Name: Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer immunohistochemie voor het visualiseren van microglia en neuronen in rattenhersenweefsel. Dit protocol toont dubbele kleuring met fluorescentie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de heer Ryan Hart en de heer Arriz Lucas bedanken voor hun onschatbare feedback op deze mededeling. Dit werk werd ondersteund door NIH NINDS R01 NS065052 en Phoenix Children’s Hospital Mission Support Funds.

LET OP: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Arizona uitgevoerd. Een lijst met aanbevolen materialen en apparatuur zijn te vinden in tabel 1. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Perfusie <ol><li> Euthanaseren knaagdier met een overdosis van natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP) en perfuseren transcardially met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot volledig bloed ontdaan (3-5 min) bij een stroomsnelheid van 8 ml / min. Voor diepgaande perfusie instructies, zie Gage et al 2012 9. </li><li> Onmiddellijk na PBS flush, vast weefsel door perfuseren met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15-20 min bij een stroomsnelheid van 8 ml / min. </li><li> Verwijder hersenen en plaats in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, gevolgd door gegradeerde sucrose-oplossingen (15%, 30%, 30%, in volgorde, bereid in Tris gebufferde zoutoplossing) bij 4 ° C. Breng de hersenen naar de volgende sucroseoplossing olleen nadat het brein is gezonken in elke oplossing. Opmerking: Meestal, 5 dagen in elke oplossing is voldoende tijd voor tissue te zinken. </li></ol></li><li> Tissue Invriezen en cryosectioning <ol><li> Plaats de hersenen in inbeddingsmedium, zoals oktober verbinding en onder in isopentaan bij een temperatuur van -35 ° C. Laat de hersenen te bevriezen gedurende minimaal 10 minuten en bewaar bij -80 ° C. Problemen kunnen ontstaan ​​als ijver om de temperatuur niet wordt genomen; zie bespreking voor informatie over probleemoplossing. </li><li> Knip seriële coronale secties met een dikte van 20 urn en een temperatuur van -20 ° C. Verzamel weefsel op positief geladen dia&#39;s. Brain secties kunnen in een dia doos verpakt in folie in een zip-top zak en opgeslagen op lange termijn bij -80 ° C worden geplaatst. Deze opslagmethode maakt een dubbele grens tot blootstelling aan lucht of bevriest. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Processing OPMERKING: Voorbeeld apparatuur en materialen rerplicht voor het kleuren worden weergegeven in figuur 3. Alternatieven zijn beschikbaar, echter, zullen deze beelden helpen die nieuw voor immunohistochemische kleuring om passende items visualiseren voorafgaand aan het kopen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figuur 3: Voorbeeld goederen voor immunohistochemische kleuring The black box is getoond in (A) is een ideaal vochtige kamer voor immunofluorescentie zoals slides worden beschermd tegen licht zonder dat de box wikkelen op folie.. Na snijden kan schuiven in een doos worden opgeslagen, zoals de gele vakje getoond in (B). Het verpakken van de doos stevig in folie en plaatsing in een zip-top zak voorafgaand aan de vriezer beschermt de weefselmonsters van vriesbrand. Een voorbeeld dia wordt in (C), met verschillende kleuring schotels weergegeven in (D) en (E </strong&gt;). Coverslips kunnen variëren in grootte en dikte (F), maar 1,2 dikke coverslips bieden leuke imaging resultaten op de meeste rechtop en confocale microscopen. Een potlood zoals getoond in (G) kan worden gebruikt om objectglaasjes te labelen. Permanente markers moet vermeden worden omdat de inkt kan draaien, die zowel kleuring en de mogelijkheid om te bepalen welke monster. Een mini pap pen zoals getoond in (H) maakt een afweermiddel grens ook op objectglaasjes. <ol><li> Slide voorbereiding <ol><li> Verwijder dia&#39;s uit vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. <ol><li> Optioneel: Indien delen eerder gedreven van objectglaasjes, objectglaasjes plaats ontdooid in een oven bij 60 ° C gedurende maximaal 4 uur om te voorkomen weefselsecties drijven af ​​glijdt. </li></ol></li><li> Plaats de glaasjes in een dia rack en de bijbehorende schotel. </li><li> Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten. Vanaf deze stap voorwaarts, voorkomen dat sections zonder vloeistof voor langere tijd. Opmerking: Indien delen uitdrogen, wordt achtergrond kleuring verhoogd en betekenisvolle data betrouwbaar kan niet worden verkregen. </li></ol></li><li> Weefselkleuring <ol><li> In een lichtdichte vlekken doos, een &quot;vochtige kamer&quot; met een niet-pluizende weefsels doordrenkt met gedemineraliseerd water. </li><li> Droog de randen van de dia met een niet-pluizende tissue, gebruik maken van een mini pap pen om een ​​vloeistof afstotend grens te maken aan de rand van de dia, weg van weefsel secties. Deze grens moet zorgen voldoende ruimte tussen de meniscus van de vloeistof en de rand van het weefsel, zodat oppervlaktespanning heeft geen invloed op kleuring. OPMERKING: De pap pen afweermiddel grens kan worden toegepast voorafgaand aan 2.1.3 als de antilichamen van belang niet magnetron antigen herstel vereisen. Als de pap pen is voorafgaand toegepast op wassen in PBS, moet de integriteit van de vloeistof afstotende grens bij deze stap gecontroleerd. Gebruik een mini-pap pen in de openingen in de border te vullen. </li><li&gt; Met horizontaal gestelde slides, block-specifieke antigeen binding door incubatie in 4% v / v in PBS (blokkeeroplossing). Pipetteer 