Name: Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer isometrische contractiemetingen in gladde spieren uitvoeren met een geïsoleerd weefselbad. Deze methode met rat aorta helpt onderzoekers receptorfunctie en farmacologische responsen in vitro bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Watts-laboratorium door de jaren heen, en Dr. Marlene Cohen en Kathy Schenck voor het onderwijzen van deze test meer dan twee decennia geleden. NIGMS R25GM074119 ondersteunde de ontwikkeling van deze lesmodule voor een Korte Cursus in Integratieve en Systemen Farmacologie gehouden op de campus van MSU van 2005 tot 2013.

OPMERKING: Alle procedures beschreven in dit document worden uitgevoerd op basis van door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Michigan State University richtlijnen. 1. Systeem Voorbereiding en Setup <ol><li> Voeg 5 L van een fysiologische zoutoplossing (PSS), dat is de hoeveelheid die nodig is voor een weefselbad samentrekking experiment up gebruikt om 50 ml weefselbaden; zie tabel 2 voor PSS recept. Bereken de totale vereiste volume van het aantal weefselbaden keer te vermenigvuldigen badvolume en vervolgens vermenigvuldigen met het aantal gewenste weefsel wasbeurten. <ol><li> Gebruik tabel 2 als een gids voor het maken van PSS. Los het zout ongeveer 4 liter water. OPMERKING: HPLC - Type I water wordt aanbevolen </li><li> Voeg 8 ml 1 M CaCl2-oplossing (147 g / l bij gebruik van het dihydraat zout) aan de oplossing, zodat het einde oplossing 1,6 mM calcium. </li><li> Quantum sufficit PSS oplossing 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Verwarm het weefselbad systeem tot 37 ° C door te draaien aan het recirculerende verwarmde waterbad. Kritische stap: Elke component van het systeem watermantel, opdat zij die serieel met elkaar. De stromingsrichting is kritisch - waarborgen dat water stroomt in elke component aan scherpe weerhaken verbinding en op het hoogste weerhaken verbinding. </li><li> Schakel data-acquisitie systeem. Macht op de krachtopnemers ten minste 15 minuten voor het experiment om de temperatuur in evenwicht. OPMERKING: De meeste krachtopnemers in dienst rekstroken die gevoelig zijn voor schommelingen in temperatuur zijn en vertonen thermische drift aanvankelijk na de voeding wordt ingeschakeld. </li><li> Start data acquisitie software en zorgen kader gegevensverzamelsysteem. Volg de fabricage instructies voor het inschakelen van gegevensregistratie. </li><li> Zorg ervoor dat de krachtopnemers worden gekalibreerd voordat het weefsel wordt geplaatst in het weefsel bad en voordat de gegevens opname is gestart; follow instructies van de fabrikant voor kalibratie. </li><li> Sluit het weefsel bad systeem om een 95% O 2/5% CO 2 medische kwaliteit gasfles en gaslekken en vervolgens het systeem onder druk. </li><li> Vul het weefsel bad reservoirs met PSS en laat de oplossing tijd om de optimale temperatuur te bereiken. Prime het systeem en verwijder eventuele luchtbellen in het systeem en slangen. </li><li> Controleer weefsel bad beluchters om consistente oplossing beluchting, waarbij de PSS buffer van zuurstof en biedt Brownse beweging om geneesmiddelen die in het weefsel bad zal worden ingevoerd tijdens het experiment te verspreiden waarborgen. Zorg ervoor dat de beluchting / bellen veroorzaakt geen weefsel beweging, die data opnames zal verstoren; verlagen gasstroom nodig. OPMERKING: Het weefsel bad en data-acquisitie systeem zijn nu klaar om het experiment te starten. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding <ol><li> Idealiter ontleden weefsel van het dier onmiddellijk vóór gebruik en is rechtstreeks plaats into PSS. OPMERKING: Sommige weefsels kunnen worden opgeslagen in de PSS overnacht bij 4 ° C, maar passende controles moeten worden uitgevoerd om weefsel functie na langdurige opslag te valideren; zie hoofdstuk 6. </li><li> Gebruik de thoracale aorta als het weefsel in deze oefening. </li><li> Verdoven van de rat in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en plaats de rat dorsale zijde naar beneden. Bevestig verdoving via een teen-snuifje en het verlies van de reflex reactie op deze pijnlijke stimulus. Opmerking: In dit protocol wordt 70 mg / kg pentobarbital geleverd via een intraperitoneale injectie. Institutionele richtlijnen voor knaagdieren anesthesie kunnen verschillen. </li><li> Een pneumothorax Door een incisie met een schaar langs de membraan aan de onderkant van de ribbenkast. Vervolgens blijven de incisie van de onderkant van de ribbenkast naar het borstbeen en halveren. </li><li> Ontleden weg of plaats opzij die organen die op de top van de wervelkolom en zoek de aorta, die direct langs de wervelkolom ligt. OPMERKING: Deze sTEP zorgt voor een duidelijke werkruimte te ontleden uit de aorta. </li><li> Sever alle aansluitingen aan de aorta; van de slokdarm, long, etc. en snijd de aorta loodrecht op de ruggengraat ter hoogte van het membraan. </li><li> Zachtjes houd de aorta met een pincet en gebruik een schaar om de aorta ontleden van de wervelkolom. Start de dissectie in het onderste membraan gebied grenzend aan de wervelkolom en werken in de richting van het hart. Zorg ervoor dat u extra voorzorgsmaatregelen om niet trekken of sleepboot te nemen over de aorta weefsel, dat het weefsel kunnen beschadigen. </li><li> Plaats onmiddellijk de aorta in de voorbereide dissectie schotel met PSS. OPMERKING: Dissectie van de aorta in ringen gebeurt best in een dissectie gerecht dat een zwarte silastische stichting heeft. Dit maakt het gebruik van draden die kunnen gebruikt worden om de aorta canule en worden bevestigd aan de schotel, die stabiliteit terwijl de dissectie schotel. De zwarte achtergrond geeft contrast dat dissectie helpt. Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van cannulating draden als de endothelial cellaag kunnen worden verwijderd met overmaat wrijven van de draad tegen het lumen van het vat. </li><li> Neem een ​​draad en een kleine hoek van 90 ° aan de ene kant en duw het schuine uiteinde in de silastische stichting om de voerdraad te verankeren. Plaats het gehele aorta in de dissectie schotel. </li><li> Houd het uiteinde van de geleidedraad met een pincet en dan zachtjes draad de draad in het lumen van de aorta. </li><li> Gebruik een tang en schuif de aorta op de draad. Bij het vrije uiteinde van de geleidingsdraad is zichtbaar, curve de draad voorzichtig en plaats het vrije uiteinde in de silastic basis van de schotel naar het weefsel te stabiliseren. </li><li> Met behulp van kleine Vannas schaar en pincet, verwijder de perivasculair vetweefsel en alle andere vreemde weefsel, bloedstolsels, enz. Tot de thoracale aorta lijkt wit en enigszins vezelig. </li><li> Verwijder de gereinigde aorta van draad en met een schaar om de aorta ringen die ongeveer 3-5 mm breed gesneden. </li><li> Een aorta-ring op één van een paar tissue haken door het vasthouden van de haak en met behulp van een tang om schuif de ring op de haak. Herhaal dit proces met de tweede haak. Let erop de haken niet verward; zie figuur 3. </li><li> Controleer dat elke haak heeft een andere zijden hechtdraad bevestigd. Controleer dat één haak een kleine geknoopte lus van zijde die zorgt voor bevestiging aan een glas of roestvrij stalen staaf, terwijl de andere is een 04/10 cm lang stuk hechtdraad die hand gebonden aan de krachtopnemer zijn; zie figuur 3. Opmerking: Als de aorta is bevestigd aan de haken, het weefsel gereed in het weefselbad te monteren; zie figuur 3. </li><li> Herhaal de stappen 2,14-2,15, om een ​​tweede aorta ring monteren in de tweede weefsel bad kamer. </li></ol> 3. Tissue Plaatsing in Bath <ol><li> Merk op dat in dit systeem de weefselbaden zelf stationair. Op dit moment, vult het weefsel baden met warm, cellenbeton PSS en laat de oplossing te komen om temperature. </li><li> Met de zijden hechtdraad, das een van de haken op het weefsel voorbereiding op de pen op het roestvast stalen staaf. Plaats dit uiteinde in het weefsel bad kamer. Sluit de