibulaire sensorische epitheel geïsoleerd kan worden.

Vervolgens wordt de expressie van het antioxidantgen van belang gemeten door R-T-P-C-R om de impact van de behandeling op de mitochondriale prestaties te beoordelen. Ten slotte wordt densitometrie uitgevoerd om het effect van een korte behandeling met nabij infrarood licht op de expressie van specifieke antioxidantgenen bij muizen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze nabij infrarood behandelingstechniek is dat het eenvoudig en niet-invasief is, waardoor verdere downstream fysiologische, moleculaire en gedragsanalyse na de behandeling mogelijk is.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de mogelijke neuroprotectie van het perifere vestibulaire systeem tijdens normale veroudering, of naar de verbetering van de balansprestaties na vestibulaire ziekte of tekort. Twee tot drie dagen voor het begin van het experiment, scheer het haar op het hoofd en de nek van elke muis zo dicht mogelijk om te voorkomen dat het haar van het dier weer groeit voordat het behandelingsregime is voltooid. Om de ziektevrije status van de dieren te behouden, reinig de instrumenten met 70% ethanol tussen elke scheerbeurt.

Vervolgens op de dag van de behandeling voor elke dier-intern, pak de muis bij de proximale punt van de staart en laat hem ontspannen in de palm van één hand om stress voor de met nabij infrarood behandelde dieren tot een minimum te beperken. Voor elk dier, houd een 670 nanometer LED-apparaat, één tot twee centimeter van het geschoren gebied verwijderd en zet het apparaat aan gedurende 90 seconden. Voor de sham-groep, herhaal de behandelingsprocedure op dezelfde manier, maar met het apparaat uitgeschakeld voor de nabij infrarood geblokkeerde groep, behandel de dieren op dezelfde manier als de met nabij infrarood behandelde groep, maar met het apparaat bedekt met aluminiumfolie.

Nadat de behandelingen voor elke groep zijn herhaald met intervallen van 24 uur gedurende vijf opeenvolgende dagen, vries vers bereide, glycerol-gebaseerde kunstmatige hersenvochtvloeistof, of A CSF, in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende 45 minuten totdat er een ijsslurry ontstaat. Gebruik vervolgens voor elke muis een afgerond nummer 22 scheermes om een incisie te maken langs de sagittale huid van de schedel, houd de schedelholte hersenen en onderliggende vestibulaire apparaat zo koel mogelijk met regelmatige toepassingen van ijskou A CSF over het weefsel. Gebruik vervolgens de puntige arm van een paar standaard patroon schaar om een kleine incisie in de schedel te maken bij Lambda en snijd langs de sagittale naad.

Schuif vervolgens voorzichtig één arm van een ondiepe URS onder het pariëtale bot, en zet vervolgens het pariëtale bot lateraal en het occipitale bot posterior vast en trek totdat de hersenen zijn blootgelegd. Gebruik vervolgens een kleine roestvrijstalen spatel om de hersenen weg te tillen van de voorste en middelste schedelholte. Om de vestibulaire cochleaire zenuw bloot te leggen, snijdt u de zenuw door om onnodige spanning op de primaire afferente axonen die de vestibulaire haarcellen rechtstreeks innerveren, te voorkomen.

Verwijder vervolgens de hersenen in toto en observeer het bottenlabyrint dat de cochlea en de perifere vestibulaire organen in de middelste schedelholte bevat. Maak nu twee kleine incisies naast elk bottenlabyrint en houd en trek het voorste halfronde kanaal lateraal om de hele structuur te verwijderen. Dompel vervolgens het verwijderde labyrint onmiddellijk in een dissectieschaal met de ijskou A CSF-oplossing terwijl het continu wordt geperfundeerd met carbogen.

Het lastigste deel van deze procedure is het verkrijgen van consistente hoeveelheden levensvatbaar weefsel voor elk dier. We raden aan zorgvuldige observatie en specifieke verlichting van het weefsel te oefenen. Vervolgens, onder een stereomicroscoop, houdt u het labyrint vast door de cochlea en gebruikt u een pincet om het weefsel aan de bodem van de schaal vast te zetten met behulp van rechte fijne pincetten. Kras een kleine opening in het bot boven de voorste semi-cirkelvormige kanaal ula.

Rijk vervolgens onmiddellijk onder het bot en veeg naar buiten weg van de ULA om de opening voorzichtig te vergroten. Ga door op deze manier totdat het utriculus en het voorste en laterale pule allemaal blootgelegd zijn. Gebruik vervolgens een fijn pincet om de utriculus en pule voorzichtig weg te tillen van het bottenlabyrint totdat ze volledig loskomen.

Ten slotte grijpt u de vestibulaire organen stevig vast tussen de punt van het pincet en plaatst u ze in vers bereide lysisbuffer in een microbuis met schroefdop, zwaai voorzichtig met het pincet in de buffer om de vestibulaire organen los te maken. Nadat u onder de stereomicroscoop hebt bevestigd dat het pincet vrij is van weefsel, schroeven u de microbuisdop vast en vriest u het monster onmiddellijk in vloeibare stikstof in om de impact van nabij infrarood behandeling tussen jonge en oudere muizen te vergelijken.

Boodschapper, RNA werd omgekeerd getranscribeerd in complementair DNA, vervolgens werd de expressie van antioxidant superoxide dismutase een of SOD een geanalyseerd, zoals gemeten door densitometrie, een significante toename in beta actin genormaliseerde sod een expressie van meer dan tweevoudig bij jonge, met nabij infrarood behandelde dieren in vergelijking met jonge sham-behandelde dieren en jonge nabij infrarood geblokkeerde dieren werd waargenomen. Oudere nabij infrarood behandelde dieren vertoonden ook een meer dan tweevoudige opregulatie van sod een in vergelijking met oudere nabij infrarood geblokkeerde dieren. Na deze procedure kunnen gedrags-, moleculaire of fysiologische experimenten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of nabij infrarood licht de expressie van andere genen of eiwitt