300 ul van blokkeeroplossing per slide 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Zorg ervoor dat het blok oplossing uitstrekt tot de pap pen aan de rand van de glijbaan en volledig bedekt weefsel ongelijkmatige kleuring veroorzaakt door oppervlaktespanning nabij het weefsel te vermijden. <ol><li> Met serum van dezelfde soort waarin secundaire antilichaam wordt gemaakt. Opmerking: In deze procedure worden de secundaire antilichamen in ezel, en dus donkey serum wordt gebruikt. Als secundaire antilichamen uit twee of meer verschillende soorten worden gebruikt, omvatten serum van elke soort. </li></ol></li><li> Pipette primaire antilichaam op dia&#39;s. Opmerking: Antilichaamconcentraties hiervoor kleuring werden geoptimaliseerd bij 1: 5000 en 1: 500 voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Deze concentraties zijn als zinvolle kleuring vertonen met een afwezigheid van achtergrondkleuring. <ol><li> Verdunnen blok oplossing voor1% serum in PBS en voeg primaire antilichamen. Pipetteer 300 ul van primair antilichaam oplossing in 1% serum per slide. Ook hier zorgen de vloeistof aan de rand van de pap pen. Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Omvatten drie controle dia&#39;s: één dat noch Iba1 noch Pan-neuronale antistoffen bevat, een met Iba1 zonder Pan-neuronale antilichaam, en één met Pan-neuronale antilichaam zonder Iba1. Vlekken op deze slides in dezelfde run met hetzelfde oplossingen evenwel laat de primaire antilichamen tegen het niet-specifieke binding van de secundaire antilichamen te testen. </li></ol></li><li> De volgende ochtend was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten. </li><li> TL-antilichamen zijn lichtgevoelig, dus uit deze stap voorwaarts, het minimaliseren van de blootstelling aan licht door te zorgen voor wassen containers zijn verpakt in folie en hybridisatie dozen zijn zwart of in het donker geïncubeerd. Pipet de juiste secundaire antilichamen op alle dia&#39;s en incubeer60 min bij kamertemperatuur bij een concentratie van 1: 250 in blokkeeroplossing (zie stap 2.2.3) in een lichtdichte &quot;vochtkamer&quot; (zie stap 2.2.1). <ol><li> Gebruik secundaire antilichamen van verschillende golflengten. Hier, voor het primaire antilichaam konijn anti-Iba1 Gebruik ezel anti- konijn 594 als het geschikte secundaire antilichaam. Voor het primaire antilichaam muizen anti-Pan-neuronale Gebruik ezel-anti-muizen-488 als het geschikte secundaire antilichaam. Anders, gebruik anti-konijnen 488 en anti-muis 594. </li></ol></li><li> Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Optioneel: het uitvoeren van nucleaire kleuring. <ol><li> Plaats Hoechst (of andere nucleaire kleuring) bij een concentratie van 0,03 ug / ml in dubbel gedestilleerd H 2 0 gedurende precies 60 sec. </li><li> Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk. </li></ol></li><li> Was in DDH 2 0. </li></ol></li><li> Afdekken <ol><li> Coverslip slides met een waterig fixeermiddel zoals Fluoromount-G of ProlongGold. Zorg ervoor dat alle bellen met behulp van een wattenstaafje verwijderen. Opmerking: Overige montage stoffen kunnen worden gebruikt, heeft echter een hoge doorbloeding tussen kleurstoffen is opgemerkt door enkele binnen enkele dagen van afdekken. </li><li> Gebruik heldere nagellak om de randen af ​​te dichten, waardoor de secties uitdroogt door verdamping. Laat nagellak te drogen in een lichtdichte container terwijl dia&#39;s plat en bij kamertemperatuur blijven en vervolgens opslaan in een lichtdichte container verpakt in folie bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Beeldvorming de Stained Tissue <ol><li> Microscopie <ol><li> Laat de nagellak te drogen voor ten minste een uur voor aanvang van de microscopie, die moet plaatsvinden in een verduisterde kamer. </li><li> Verwerven microfoto met behulp van een confocale microscoop of onderzoek met een fluorescerende lichtbron en een digitale camera bevestiging. Met behulp van de bijbehorende software, stellen de belichting voor elke golflengte - 405, 488, en 594 - afzonderlijk. Let op: diepte-imaging instructies online beschikbaar via de microscoop fabrikant moet zijn. </li><li> Acquire microscoopfoto in elk kanaal zonder te bewegen de afdelingen of het aanpassen van de focus. Neem beelden in kleur, of afwisselend in grijstinten en converteren naar daarna te kleuren. Opmerking: Kleur of grijswaarden beelden van elk kanaal kan worden verzameld in post-processing. </li><li> Controleer of weefselcoupes worden niet blootgesteld aan omgevingslicht of microscopische licht voor langere tijd, als foto-bleking van de secties optreedt. Om dit te voorkomen, verhogen de blootstelling tijd in plaats van het verhogen van het licht / laser intensiteit. </li><li> Laat de fluorescerende lichtbron niet binnen 30 minuten worden ingeschakeld uit te schakelen. Opmerking: Het schakelen van de bron aan en uit in snelle opeenvolging kan de levensduur van de tl-lamp te verlagen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De algemene doelstelling van deze mededeling was immunohistochemie procedures voeren om de lezer. Hiervoor heeft het voorbeeld van de dubbele labeling met Iba1 en pan-neuronale antigenen microglia en neuronen in paraformaldehyde geperfundeerde observeren, werd sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen gebruikt. Deze techniek kan worden aangepast om eindeloze doeleinden. Een array van verschillende antigenen in verschillende weefseltypen zoals, maar niet beperkt tot de hersenen, lon...