stang om een ​​ring stand en plaats het andere uiteinde in de kleuring schotel gevuld met PSS om weefsel ondergedompeld in buffer te houden; zie figuur 3. <ol><li> Plaats de staaf en weefsel in het weefsel bad kamer en zorg ervoor dat het weefsel wordt volledig ondergedompeld in PSS en de stang is veilig; zie figuur 3. </li><li> Bind de andere hechtdraad aan de krachtopnemer en zorg ervoor om speling in de hechting tussen het weefsel en de krachtopnemer. LET OP: Deze speling wordt verwijderd door het aanpassen van de micrometer; zie figuur 3. </li></ol></li><li> Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer. </li></ol> 4. Instellen Passief Tension OPMERKING: Elk weefsel heeft een lengte (Lo) waarop gladde spiercellen reageren optimally. Voorlopige experimenten de optimale strekspanning die bereikt deze lengte voor elk weefseltype verplicht zodat onderzocht bepalen. De rat thoracale aorta heeft een optimale passieve strekspanning van 4 g. <ol><li> Gebruik de micrometer / tandheugel om de spanning te verhogen tot 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau te bereiken. Zodra plateau is bereikt, verhogen de spanning nog 2 g en wacht tot het weefsel naar een plateau. Opmerking: In de aorta ringen na de aanvankelijke spanning van 2 g werd ingesteld en plateau bereikt, het weefsel moet vervolgens ontspannen tot ~ 1,6 g. Een tweede toepassing van 2 g weefsel zou brengen ~ 3,6 g, waarvan het weefsel weer ontspannen en spanning afnemen. Dus na 4 g totale spanning te hebben toegevoegd, de software moet ongeveer 3,2 g van spanning geven. </li><li> Herhaal deze stappen voor de tweede aorta ring en weefsel bad kamer. </li></ol> 5. Equilibratie and Drug Maken <ol><li> Equilibreer het weefsel voor60 min na het aanbrengen passieve spanning op het weefsel. </li><li> Tijdens de evenwichtsfase, was het weefsel elke 15-20 min. Giet de weefsels bad en vervang de PSS met PSS uit een verwarmd reservoir. OPMERKING: Gedurende deze tijd, wordt het weefsel ontspannen, hetgeen wordt aangegeven door het verlies van passieve spanning. </li><li> Gedurende deze tijd bereiden geneesmiddelen voor de proef, die moeten ten minste 1000 maal meer geconcentreerd dan de werkelijke concentratie in het bad te zijn, zodat slechts een kleine hoeveelheid van het geneesmiddel voorraad nodig is om de gewenste concentratie te bereiken. </li></ol> 6. Eerste Challenge <ol><li> Aan het einde van de evenwichtsperiode, was het weefsel een laatste keer, opslaan en opnieuw nul alle ingangen. </li><li> Pick een agonist (verbinding die actieve contractie veroorzaakt) waarop het weefsel reageert. Opmerking: In de ratten thoracale aorta, de arteriële gladde spier actief samentrekken om een ​​alfa-adrenerge receptor agonist door de innervatie van deweefsel door het sympathische zenuwstelsel. Een adrenerge agonist zou niet nuttig zijn in darmweefsel te zijn gezien het feit dat adrenerge agonisten veroorzaken ontspanning. In dit geval wordt een receptor agonist zoals acetylcholine (cholinerge receptor) worden gebruikt. Een alternatief voor Fenylefrine en acetylcholine is een niet-receptor-agonist zoals hoge kalium (K) als de eerste uitdaging. In de gladde spieren, hoge K werkt om indirect geopend calciumkanalen en dus wordt gezien als een algemene index van de gladde spieren integriteit. <ol><li> Voer de eerste uitdaging of de wake-up challenge door het toevoegen van 10 -5 M fenylefrine aan het weefsel bad. Om deze concentratie in 50 ml weefselbad bereiken, voeg 50 ul van een 10 -2 M fenylefrine oplossing. OPMERKING: 50 pi in 50 ml PSS is een 1/1000 verdunning, zodat de uiteindelijke concentratie 1000x dan beelden, of 10 -5 M. Kennis van volume en consistente handhaving van het volume binnen het weefselbad chamber is van cruciaal belang voor het bepalen van de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel. </li></ol></li><li> Voeg 10 -5 M fenylefrine aan het weefselbad en laat de contractie piek en plateau, wanneer de helling van nul wordt. Zorg ervoor dat elke experimentele evenement aan post-experimentele analyse te helpen vast te leggen. </li><li> Na het plateau, was de agonist grondig door het legen en opnieuw vullen van de weefsel bad kamer met nieuwe PSS. Zorg ervoor dat deze gebeurtenissen vast te leggen ook. OPMERKING: Een vuistregel is dat de concentratie van agonist in het bad wordt verminderd 10 maal met elke wasbeurt. Hoewel, kan meer dan 3-4 wassingen nodig zijn om het weefsel terug naar het evenwicht basislijn signaal (spanning) brengen. </li><li> Laten we voor ~ 10 min voordat u verder gaat de rest weefsel bij baseline toon. </li></ol> 7. Experiment OPMERKING: Prazosin, een alfa adrenergische receptor antagonist, worden ingevoerd om het weefselbad kamer naar de concentratie resp verschuivenonse bocht naar fenylefrine (PE); dit is een aantoonbaar antagonisme. <ol><li> Om één bad, voeg het voertuig (H 2 O) waarin prazosine werd ontbonden. Naar de andere, voeg de juiste concentratie van prazosine. In dit geval, voeg 25 ul voertuig een bad en 25 ui 10 -5 M concentratie van prazosine voor de andere een 5 x 10 -9 M of 5 nM concentratie in het bad bereiken. OPMERKING: Terwijl de toevoeging van het voertuig lijkt overbodig in dit voorbeeld, is het noodzakelijk om dit te doen wanneer andere voertuigen die potentieel vasoactieve zijn (bijvoorbeeld DMSO, ethanol, acetaat) hebben. Voeg de bijbehorende voertuig, zelfs als weinig bewijs bestaat voor het aan vasoactieve zijn. </li><li> Verlaat het voertuig / prazosine in de baden en hoeft het weefsel niet wassen gedurende 1 uur. <ol><li> Terwijl weefsels equilibreren, bereiden meerdere concentraties van agonist (PE). Omvatten een breed bereik van concentraties van concentraties waarbij nog geen respons (bv &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) aan concentraties die de maximale respons (overtreffen bijvoorbeeld 10 -4 M PE). Aangezien de concentratie-respons curves zijn logaritmisch van aard, maken zes afzonderlijke voorraad oplossingen van PE (10 -6 -10 -1 M) via de seriële verdunningen van de 10 -1 M stockoplossing. Zorg ervoor dat het benodigde volume voor elke concentratie is iets groter dan driemaal het totale benodigde volume voor alle baden (dwz&gt; 300 ul). </li></ol></li><li> Ga verder toevoegen van agonist, zoals beschreven in tabel 1. LET OP: Dit experiment zal een cumulatieve concentratie respons curve naar PE genereren; elke iteratie houdt rekening met de hoeveelheid stof reeds toegevoegd aan het bad. Toevoegingen gebeuren totdat ze niet meer te verhogen contractie, of de hele curve heeft plateaued. <ol><li> Voeg elke geneesmiddelconcentratie afzonderlijk totdat het weefsel is bereikt. </li><li> Als er geen verandering optreedt, voeg de volgende concentratie in hetserie; zie tabel 2. OPMERKING: De timing van deze toevoegingen is afhankelijk van de agonist. Bijvoorbeeld, noradrenaline en fenylefrine samentrekking ontwikkelt zich snel, en moet plateau binnen enkele minuten. Daarentegen endotheline-1 contractie ontwikkelt zich langzaam en kunnen niet plateau voor bijna 45 min. Andere experimenten kan op het weefsel na de bouw van een kromme zoals deze, mits (1) de stof uitwasbaar; en (2) kan worden aangetoond dat het weefsel weer normaal contractiele gedrag en wordt niet beïnvloed door de vorige stimulatie. </li></ol></li></ol> 8. Data Analyse <ol><li> Zorg ervoor om gegevens op te slaan onmiddellijk voorafgaand aan en na een interventie (bijv wakker of volledige curve). </li><li> Vinden en stel het weefsel basislijn voor elk weefsel bad kamer / input kanaal, dat zal helpen bij data-analyse. </li><li> Zodra de basislijn is ingesteld, vindt de maximale respons voor elke concentratie, en noteer de change van de uitgangswaarde. Achtereenvolgens door elk van de concentraties en noteer de basislijn. </li><li> Grafiek van de resulterende gegevens. Doe dit in een grafische programma. OPMERKING: Graph Pad Prism is ontworpen voor farmacologen en is ideaal voor type experiment hier gepresenteerd. </li></ol>

