WERKWIJZE Geïsoleerde Ex Vivo Longperfusie in een Rat Model: Lessen uit het ontwikkelen van een Rat EVLP Program
25 februari 2015
Ex-Vivo longperfusie (EVLP) heeft toegestaan longtransplantatie bij de mens om meer direct beschikbaar doordat de mogelijkheid om organen te beoordelen en uit te breiden het donorpool geworden. We beschrijven hier de ontwikkeling van een rat EVLP programma en verfijningen die zorgen voor een reproduceerbaar model voor toekomstige uitbreiding.
Het algemene doel van deze procedure is om een consistent rattenmodel voor ex vivo longperfusie op te zetten dat reproduceerbare resultaten oplevert. De eerste stap is het canuleren van de luchtpijp en het beginnen met mechanische ventilatie. Vervolgens worden de longslagader en het linker atrium canuleerd.
De laatste stap is het verwijderen van de hart-longblok uit de borstholte en het plaatsen ervan in de ex vivo longperfusiekringloop. Uiteindelijk worden druksensoren, gewichtstransducers en een bloedgasanalysator gebruikt om de toestand van de long in real time te tonen door de pulmonale arteriële druk en andere parameters te meten. Ex vivo longperfusie is een opmerkelijke technologie die ons in staat heeft gesteld de donorpool voor longtransplantatie uit te breiden.
We anticiperen dat door deze technologie als platform voor orgaanevaluatie te gebruiken, we de kwaliteit van organen die voor transplantatie worden aangeboden en de algehele transplantatieresultaten kunnen verbeteren. Hier in het Copper-laboratorium hebben we de uitdrukking 'het orgaan bewapenen' bedacht, dus het beoordelen, remodelleren of repareren, en vervolgens het orgaan aanpassen om de kwaliteit te verbeteren en dus de transplantatieresultaten te verbeteren. We hebben een robuust en reproduceerbaar klein dierlijk rattenmodel van ex vivo longperfusie ontwikkeld.
Door deze video zullen we de belangrijkste en cruciale stappen voor u demonstreren om dit ex vivo longperfusiemodel te ontwikkelen, dat vervolgens kan dienen als platform voor perfusie en transplantaatonderzoek. Begin met het opzetten van de EVLP-kringloop en het circuleren van warm perfuse acht in het hele systeem. Stel het warme waterbad, de warmtewisselaar en de kunstmatige thorax in op 37 graden Celsius.
Laat een deoxygenatiegas door de PERFUSE acht in het gasfilter lopen om ervoor te zorgen dat het ongeveer 6% opgelost zuurstof bevat voor het experiment. Nadat u het data-acquisitieprogramma hebt geopend, verbindt u de longslagaderdruktransducer, tracheale, differentiële druktransducer, respiratoire stroom, differentiële druktransducer, longgewichtstransducer en pompsnelheidstransducer met de analoog-naar-digitaal converterbox. Stel ten slotte de operatietafel in en bereid alle benodigde operatiegereedschappen en benodigdheden voor de procedure voor.
Na het verifiëren van de sedatie door teenprik, plaatst u het verdoofde dier in de rugligging op de operatietafel. Begin met het opnemen van gegevens met behulp van het data-acquisitieprogramma. Wanneer u klaar bent, gaat u de buikholte binnen en injecteert u heparine in de vena cava inferior.
Volgens standaardprocedures canuleer u de luchtpijp en sluit u de canule aan op een ventilatiecircuit. Schakel de mechanische ventilator in om de longen mechanisch te ventileren. Trek vervolgens de borstholte terug om de longen bloot te leggen, zorg ervoor dat u ze niet aanraakt.
Verwijder de thymus en verschuift de inhoud van de buik naar één kant om of de vena cava inferior of de mesenteriale ader bloot te leggen. Na euthanasie plaatst u een zijden naad achter de longslagader en aorta. Ter voorbereiding op het bevestigen van de longslagadercanule, maakt u een snede van twee tot drie millimeter op het vooroppervlak van de uitstromingssloot van de rechter ventrikel en brengt u de canule in de hoofdpulumonale ader in.