<html> Immunohistochemie is een werkwijze voor het detecteren van antigenen (bijvoorbeeld eiwitten) in weefselsecties met primaire antilichamen die specifiek binden aan de antigenen van interesse. Immunohistochemie werd ontwikkeld door JR Marrack in 1934, toen hij bepaald dat antilichamen antigenen met grote specificiteit 1 kon lokaliseren. Beginnend in 1942, enkele eerste in vitro studies met fluorescerende antilichamen tegen immunohistochemie visualiseren gepubliceerd 2,3, waarna de eerste in vivo histochemische studie werd gepubliceerd 4. Gedurende de 1960&#39;s, dertig jaar na de start van immunohistochemische werkwijzen, begon enzym-geconjugeerde antilichamen voor gebruik als secundaire reagentia. Deze methoden werden gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar ontwikkeld in Frankrijk en de VS 5,6. Vandaag de dag, een breed scala van antilichamen biedt eindeloze mogelijkheden voor immunohistochemie studies 7. &quot;&gt; De algemene doelstelling van deze correspondentie is om een ​​korte introductie in immunohistochemische kleuring zorgen, het is niet bedoeld om een ​​uitgebreid en uitputtend overzicht van deze techniek in de geschetste methode worden immunohistochemische technieken voor twee antigenen gepresenteerd (markers voor microglia en. neuronen) voor kleuring paraformaldehyd geperfundeerde, sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen. Immunohistochemische kleuring begint blokkeermiddelen-specifieke antigeenbinding aan achtergrondkleuring te verminderen. Vervolgens incubatie met primair antilichaam zorgt voor binding aan een specifiek antigeen in het weefsel. Na het primaire antilichaam, een ander antilichaam, genaamd secundaire antilichaam wordt aan het primaire antilichaam te koppelen aan een geconjugeerd visualisatie signaal 8. Het tweede antilichaam is gericht op de immunoglobuline G (IgG) domein specifiek voor de diersoorten waarin de eerste antistof opgewekt werd. Het tweede antilichaam versterkt het signaal van het primaire antilichaam, aangezien de Fab-regio van tHij secundair antilichaam binden aan meerdere plaatsen op het IgG gebied van het primaire antilichaam. Enzymen of fluorescente moleculen geconjugeerd met de Fc-regio van het secundaire antilichaam mogelijk visualisatie. Bijvoorbeeld, een konijn anti-Iba1 primair antilichaam een ​​konijn IgG-molecuul specifiek voor Iba1. Wanneer ezel anti-konijn IgG gebruikt als een secundair antilichaam, zal herkennen en binden aan meerdere gebieden van het konijn anti-Iba1 IgG (zie figuur 1). De ezel antilichaam kan worden gevisualiseerd door verschillende werkwijzen. Deze overeenstemming is gericht op de detectie van een fluorofoor geconjugeerd aan het tweede antilichaam, waarbij het primaire antilichaam herkent, voor visualisatie door fluorescentiemicroscopie. In fluorescerende immunohistochemie kan een nucleaire kleuring zoals Hoechst en DAPI worden gebruikt om alle kernen te visualiseren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figuur 1: SchEmatic representatie direct- en indirect antilichaam labeling technieken. Antilichamen binden aan het antigeen van belang en kan worden geamplificeerd door secundaire antilichamen opgewekt tegen de species van het primaire antilichamen. Deze techniek kan worden uitgevoerd met avidine-biotine complex (ABC) voor amplificatie en DAB visualisatie (A), of direct fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (B). Als alternatief kunnen primaire antilichamen direct worden geconjugeerd met veel verschillende labels, waaronder biotine of een fluorofoor (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Een alternatieve werkwijze voor het zichtbaar maken van immunohistochemische kleuring gebruikt 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; zie figuren 1 en 2). Dit verschilt van fluorescentie met behulp van een gebiotinyleerd ofhorse-radish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam, dat een enzym DAB zetten naar een precipitaat dat zichtbaar is onder helderveld microscopie levert. In gevallen waarin een enkele antigeen is van belang of kleuring is verplicht langdurig te zijn, kan DAB beter geschikt zijn dan fluorescerende vlekken zijn. Echter, DAB-kleuring is niet goed geschikt voor differentiatie tussen meerdere markers, met name als twee nucleaire antigenen van belang. Voor informatie over DAB materialen en protocol modificaties raadplegen Tabel 1. Anders, nitro blauw tetrazolium chloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) kan worden gebruikt om een alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd secundair visualiseren antilichaam. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van nikkel verbeterde DAB single-gelabeld rat hersenweefsel secties Rat hersenen seCTIES die zijn gelabeld met nikkel verbeterde DAB voor Iba1 (A) en Pan-neuronale (B) zorgen voor langdurige analyse van microglia of neuronen alleen. Schaalbalk 20 urn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Men moet rekening houden met de geraamde omvang van het antigeen van belang in het weefsel dat wordt onderzocht. Indirecte werkwijzen (zoals hierboven beschreven) zijn nuttig voor doelen met lage abundantie. Wanneer het antigeen van interesse is in hoge overvloed, kan directe methoden worden toegepast. Direct werkwijzen omvatten een primair antilichaam dat rechtstreeks is geconjugeerd aan een visualisatie signaal en dus geen secundair antilichaam nodig. Deze werkwijze vereenvoudigt het kleurproces, maar elimineert de versterking bereikt met indirecte methoden. Met behulp van een direct geconjugeerd primair antilichaam elimineert ook cross-reactiviteit van secundaire antilichamenals dubbel-labeling. Deze mededeling beschrijft de protocol voor double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale (details in tabel 1). Iba1 vlekken microglia in veel activering staten, waaronder vertakte, hyper-vertakte, geactiveerde, amoeboid en staaf. Pan-neuronale vlekken neuronale axonen, dendrieten, en soma. Aangezien Iba1 vlekken meest microglia en Pan-neuronale targets het neuron, deze combinatie van vlekken is nuttig bij het verkrijgen van een breed begrip van microglia-neuron interacties. Kortom, immunohistochemische kleuring voert de zorgvuldige selectie van antilichamen. Aangezien de vraagstelling wordt specifieker kunnen antilichamen opgewekt alternatieve antigenen wensen. Om een ​​specifieke microgliale activeringstoestand richten, kan men kiezen om CD45 of CD68 antilichamen, in plaats van Iba1. Verder, in samenwerking met muizen, F4 / 80 kan de benodigde resultaten. Op dezelfde manier kan neuronale elementen specifiek worden gericht met antilichamen raseerde tegen de kern, synaps (pre- of post-), ​​axon, en de groei kegel. Daarnaast zijn er andere merkers die de leeftijd van het neuron (Double-Cortin, NeuN) differentiëren en neuronale regeneratie (GAP-43).