<ol><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+drugs+and+drug+receptors+in+isolated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues.</a> Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).</li>
<li>Scheindlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+modern+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">A brief history of modern pharmacology.</a> Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).</li>
<li>Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assessment+of+relative+agonist+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy.</a> Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).</li>
<li>Arunlakshana, O., Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+quantitative+uses+of+drug+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Some quantitative uses of drug antagonists.</a> Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).</li>
<li>Christopoulos, A., Kenakin, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+allosterism+and+complexing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor allosterism and complexing.</a> Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).</li>
<li>Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prejunctional+M1+facilitory+and+M2+inhibitory+muscarinic+receptors+mediate+rat+bladder+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility.</a> Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulins+from+scleroderma+patients+inhibit+the+muscarinic+receptor+activation+in+internal+anal+sphincter+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).</li>
<li>Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endothelin+receptors+in+the+cerebral+vasculature+and+their+lack+of+effect+on+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).</li>
<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Agonist-activated ion channels.</a> Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).</li>
<li>Wyllie, D. J., Chen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+time+to+study+competitive+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Taking the time to study competitive antagonism.</a> Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).</li>
<li>Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pA%2C+a+new+scale+for+the+measurement+of+drug+antagonism.+1947%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947.</a> Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).</li>
<li>Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+two+distinct+alpha+1-adrenoceptor+subtypes+in+rabbit+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).</li>
<li>Hiraoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+functional+characterization+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate.</a> Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).</li>
<li>Cooke, P. H., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fiber+length%2C+ultrastructure%2C+and+the+length-tension+relationship+of+mammalian+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle.</a> J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).</li>
<li>Davis, M. J., Gore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-tension+relationship+of+vascular+smooth+muscle+in+single+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles.</a> Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-month+serotonin+infusion+results+in+a+prolonged+fall+in+blood+pressure+in+the+deoxycorticosterone+acetate+%28DOCA%29+salt+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat.</a> ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).</li>
<li>Heppner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-evoked+purinergic+signalling+suppresses+action+potentials%2C+Ca2%2B+flashes+and+contractility+evoked+by+muscarinic+receptor+activation+in+mouse+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).</li>
<li>Burdyga, T. V., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+whereby+temperature+affects+excitation-contraction+coupling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle.</a> J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).</li>
<li>Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery%3A+role+of+the+RhoA%2FRho-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li>
<li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Meting van de isometrische kracht als een onderzoeksinstrument is meer dan 150 jaar oud, maar het blijft de prototypische techniek voor receptor karakterisering in contractiele weefsels 2 zijn. De kracht van deze techniek is zijn eenvoud en veelzijdigheid van opname respons uitgelokt door toenemende concentraties van een agonist in de aanwezigheid of afwezigheid van een antagonist kan een waaier aan informatie worden afgeleid omtrent de farmacologische eigenschappen van elk geneesmiddel en de receptor waaraan het bindt 3-5. Experimenten van deze informatie over de competitieve versus niet-concurrerende aard van de gebruikte antagonisten, evenals heterogeniteit receptor en niet-specifieke effecten van geneesmiddelen 08/06 Garner ook. Aldus, met eenvoudige permutaties deze geïsoleerde weefselbad experiment, een relatief volledige farmacologische profiel van de receptoren die agonist geïnduceerde spiercontractie bemiddelen kan worden gegenereerd. In termen van agonisme, the relatieve werkzaamheid (Emax) en sterkte (EC50) van een agonist in een bepaald weefsel kan worden berekend en vergeleken met reacties van andere agonisten in hetzelfde weefsel 1. In het experiment werd de rat thoracale aorta geïncubeerd met ofwel drager of α 1 adrenergische receptor antagonist prazosine (5 nM) gedurende één uur voorafgaand aan het toevoegen van de α 1-adrenerge agonist fenylefrine aan het weefselbad en genereren contractie. Figuur 2 stelt gemodificeerde resultaten van Figuur 1. De groene reacties gemarkeerd met de maximale contractie bereikt PE gemarkeerd als maximum, de halve maximale contractie gemerkt en vervolgens verbonden aan de PE-concentratie die veroorzaakte dat reactie. Het identificeren van deze waarden is het identificeren van de effectieve concentratie van een agonist die een half maximaal (50%) respons of EC 50 waarde bereikt. Helaas, met agonist-afhankelijke parameters alleen bepalen receptor bindingseigenschappen kan ingewikkeld 9. Idealiter aanvullende experimenten met receptorantagonisten kan de berekening van twee belangrijke parameters die bepalend zijn voor het definiëren van de wisselwerking tussen een geneesmiddel en een receptor zijn: -log 10 van de antagonist dissociatieconstante (pK B) en de -log 10 van de