Do's en Don'ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Het doel van het volgende experiment is om macromoleculen in hun bevroren gehydrateerde toestand te kunnen beeldvormen met de transmissie-elektronenmicroscoop. Dit wordt bereikt door het raster met het monster op de cryogeen te laten vallen om een dun verglaasd specimen te verkrijgen. Als tweede stap wordt het monster blootgesteld aan de elektronenbundel, die een projectiebeeld van de macromoleculen zal vormen.

Vervolgens worden de beelden op de computer verwerkt om de 3D-reconstructie van het macromolecuul te verkrijgen. De resultaten tonen een zeer gedetailleerde 3D-structuur van het macromolecuul, zijn bevestiging en de 3D-locatie van zijn moleculaire partners. Er is een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden van monstervoorbereiding voor elektromicroscopie.

In cryo wordt het beeld direct gevormd door de elektronen binnen het macromolecuul. Dit weerspiegelt trouwer zijn bijna native structuur. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.

De voorbereiding van de cryo grid en de overdracht naar de elektronenmicroscoop zijn moeilijk te leren vanwege de extra complicatie bij het werken bij lage temperaturen. De opwarmcyclus wordt gebruikt aan het begin van de pompsequentie en na een cryo EM-sessie. Om deze procedure te starten, plaatst u de cryo-houder in een van de pomppoorten van de pompstation. Start de opwarmcyclus optie.

In de cold stage controller opent u de vlinderklep V twee en wanneer het vacuüm in de turbo pompstation stabiliseert en leest 10 tot min drie tor of beter opent u de vlinderklep V een. Zodra de temperatuur in de houder stabiel is boven kamertemperatuur en de opwarmcyclus is voltooid. Stop de cyclus door V een te sluiten.

Start vervolgens de ze licht cyclus optie en selecteer de benodigde tijd om een goed vacuüm te bereiken in het bereik van een tot twee keer 10 tot min vier tor. Wanneer het vacuüm 10 tot min drie tor bereikt opent u de DU ontluchtingsklep B drie en de klep op de cryo houder. Wanneer de cyclus voltooid is, sluit u de kleppen in de tegenovergestelde volgorde waarin ze werden geopend.

Gebruik een paar pincetten om een stuk MICA achter te laten om twee nieuwe oppervlakken bloot te leggen. Plaats de nieuwe blootgestelde mica oppervlakken met de kant omhoog op een wit stuk papier in een petrischaal. Na het plaatsen van de petrischaal in de be-pot van een koolstof verdamper, voert u de pompsequentie uit tot het vacuüm onder de 10 tot min zes tor ligt om de mica te coaten met een dunne laag koolstof.

Breng vervolgens het dunne koolstof over naar het raster. Dat is een 0,5 bij 1 centimeter stuk gecoate mica en laat het koolstof afdrijven op het platte oppervlak van gefilterd gedeïoniseerd water. Gebruik de pincetten om de heilige koolstofzijde van het raster in contact te brengen met het bovenoppervlak van de zwevende koolstoflaag en til het op.

Plaats het raster met de koolstofzijde omhoog op een 7,5 bij 2,5 centimeter glazen plaat bedekt met power film. Plaats vervolgens de glazen plaat in de kamer van de gloeiontladingsuitrusting en sluit de kamer. Pomp de klok en laat gloeien.

Ontlaad gedurende 20 seconden bij 25 milliampère en zeven keer 10 tot min twee millibar. Op dit punt zet u het dompelvriesapparaat aan. Trek de Ethan container naar beneden door de reservoir met vloeibare stikstof te vullen.

Zodra de vloeibare stikstof stopt met koken, plaatst u de punt van de buis die uit de Ethan tank komt in de binnenkamer en opent u de klep heel langzaam. Vervloei het ethaan in de binnenkamer en vul het tot één millimeter vanaf de bovenkant. Zet de vochtigheid aan.

Laad vervolgens een raster op pincetten en laad drie tot vijf microliters monster op het koolstofoppervlak van het heilige raster. Na te wachten tot het monster op het raster is geabsorbeerd, voert u blotting uit om een dunne vloeistofslaag blush te bereiken, bevriest u het raster door het in het vloeibare ethaan te dompelen. Verwijder voorzichtig de rasterpincetassemblage uit het vloeibare ethaan en breng het over naar de buitenste kamer met vloeibare stikstof.

Breng vervolgens het raster over naar een kleine rasterbox ondergedompeld in de vloeibare stikstof. Op dit punt plaatst u de cryo houder in de cryo overdrachtswerkplaats. Vul de dop van de cryo houder en de werkplaatsvat met vloeibare stikstof.

Breng snel de cryo rasterbox met het bevroren gehydrateerde raster over naar de vloeibare stikstof in de werkplaats. Nadat u de cryo rasterbox hebt geopend, neemt u het bevroren gehydrateerde raster en plaatst u het in de monstersleuf. Plaats vervolgens de clipring op het raster en drukt u deze voorzichtig vast met het stompe uiteinde van het clipringgereedschap en totdat deze stevig op zijn plaats zit.

Sluit vervolgens de cryo sluiter. Vul de TEM anti-contaminant op met vloeibare stikstof. Draai de microscoopstandaard om naar min 60 graden.

Begin vervolgens met de PrepU airlock cyclus op de microscoop. Zodra de pompairlocksequentie is voltooid, plaatst u de choir houder in de airlock en sluit u de controlekoord van de cold stage aan op de houder om de temperatuur te bewaken. Nadat het rode licht is gedoofd, draait u de houder naar de nulgraadspositie voor de inbrenging in de T EM'S hoge vacuümkolom.

Trek de cryo sluiter terug en open de kolomkleppen. Activeer het lage dosisprogramma in zoekmodus. Centreer de standaard en stel de centrische hoogte in door de standaard plus of min 15 graden te laten wiegen met de alpha wobbler, selecteer een geschikt gat en plaats het in het centrum van het veld met de XY standaardcontroller.

Schakel over naar focusmodus en focus het beeld. Onderfocus vervolgens het beeld tussen 0,5 en 4,5 micron. Schakel over naar de belichtingsmodus en neem het beeld op.

Keer ten slotte terug naar de zoekmodus om het volgende gat te selecteren en herhaal de sequentie. Microscopische beelden verkregen door de methoden van negatieve kleuring en cryo EM voor vier representatieve monsters met versch