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Gebazigd voor weefselmontage (1.2.2)</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Gebazigd voor weefseldrogen (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Gebazigd in stap 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Gebazigd voor alle wasbeurten tijdens het kleuren (2.2), evenals de Hoechst-stap (2.2.8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Gebazigd voor het drogen van dia's (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Gebazigd voor blokkerings- en kleuringsstappen (2.2)</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Gebazigd voor blokkering en antilichaamincubatie (2.2)</td></tr><tr><td>Mouse &alpha;-Pan-neuronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Gebazigd voor primaire antilichaam (2.2.4)</td></tr><tr><td>Rabbit &alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Gebazigd voor primaire antilichaam (2.2.4)</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-rabbit 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Gebazigd voor secundair antilichaam (2.2.6)</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-mouse 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Gebazigd voor secundair antilichaam (2.2.6)</td></tr><tr><td>Caterer's foil</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Gebazigd in stappen 1.2.2 en 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Gebazigd voor coverslips (2.2.8)</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Gebazigd voor coverslips (2.2.8)</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish&nbsp;</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Gebazigd voor coverslips (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Gebazigd voor beeldvorming (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Gebazigd voor beeldvorming (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &alpha;-rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &alpha;-mouse IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>Wheaton slide racks and staining dishes</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>Voor DAB-protocol</td></tr><tr><td>Masterflex perfusion pump and tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Gebazigd voor perfusie (1.1.1 en 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Gebazigd voor weefselvries (1.2.1)</td></tr><tr><td>Thermometer (-50 tot 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Gebazigd voor weefselvries (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Gebazigd voor weefseldoorsnijden (1.2.2)</td></tr><tr><td>Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>Voor antigeenretrieval</td></tr><tr><td>20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>Voor antigeenretrieval</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Voor antigeenretrieval</td></tr></tbody></table>