molaire antagonist concentratie noodzakelijk tweevoudige verschuiving naar rechts in de concentratie-respons curve (pA 2) 10 wekken. Zowel K B en pA2 krijgen hun bruikbaarheid het feit dat zij agonist-onafhankelijke waarden, en constant blijft zelfs tussen verschillende weefsels 11. Uit de gegevens in figuur 2, kan pK B wordt berekend met de volgende vergelijking en op basis van EC50 waarden elders berekend: EC50 bij afwezigheid van prazosine = 2 x 10 -8 M EC50 in de presence van prazosine = 7 x 10 -6 M Los K B in de volgende vergelijking: inloggen (dr-1) = log [B] - log K B Waar: [B] = antagonist concentratie, of 5 x 10 -9 M. inloggen (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = dosisverhouding van EC 50 -waarde in aanwezigheid van antagonist / EG 50 in afwezigheid. Als er een verschuiving naar rechts, zal deze waarde groter dan één zijn. Dus: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M of 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Vervanging van [B] en dr: inloggen (350-1) = -8 - log K B 2,54 = -8 - log KB pK B = 10.54 Deze waarde voor prazosine is consistent met de waarden verkregen bij prazosine interageert met een α 1 adrenerge receptof 12,13, wat suggereert dat de adrenerge receptor die contractie fenylefrine de α 1-adrenerge receptor. Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van deze experimenten. Weefsels moet in PSS blijven na dissectie om het verlies van levensvatbaarheid van het weefsel te voorkomen. Elke isometrische spier voorbereiding heeft een optimale lengte-spanning relatie die maximale kracht genereert tegen passief spanning 14,15. Voor de in dit protocol beschreven experiment werd een optimale passieve spanning eerder bepaald door het kort toe te voegen stappen van 0,5 g passieve spanning aan het weefsel. Het weefsel moet beginnen zonder toon en vervolgens na 30 minuten equilibratie, het weefsel werd uitgedaagd met een maximale concentratie van KCl (80 mM), die actief toon gegenereerd. Vervolgens werd het weefsel gewassen en gewacht totdat uitgangswaarde toon. Na 15 min bij aanvang werd nog 0,5 g passieve spanning gebracht en dit proces herhaald totdat een plateau vanactieve spanning werd bereikt met extra passieve spanning. In voorlopige experimenten, 4 g totaal passieve spanning was vastbesloten om maximale actieve spanning generatie te bereiken in de aorta ringen, en dus dit totale bedrag van de spanning op de ringen is geplaatst voorafgaand aan het in evenwicht brengen. Procedureel, is het best om vooraf passieve spanning toepassing nul, maar kan worden gedaan op elk moment vóór het experiment. Over-stretching weefsels, op elk punt in het experiment of dissectie, een negatieve invloed weefsel levensvatbaarheid en experimentele resultaten. Dit is vooral noodzakelijk bij het plaatsen van weefsels in het bad, aangezien deze stap de hoogste waarschijnlijkheid van overmatige rek. Adequate wassen, het aantal en de duur vereist om reproduceerbare effecten. Een tweede uitdaging te snel na een eerste uitdaging, of voordat weefsels zijn teruggekeerd naar de uitgangswaarde spanning, zal resulteren in afwijkende reacties. Als bestuderen reversibele antagonisten / remmers, weefsels moeten niet vóór gewassen toevoeging agonist, als inhibitor concentratie wordt verlaagd. Er zijn opmerkelijke voordelen en nadelen aan het geïsoleerde weefselbad assays. Nadelen: Weefsels kunnen verschillende graden van schade ondervinden tijdens chirurgische verwijdering of plaatsing van ringen op haken. Aangezien de endotheelcel is de binnenvoering van de aorta ring, moet erop worden gelet op de positie van de ring aan haken om niet deze cellaag beschadigd. Weefsels kan ook duidelijk verschillende lengtes van de tijd waarin ze levensvatbaar zijn in het weefsel bad, en dit moet worden vastgesteld; niet alle weefsels hetzelfde. Langs deze lijnen, kunnen weefsels veranderen hun respons gedurende de dag zodat de bedieningselementen geworden nodige controle voor elk experiment. Een goed voorbeeld hiervan is de caviatrachea dat verbetert in contractiliteit maximaal 100% gedurende een typische 8 uur experiment. Geneesmiddelen die slecht oplosbaar zijn in water mogen neerslaan in de PSS. Tot slot, een cumulatievend niet-cumulatieve toevoegingen van een medicijn dat een agonist kan leiden tot verschillende resultaten als receptor desensitisatie de agonist plaatsvindt; Angiotensine II is een dergelijk geneesmiddel waarvan snel tachyfylaxie blijkt. Voordelen: Een van de belangrijkste voordelen van weefselbad experimenten is dat het real time; men kan het experiment te zien zoals het zich ontvouwt en kan snel conclusies trekken en plan volgende stappen, evenals het oplossen van problemen tijdens een experiment. Een experiment duurt een dag te doen. Meerdere weefsels kunnen kenmerkend worden bereid uit een dier, dat een dier kan fungeren als zijn eigen controle en die leidt kracht om een ​​experiment. Men kan ook het weefsel te isoleren van andere factoren zodat een relatief zuivere reactie van het weefsel om de drug te testen. In vitro experimenten, zoals het weefselbad systeem gebruik van een kleine hoeveelheid geneesmiddel en een in vivo proef stelt. De basis proefopzet hierin beschreven kan wordeningrijpend gewijzigd om te zorgen voor de opname van extra parameters of de introductie van andere externe prikkels. Bijvoorbeeld, toevoeging van elektroden mogelijk maken elektrisch veld stimulatie van zenuwen innerveren 16,17. Met de toevoeging van thermische of pH-sondes, kunnen de effecten van temperatuur en pH op de contractiele responsen worden gemeten 18,19. Op dezelfde manier kan zuurstof geheel of gedeeltelijk met N2 tot hypoxie geïnduceerde effecten te evalueren worden vervangen. Bovendien kan dezelfde basisprincipes van isometrische contractie metingen in deze video worden gebruikt voor systemen die gelijktijdige meting van isometrische spanning ontwikkeling en veranderingen in intracellulaire calcium 20 laten ontwikkelen. Signaaltransductie ook gemakkelijk bestudeerd, omdat systemen bestaan ​​die een weefselmonster snel tijdens een reactie te bevriezen, zodat de activiteit van een signaaltransductieroute biochemisch systeem kan worden gecontroleerd. De variatie van apipment die kan worden gebruikt om dit te doen is enorm. Dit hele systeem, hetzij met de hand of geautomatiseerd gebouwd kunnen worden aangekocht van meerdere verschillende bedrijven. Het weefsel baden en houders weefsel gebruikt in dit protocol werden met de hand geblazen (weefsel baden) en met de hand vervaardigd (houders) door een in-house Michigan State University machine winkels.