Bevestig met zijden naad, verwijder stolsels uit de longvaten door ongeveer 15 milliliter van een lage kalium positieve elektrolytoplossing door de longslagader en uit door de top van het hart te perfunderen. Positioneer vervolgens een zijden naad achter het hart en rond de ventrikels. Om de mitralisklep te verwijden en canuleerbaarheid te vergemakkelijken, steekt u een klein paar chirurgische forceps in de top door de mitralisklep en in het linker atrium.
Wanneer u klaar bent, steekt u een canule in de top door de mitralisklep en in het linker atrium. Bevestig de linker atriumcanule met de zijden naad. Verbind vervolgens de longslagadercanule met de EVLP-kringloop.
Zorg ervoor dat de instroomlijn die uit de kringloop komt, is voorgevuld met perfuse acht. Om te voorkomen dat lucht in het hart en de longen komt, zet u de hoofdperistaltiekpomp aan en stelt u deze in op een lage snelheid. Dit zal ervoor zorgen dat perfuse acht door de longslagader en uit de linker ventrikel in de borstholte stroomt.
Bewaak de druk van de longslagader om ervoor te zorgen dat deze niet piekt, wat wijst op een blokkering of slechte canuleerbaarheid. Wanneer u klaar bent, zet u de peristaltiekpomp uit. Verbind de longslagadercanule met de ex vivo longperfusiekringloop.
Verbind de linker atriumcanule niet met de kringloop totdat het hart-longblok uit het lichaam is verwijderd. Verwijder het hart-longblok door de slokdarm af te klemmen met een hemostaat en onder de klem door te snijden, zodat de slokdarm kan worden gebruikt om de cardiopulmonale structuren botweg op te tillen, het omringende weefsel te verwijderen en de afdalende aorta en hulpvaten door te snijden om het hart-longblok vrij te maken terwijl het via de slokdarm wordt opgetild. Doorsnijd de luchtpijp om het hart-longblok vrij te maken en plaats het op de aangewezen locatie op de EVLP-kringloop.
Verbind vervolgens de linker atriumcanule met de uitstroomlijn en start de peristaltiekpomp. Om ventilatiegegevens te registreren en druk snel te bewaken, verwijdert u de ventilatielijn van de bovenkant van het EVLP-apparaat en bevestigt u de behuizing met de druksensoren. Plaats vervolgens de ventilatielijn weer op de bovenkant van het EVLP-apparaat.
Zorg ervoor dat de belenvanger voldoende is gevuld met perfuse acht. Om te voorkomen dat luchtbellen in de longen worden geïntroduceerd tijdens de eerste 15 minuten, verandert u langzaam de ventilatie- en perfusie-instellingen naar de gewenste experimentele niveaus. Verhoog de perfusiesnelheid naar de gewenste snelheid en druk tijdens deze eerste opstartfase ook.
Het wordt aanbevolen om de ventilator te programmeren om intermitterende zijademen te produceren om de beweging van vloeistof uit de longruimte te vergemakkelijken en het begin van oedeem te vertragen. Definieer tijd nul als het moment waarop de ventilatie
Overzicht
Dit artikel beschrijft de totstandkoming van een ex vivo longperfusie (EVLP) model bij ratten, gericht op het verbeteren van de resultaten van longtransplantaties. Het model maakt een real-time beoordeling van de conditie van de longen mogelijk, waardoor de pool van donoren wordt uitgebreid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Transplantatiebiologie
- Ex Vivo Longperfusie
- Orgaanconservering
Achtergrond
- Ex vivo longperfusietechnologie maakt een betere beoordeling van donorlongen mogelijk.
- Het heeft het potentieel om de transplantatieresultaten te verbeteren door de orgaan品質 te evalueren.
- De ontwikkeling van een reproduceerbaar diermodel is cruciaal voor de voortgang van het onderzoek.
- Het Copper-laboratorium streeft ernaar om technieken voor orgaanevaluatie te verfijnen.
Doel van de studie
- Om een consistent ratmodel te creëren voor ex vivo longperfusie.
- Om onderzoek naar longtransplantatie en de verbetering van orgaankwaliteit te faciliteren.