primer voor immunohistochemie op cryosectioned rat brain tissue: voorbeeld kleuring voor microglia en neuronen

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om de aanwezigheid, locatie en relatieve overvloed van antigenen in situ. Deze inleidende niveau protocol beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn voor immunohistochemische kleuring van knaagdieren hersenweefsel te voltooien, met behulp van markers voor microglia en neuronale elementen als een voorbeeld. Concreet dit document is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie visualisatie van microglia en neuronen via immunohistochemie voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Fluorescentie double-labeling is bijzonder bruikbaar voor de lokalisatie van meerdere eiwitten in hetzelfde monster, de mogelijkheid ontstaat om interacties tussen celsoorten, receptoren, liganden nauwkeurig observeren, en / of de extracellulaire matrix ten opzichte van elkaar en proteïne co- lokalisatie binnen een enkele cel. In tegenstelling tot andere visualisatietechnieken, kan fluorescentie immunohistochemie kleurintensiteit afnamede weken tot maanden na vlekken, tenzij passende voorzorgsmaatregelen worden genomen. Ondanks deze beperking in vele toepassingen fluorescentie double-labeling heeft de voorkeur boven alternatieven zoals 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) of alkalisch fosfatase (AP), zoals fluorescentie tijdsefficiënter en maakt een zeer nauwkeurige onderscheiden van twee of meer markers. De discussie omvat tips voor probleemoplossing en advies om het succes te bevorderen.