De discipline van de farmacologie heeft het geïsoleerde weefsel bad systeem dat wordt gebruikt voor meer dan 150 jaar. De veelzijdigheid van het systeem toegestaan ​​wetenschappers over de hele wereld receptoren en receptor signaaltransductie karakteriseren, met deze kennis die de basis van therapieën die behandeld miljoenen individuen met ziektes of aandoeningen zoals hoge bloeddruk, hartfalen, diabetes, gastro-intestinale ziekte, blaas disfunctie, astma en slikproblemen, om maar een paar. Tot op de dag, de geïsoleerde weefsel bad blijft een belangrijk facet van de ontwikkeling van geneesmiddelen en fundamenteel onderzoek, omdat het laat het weefsel om te functioneren als een tissue. In deze Jupiter les, wordt een formele protocol gedeeld met een visuele en virtuele experiment gebruik te maken van de gegevens uit een geïsoleerde weefsel bad experiment dat isometrische contractie meet, die receptor karakterisering toelaat te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het weefsel levend hetnd functioneert als geheel weefsel, met een fysiologisch resultaat (contractie of relaxatie) die waaraan het lichaam is. Het is een synthese van stappen (geneesmiddel-receptor interactie, signaaltransductie, tweede boodschapper generatie verandering in gladde spier prikkelbaarheid en veranderingen in weefsel functie). Terwijl andere technieken laten bestuderen elke van deze stappen (bijvoorbeeld radioactieve ligand voor drug affiniteit meting van tweede boodschappers), de geïsoleerde weefselbad techniek maakt integratie van al deze stappen 1. Een ander voordeel is dat met behoud weefsel functie kan berekenen belangrijke farmacologische variabelen die meer betekenis in een weefsel versus een cellulaire omgeving; het dichter bij hoe de onderzochte geneesmiddelen in het lichaam zou werken als een geheel.