- Om de cruciale stappen bij het opzetten van het EVLP-model te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Cannulatie van de trachea, de arteria pulmonalis en het linker atrium.
- Gebruik van druksensoren en gegevensverwerving voor real-time monitoring.
- Opstelling voor warme perfusie en handhaving van fysiologische omstandigheden.
- Stapsgewijze uitvoering van chirurgische procedures voor longextractie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een rat-EVLP-model met reproduceerbare resultaten.
- Realtime monitoring van de longcondities tijdens de perfusie.
- Demonstratie van technieken om de orgaankwaliteit voor transplantatie te verbeteren.
- Potentieel voor verbeterde uitkomsten bij longtransplantaties door middel van dit model.
Conclusies
- Het ratten-EVLP-model is een waardevol instrument voor onderzoek naar longtransplantatie.
- Verfijningen in het model kunnen leiden tot een betere beoordeling en bewaring van donororganen.
- Deze studie draagt bij aan de voortdurende inspanningen om de slagingspercentages van transplantaties te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het opzetten van een reproduceerbaar ex vivo longperfusiemodel (EVLP) bij ratten biedt een preklinisch platform voor het evalueren van strategieën voor longbewaring en het beoordelen van de orgaankwaliteit voorafgaand aan transplantatie. Dit model ondersteunt mechanische risicoreductie van therapeutische interventies die gericht zijn op ventilatie-geïnduceerd longletsel en andere pathologieën die relevant zijn voor de optimalisatie van donorlongen. Door real-time monitoring van pulmonale parameters mogelijk te maken, vergroot het systeem het voorspellend vertrouwen in vroege discovery-workflows die gericht zijn op transplantatiebiologie en orgaanherstel.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot longletsel en herstelmechanismen te onderzoeken onder gecontroleerde perfusieomstandigheden.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door de beoordeling van moleculaire pathways in een intact orgaansysteem mogelijk te maken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het voorbereiden van gevalideerde biologische systemen om verbindingen te testen die gericht zijn op het verbeteren van de longkwaliteit.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door real-time meting van de pulmonale arteriële druk, het longgewicht en bloedgasparameters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert door ventilatie geïnduceerd longletsel (VILI) om pathofysiologische reacties te evalueren en potentiële verzachtende strategieën te testen.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door fysiologische omstandigheden tijdens de perfusie te handhaven.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het rat-EVLP-model integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothesetests in de vroege biologie te ondersteunen, assay-gereedheid voor compoundscreening mogelijk te maken en kwantitatieve output te leveren voor go/no-go-beslissingen in de preklinische ontwikkeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de betrokkenheid van signaalpaden bij longbeschadiging en herstelprocessen te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs, zoals longdruk en longgewicht, om experimentele condities te vergelijken.
- Analytics: Maakt real-time data-acquisitie mogelijk via druksensoren, gewichtstransducers en bloedgasanalyse om de longfunctie te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Borgt preklinische continuïteit door modellering van VILI, een klinisch relevante pathologie bij longtransplantaties.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratief testen van bewaringsoplossingen, beademingsstrategieën en farmacologische middelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door ambiguïteit in de longrespons op interventies te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde protocollen voor canulatie, perfusie en monitoring.
- Strategische waarde: Verbetert de risico-gecorrigeerde besluitvorming in onderzoek naar orgaanbewaring, waardoor falen in een laat stadium van transplantatieontwikkeling wordt verminderd.
- Portfolio-impact: Ondersteunt de prioritering van kandidaten op basis van functionele longuitkomsten in plaats van surrogaatmarkers.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microvasculaire canulatie en cardiopulmonale anatomie in knaagdiermodellen.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder peristaltische pompen, druktransducers, weegsensoren en bloedgasanalyzers.
- Vereist standaardisatie van perfusieparameters, ventilatorinstellingen en dataprotocollen tussen teams.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij vertaling van ratten naar grotere zoogdiermodellen of menselijke longbeoordeling.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de technische complexiteit van de extractie van het hart-longblok en het handhaven van steriliteit tijdens de perfusie.