Dit kleuringsprotocol resultaten in ratten hersenweefsel secties die microglia fluorescent zijn gelabeld in de 594-kanaal (rood) en neuronen geëtiketteerd in de 488-kanaal (groen; zie figuur 4). Als een nucleaire vlek werd geschreven, zal laten zien in het kanaal 405 (blauw). Afbeeldingen kunnen worden genomen in verschillende kanalen en bedekt voor directe vergelijking van de drie kanalen, of tussen twee kanalen. Veel digitale acquisitie software suites zijn voorzien van deze functionaliteit. Double-la...

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het gebruik van immunohistochemie om eiwitten van belang te visualiseren. In dit voorbeeld IBA1 voor microglia en pan neuronal voor neuronen. Dit wordt bereikt door eerst geprepareerde coupes in een blokkeringsoplossing te plaatsen om aspecifieke binding te voorkomen.Als tweede stap worden antilichamen, die de twee verschillende eiwitten van belang herkennen, gedurende de nacht op de coupes aangebracht. Vervolgens worden de coupes gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen om fluorescente labels aan de primaire antilichamen te koppelen. De resultaten van de dubbele kleuring kunnen microgliakleuringen binnen velden van neuronen aanwijzen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek in het begin moeite hebben, omdat er zoveel variabelen zijn om aan te passen. Deze techniek zal vandaag worden gedemonstreerd door Hazel May, een bachelorstudent in ons laboratorium. Begin met het zorgvuldig fixeren en snijden van knaagdierhersenen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, en bewaar deze vervolgens zorgvuldig bij -80 °C tot ze nodig zijn.Wanneer u klaar bent om verder te gaan met het protocol, haalt u de coupes uit de vriezer en laat u deze ontdooien bij kamertemperatuur. Plaats de coupes na het ontdooien in een rek en was ze drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Laat de coupes vanaf dit punt niet uitdrogen.Droog de randen van de objectglazen en maak met een pap-pen een vloeistofafstotende rand rond de rand van het objectglas om een gelijkmatige bedekking van de vloeistof te garanderen en randeffecten te verminderen. Blok vervolgens de secties door 300 µL serum in PBS aan elk objectglas toe te voegen. Het serum moet afkomstig zijn van de soort waarin het secundaire antilichaam is opgewekt.In dit geval werd ezelserum gebruikt. Zorg ervoor dat de blokkeringsoplossing tot aan de rand van het objectglas reikt en het weefsel volledig bedekt. Om ongelijkmatige kleuring te voorkomen, worden de objectglazen in een bevochtigingskamer geplaatst om gedurende één uur bij kamertemperatuur te incuberen.Bereid tijdens de incubatie de primaire antilichamen voor door het IBA1-antilichaam 1:5.000 en het pan-neuronaal antilichaam 1:500 te verdunnen in een mengsel van 1% donkeyserum in PBS. Verwijder de blokkeersolution en voeg 300 µL van de antilichaamoplossing toe, die beide relevante antilichamen bevat. Bereid daarnaast drie controle-slides.Voeg 300 µL van de IVA, één verdunning alleen, toe aan één objectglas, 300 µL van de pan-neuronaal antilichaamverdunning alleen aan een tweede objectglas, en 300 µL van 1% donkeyserum in PBS aan een derde objectglas. Plaats alle objectglazen in een bevochtigingskamer en incubeer deze overnacht bij 4 °C. Was de objectglazen de volgende ochtend drie keer in PBS gedurende telkens vijf minuten.Bereid het mengsel van fluorescerende secundaire antilichamen voor door beide te verdunnen in een verhouding van 1:250 in 1% donkieserum in PBS. Voeg 300 microliters van het mengsel toe aan elk objectglas en plaats de objectglazen gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in een lichtdichte bevochtigingskamer. Was de objectglazen vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in PBS en spoel ze tot slot af met dubbel gedestilleerd water.Bescherm de preparaten tegen licht tijdens het wassen. Voeg in PBS een paar druppels van een waterig montage medium dat helpt de intensiteit van het fluorescentiesignaal te behouden toe aan elk preparaat. Dek het preparaat vervolgens af met een dekglas en verwijder eventuele resterende luchtbellen met een wattenstaafje om het montage medium op de preparaten te verzegelen en te voorkomen dat de coupes uitdrogen.Coat de randen met nagellak. De objectglazen worden een uur plat gelaten om te drogen in een tegen licht beschermde doos, voordat ze worden bewaard in een lichtdichte container, gewikkeld in folie bij vier graden centigrade. Zodra de nagellak is gedroogd, worden de objectglazen naar de microscopieruimte gebracht voor beeldvorming.Bereid de ruimte voor door de plafondverlichting uit te schakelen en alle andere externe lichtbronnen af te schermen. Zet de microscoop, de fluorescentielichtbron en de computer voor beeldvorming aan. Plaats vervolgens een objectglas op de objecttafel van de microscoop en stel het scherp.Stel met de bijbehorende software de belichting voor elke golflengte afzonderlijk in. Voorkom dat het preparaat lange tijd aan licht wordt blootgesteld om fotobleken van het monster te voorkomen. Neem vervolgens beelden op in elk kanaal zonder het coupesje te verplaatsen of de focus aan te passen.Combineer de beelden met behulp van de imagingsoftware en sla ze op voor latere beeldanalyse. Met het zojuist beschreven kleuringsprotocol kunnen fluorescentiebeelden zoals hier getoond eenvoudig worden verkregen; in het rode kanaal zijn IBA one-positieve microglia duidelijk zichtbaar, en in het groene kanaal steken pan-neuronaal-positieve neuronen af tegen de achtergrond. De controlebeelden voor beide van deze antilichaamkleuringen worden getoond.Donkere dubbele labeling met IBA1 en een pan-neuronale marker, hier getoond, laat voornamelijk geramificeerde microglia zien met lange, fijne neuronale projecties die zichtbaar zijn over de corticale lagen. Kleuringsresultaten zoals hier getoond zijn ook mogelijk wanneer de weefselkwaliteit slecht is. Een slechte weefselkwaliteit wordt gekenmerkt door het ontbreken van duidelijk gedefinieerde cellichamen en gefragmenteerde microgliale en neuronale uitlopers.Er is een gebrek aan duidelijkheid bij de microgliakleuring en een volledige afwezigheid van neuronale kleuring, waardoor de overlappende afbeelding bij het toepassen van deze techniek niet betekenisvol is. Het is belangrijk om de coupes gelijkmatig te bedekken en te onthouden dat ze tussen de stappen niet mogen uitdrogen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in inleidende immunohistochemische technieken.