<table><tbody><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 kanaal)&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 kanaal)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>Grass Adapterkabel</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Force-verplaatsings transducer</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>Grass Transducerkabel</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC naar BNC Kabel</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Weefselbad</td><td>Meerdere bronnen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fysiologische zoutoplossing</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>Gevlochten zijden hechting</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Ringstandaard</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schotels</td><td>Handgemaakt met siliconen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Slang</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Slangklemmen</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Spierbad</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Op maat</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Verwarmingskamers</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Op maat</td><td></td></tr><tr><td>Gasverspreidingsbuis</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Op maat gemaakte stands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driepootklemmen</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S-connector</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>Weefselhaken</td><td>Handgemaakt in huis</td><td>Op maat</td><td></td></tr><tr><td>Weefseldissecatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereomicroscoop MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscoop Vezel-optische lichtbron</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Kweek Petrischaal</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glas</td></tr><tr><td>Sylgard Siliconen Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Schaartjes</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Splinter & Fixatie Pincetten</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

meting van de gladde spieren functie in het geïsoleerde tissue bath-applicaties om farmacologie onderzoek

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays zijn een klassiek farmacologisch hulpmiddel voor het evalueren van concentratie-respons relaties in een groot aantal contractiele weefsels. Hoewel deze techniek al meer dan 100 jaar wordt toegepast, blijft de veelzijdigheid, eenvoud en reproduceerbaarheid van deze test een onmisbaar hulpmiddel voor farmacologen en fysiologen. Tissue bath systemen zijn beschikbaar in een breed scala aan vormen en maten, waardoor een wetenschapper monsters zo klein als muis-mesenterische arteriën en zo groot als varkens-ileum kan evalueren – zo niet groter. Centraal in de geïsoleerde tissue bath test staat de mogelijkheid om concentratie-afhankelijke veranderingen in isometrische contractie te meten en hoe de efficiëntie en potentie van contractiele agonisten kan worden gemanipuleerd door het verhogen van de concentraties van antagonisten of remmers. Hoewel de algemene principes relatief vergelijkbaar blijven, bieden recente technologische vooruitgang nog meer veelzijdigheid aan de tissue bath test door computergebaseerde gegevensregistratie en analysesoftware te integreren. Deze video zal de functie van de geïsoleerde tissue bath demonstreren om de isometrische contractie van een geïsoleerd glad spierweefsel (in dit geval ratten thoracale aorta ringen) te meten, en de soorten kennis delen die met deze techniek kunnen worden gecreëerd. Inbegrepen zijn gedetailleerde beschrijvingen van aortaweefsel dissectie en voorbereiding, plaatsing van aorta ringen in de tissue bath en juiste weefsel gelijkgewicht voorafgaand aan experimenten, tests van weefselviabiliteit, experimenteel ontwerp en implementatie, en gegevenskwantificering. Aorta zal worden verbonden met isometrische krachttransducers, waarvan de gegevens zullen worden vastgelegd met behulp van een commercieel verkrijgbare analoog-digitaal converter en brugversterker, specifiek ontworpen voor gebruik in deze experimenten. De bijbehorende software voor dit systeem zal worden gebruikt om het experiment te visualiseren en de vastgelegde gegevens te analyseren.

Qua agonisme, kunnen de relatieve werkzaamheid (Emax) en sterkte (EC50) van een agonist in een bepaald weefsel wordt berekend en vergeleken met reacties van andere agonisten in hetzelfde weefsel 1. In het experiment werd de rat thoracale aorta geïncubeerd met ofwel drager of α 1 adrenergische receptor antagonist prazosine (5 nM) gedurende één uur voorafgaand aan het toevoegen van de α 1-adrenerge agonist fenylefrine aan het weefselbad en genereren contractie (figuur 1). Figuur 2 presenteert gewijzigd resultaten van figuur 1. De groene reacties zijn gemarkeerd de maximale krimp gerealiseerd door PE gemarkeerd als maximum, de ½ maximale contractie als zodanig gemarkeerd en vervolgens gekoppeld aan de PE-concentratie die ervoor zorgde dat de respons. Het identificeren van deze waarden is het identificeren van de effectieve concentratie van een agonist die een half maximaal (50%) respons of EC behaalt <sub&gt; 50 waarde. Dit was donegraphically in deze example.Computer software die gebruikt logistieke functies sigmoïdale curves kunnen worden gebruikt voor curve fitting en berekening van EC50 waarden. In genereren en interpreteren van deze resultaten is het belangrijk om zowel lage en hoge concentraties gebruik van agonist tot de concentratie-respons curve. Zonder voldoende punten om een stabiele basislijn en maximale plateau vertonen, kunnen EC50 en Emax alleen worden geschat. Dit werd grafisch gedaan in dit voorbeeld. Software die logistieke functies gebruikt voor sigmoïdale curves kunnen worden gebruikt voor curve fitting en berekening van EC50 waarden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Tissue Bad Schematische Cartoon vertegenwoordigt een ring van weefsel geplaatst in de dubbele wand, watermantel weefsel bath. Buffer in- en uitstroom worden gereguleerd door een 3-way glas kraan geïntegreerd in de basis van de kamer. O 2 / CO 2 wordt in geborreld door een beluchter die wordt afgesloten met een pakking om lekkage van PSS of gas te voorkomen. Recirculatie ingang beneden de uitgang juiste recirculatie handhaven en de vorming van luchtzakken die temperatuur ontregeling zou leiden, te voorkomen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. Rat thoraxaorta + Endotheel Bovenstaande figuur toont vier afzonderlijke experimenten (verschillende dieren en uitgevoerd door verschillende onderzoekers op verschillende opstellingen zoals voorgesteld door verschillende kleuren) het vermogen van prazosine om een PE-geïnduceerde contractie verschuiven testen. Prazosine (5 nM) duidelijk verschoven-PE-geïnduceerde contractie bocht naar rechts in een parallelle wijze. Figuur 3: Rat thoraxaorta + Endotheel Grafische schatting van EC50 waarden voor PE zonder (voertuig) en aanwezigheid (prazosine) antagonist.. Groene lijn (groep C) alleen is gemarkeerd. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Zout </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 liter </td><td> FINAL mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (Gram) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: normale fysiologische zoutoplossing (PSS) Recept inhoud van het bicarbonaat gebufferde PSS gebruikt in dit experiment.. Inbegrepen zijn de molecuulgewichten van alle zouten en toegevoegd aan 5 L dH 2 O tot de gewenste concentratie te bereiken bedrag. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentratie in bad </td><td> Toevoeging van agonist aan bath </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabel 2:. Tissue badadditief Agonist Concentraties De hoeveelheid agonist te zijn om elk bad toegevoegd proPerly construeren cumulatieve concentratie-respons curves. De gewenste badconcentratie wordt bereikt door toevoeging van opeenvolgende hoeveelheden van toenemende concentraties van agonist. Elke toevoeging houdt rekening met de concentratie van agonist reeds in het bad. Dit wordt gedaan om de volumetoename van het weefselbad die zouden voortvloeien uit de steeds grotere volumes van een enkele concentratie van agonist minimaliseren.

Dit protocol beschrijft de meting van isometrische contractie in een geïsoleerde gladde spierpreparatie, met behulp van een geïsoleerd weefselbadsysteem en computergestuurde dataverzameling.

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de tonus van glad spierweefsel. Dit wordt bereikt door eerst weefsels te dissekeren en voor te bereiden. De tweede stap is het plaatsen van het weefsel in een geïsoleerd weefselbad.Vervolgens wordt de levensvatbaarheid van het weefsel getest en worden er metingen van de isometrische contractie uitgevoerd. Uiteindelijk wordt de preparatie in het geïsoleerde weefselbad gebruikt om de receptorfunctie, receptor-signalering en de reactiviteit van de gladde spieren te testen. In het algemeen zijn de belangrijkste voordelen van deze techniek de flexibiliteit van het systeem, de snelheid waarmee resultaten worden behaald en het feit dat het volledige weefsel intact blijft.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in elk vakgebied dat gebruikmaakt van geneesmiddelen om receptor-signalering of gladde spiercellen te beïnvloeden. Er zijn een paar voorbereidingen die benadrukt moeten worden. Het is essentieel om het weefselbad-systeem voor te verwarmen tot 37 °C door het recirculerende verwarmde waterbad in te schakelen. Het water moet via de laagste gekartelde aansluiting elk onderdeel binnenstromen en via de hoogste gekartelde aansluiting uitstromen.Elk onderdeel moet worden aangesloten. De krachttransducers moeten worden gekalibreerd en moeten minimaal 15 minuten voor het experiment worden ingeschakeld om hun temperatuur op een evenwicht te brengen. Controleer vervolgens de gasverbindingen op lekken en zet daarna het systeem onder druk.Nadat het systeem met de oplossing is gevuld, moet u ervoor zorgen dat het is voorgevuld en dat eventuele luchtbellen zijn verwijderd. Het is ook raadzaam om de beluchters van het weefselbad te testen. Een goede beluchting zorgt voor een effectieve verspreiding van geneesmiddelen, zonder het weefsel direct voorafgaand aan het experiment te destabiliseren.Dissekeer het weefsel. Creëer na het anesthetiseren van de rat een pneumothorax met behulp van een schaar. Snijd langs het diafragma aan de onderzijde van de ribbenkast.Snijd vervolgens vanaf de onderkant van de ribbenkast naar het borstbeen en halveer het weefsel. Verwijder de organen boven de wervelkolom om de aorta te lokaliseren, die zich direct langs de wervelkolom bevindt. Sever nu alle verbindingen met de aorta en snijd de aorta loodrecht op de wervelkolom door op het niveau van het diafragma.Houd vervolgens de aorta voorzichtig vast en dissekeer de aorta van de wervelkolom. Begin in het onderste diafragmagebied naast de wervelkolom en werk in de richting van het hart. Let er wel op dat u aan het aortaweefsel niet trekt of rukt, omdat dit direct schade kan toebrengen aan het weefsel.Plaats de aorta in een dissectieschaal met PSS. Neem nu een draad en buig deze in een kleine hoek van 90 graden. Veranker het gebogen uiteinde van de draad aan één zijde in de bodem van de dissectieschaal.Rijg vervolgens voorzichtig de geleidedraad in het lumen van de aorta en schuif de aorta over de draad. Wanneer het vrije uiteinde van de draad zichtbaar wordt, buig dit dan voorzichtig en duw het in de ondergrond om zo het weefsel te stabiliseren. Verwijder nu met een kleine Venusschaar en een pincet het perivasculaire vetweefsel en andere vreemde weefsels totdat de thoracale aorta er wit en enigszins vezelig uitziet.Zodra het overtollige weefsel is verwijderd, wordt de schone aorta voorzichtig van de draad gehaald. Voltooi dit gedeelte door de aorta in ringen van drie tot vijf millimeter breed te snijden. Een aorta-ring bereiken.Bereid twee weefselhaken voor met hechtdraad om deze in de badkamer te fixeren. Eén haak moet een hechtingsdraad hebben met een kleine geknoopte lus voor bevestiging aan een staafje. De andere haak vereist een stuk hechtdraad van 10 tot 14 centimeter lang.Om een knoop te leggen, bevestigt u zorgvuldig een paar van deze weefselhaken aan elke aortaring. Let erop dat de haken niet in de knoop raken. Plaats vervolgens elk stuk weefsel in een schaaltje met PSS op kamertemperatuur, met een weefselhouder die is bevestigd aan een statief.Schuif vervolgens de geknoopte lus over de pen van de staaf en gebruik het lange stuk hechtmateriaal om het weefsel omhoog te houden. Plaats daarna de staaf in de kamer en zorg dat de staaf stevig vastzit. Bind nu het hechtmateriaal van de resterende haak vast aan de krachttransducer.Laat voldoende speling in de hechting, zodat de spanning tussen de krachttransducer en het weefsel met de micrometer kan worden afgesteld. Herhaal dit proces voor elke ring in elke kamer. Stel nu de passieve spanning in.Gebruik de micrometer om de spanning te verhogen naar twee gram en wacht tot de spanning op het weefsel stopt met toenemen. Verhoog vervolgens de spanning met nog eens twee gram en wacht opnieuw tot de verandering in de spanning is gestabiliseerd. Ter afronding.De spanning moet nu ongeveer 3,2 gram bedragen. Herhaal dit proces voor elke ring in elke kamer. Laat de weefsels na het instellen van alle passieve spanningen een uur equilibreren.Vervang tijdens deze tijd de PSS elke 15 minuten en tref andere voorbereidingen voor het experiment, zoals het klaarmaken van de geneesmiddelen aan het einde van de equilibratieperiode. Was het weefsel één laatste keer, sla de gegevens op en nul alle ingangen. Voer vervolgens, volgens de details in het tekstprotocol, de initiële challenge uit.Zorg ervoor dat deze acties in de software worden gedocumenteerd. Na de initiële uitdaging zal de verandering in spanning stabiliseren. Was vervolgens het uitdagingsmiddel uit, zodat de tonus van het weefsel een basislijn bereikt.Laat het weefsel nu ongeveer 10 minuten rusten bij deze baseline-tonus; één bad in het vehikel, in dit geval water, en het andere bad in het andere. Voeg voldoende prazocin toe voor een concentratie van 5 nM in het bad. Laat de weefselbaden een uur incuberen zonder te wassen.Bereid ondertussen het fenolring-oplossing voor in een breed scala aan concentraties langs een logaritmische curve. Voeg na een uur phenylring-agonist in toenemende concentraties toe aan het bad om een cumulatieve concentratie-responscurve te genereren. Wacht na elke toevoeging tot de weefselrespons een plateau bereikt voordat de volgende concentratie wordt toegevoegd.Blijf toevoegingen maken totdat ze de tonus van het weefsel niet meer veranderen of totdat de gehele responscurve is afgevlakt. In plaats daarvan werd de thoracale aorta gedurende één uur geïncubeerd in de alfa-1 adrenerge receptorantagonist POZ sim voordat de alfa-1 adrenerge agonist phenylrine aan het weefselbad werd toegevoegd en cumulatieve contractieresponscurven voor de maximale en halfmaximale contracties van phenylrine werden gegenereerd. Controleweefsels met alleen het vehikel zijn in het groen aangegeven.Het halve maximum identificeert de effectieve concentratie voor het geneesmiddel. Dezelfde metingen voor het met razine behandelde weefsel zijn in het zwart weergegeven. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de functie van glad spierweefsel in een geïsoleerd weefselbad kunt meten.