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of visualizing a biocytin-filled interneuron in a rat hippocampal section, highlighting its neurochemical identity through the use of specific antibodies and fluorescence microscopy.

Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section

This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a step-by-step immunohistochemistry staining procedure on cryosectioned rat brain tissue to visualize the spatial arrangement of microglia and neurons.

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons

Wij presenteren hier een geoptimaliseerd, gedetailleerd protocol voor dubbele immunokleuring in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere lymfeklieren (LK) van ratten.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Hier presenteren we een hydrofobe weefselontruimingsmethode die het mogelijk maakt om doelmoleculen te bekijken als onderdeel van intacte hersenstructuren. Deze techniek is nu gevalideerd voor F344/N-bestrijding en HIV-1 transgene ratten van beide geslachten.

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

In vivo modellen van ratten zijn onmisbare hulpmiddelen om de pathologische mechanismen en therapeutische doelen voor ischemische beroerte te onderzoeken. Dit werk beschrijft het uitvoeren van immunofluorescentiekleuring in hersenplakjes met een infarct na occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) bij ratten.

Evaluatie van celdoodsignalering door immunofluorescentie in een rattenmodel van ischemische beroerte

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Leer immunohistochemie voor het visualiseren van microglia en neuronen in rattenhersenweefsel. Dit protocol toont dubbele kleuring met fluorescentie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Meer video's verkennen