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Metingen van KV7 (KCNQ) kaliumkanaal activiteit in geïsoleerde bloedvaten myocyten (met behulp van patch-clamp elektrofysiologische technieken), parallel met metingen van constrictor / dilatator reacties (met behulp van druk myografie) kunnen belangrijke informatie over de rol van KV7 kanalen in het gladde spierweefsel fysiologie en farmacologie.

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

In druk myography wordt een intacte klein segment van een vaartuig aan twee kleine canules geplaatst en een druk van een geschikte luminale druk. Hier beschrijven we de methode om vasorelaxatie respons van de muis 3...

Beoordelen van Muizen Resistance Artery functie gebruiken Pressure myography

Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.

Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie

Murine linker ventriculaire papillaire spier kan worden gebruikt voor cardiale contractiliteit in vitro onderzoeken. Dit artikel beschrijft in detail de isolatie en experimentele protocollen cardiale contractiele kenmerken te bestuderen.

Samentrekbaarheid Metingen op Geïsoleerde papillairspieren voor onderzoek naar Cardiac inotropie in Muizen

Dit artikel wordt beschreven experimentele protocollen om te studeren ex vivo contracties van menselijke myometrium en hun toepassing in drugontdekking. Deze techniek wordt gebruikt voor verbetering van het inzicht van myometrial fysiologie en pathofysiologie alsmede over de farmacologische gegevens van roman onderzoek sondes valideren of drugs leidt.

Contractility metingen van menselijke uteriene gladde spieren aan steun Geneesmiddelenontwikkeling

Het huidige protocol beschrijft de concepten en technische toepassing van de tensometrische myograaftechniek met behulp van een meerkamermyograafsysteem in de experimentele ex vivo beoordeling van de aorta-endotheelfunctie van muizen.

Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in de thoracale aorta van de muis met behulp van tensometrische kamermyografie met klein volume

We presenteren een methode voor het isoleren van darmbuizen van ratten en het beoordelen van de impact van geneesmiddelen op hun spanning, frequentie en amplitude in vitro. Deze methode biedt een waardevolle aanpak voor onderzoekers die onderzoek doen naar darmbuisjes.

Een in-vitroweefselperfusiesysteem gebruiken om de functionele activiteiten van geïsoleerde darmbuizen in realtime te detecteren

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Een weefsel voorbereiding is beschreven voor visualisatie en experimentele manipulatie van de levende microcirculatie. In verdoofde mannelijke muizen, is de dunne, zeer goed doorbloede cremaster spier voorbereid intravitale microscopie tot microvasculaire netwerken, inclusief arteriolen, capillairen en venulen studie. Dit preparaat wordt gemakkelijk aangepast voor ratten en hamsters.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Leer isometrische contractiemetingen in gladde spieren uitvoeren met een geïsoleerd weefselbad. Deze methode met rat aorta helpt onderzoekers receptorfunctie en farmacologische responsen in vitro bestuderen.

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Meer video's verkennen