Name: Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer het effect van herhaalde sigarettenrookblootstelling op organotypische 3D bronchiale en neusweefselmodellen. Deze methode meet trilhaarfrequentie en transcriptoomveranderingen voor toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Maurice Smith en Marja Talikka bedanken voor hun beoordeling van het manuscript.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Deze studie werd gefinancierd door Philip Morris International.

Hier hebben we de toepasbaarheid van de menselijke organotypic bronchiale en neusweefsel modellen om de effecten van herhaalde CS blootstelling te beoordelen aangetoond. Als alternatief voor dierproeven enkele blootstelling systemen ontwikkeld voor toxicologische evaluatie van aërosol in vitro (bijv., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Deze blootstelling modules kunnen ook worden gebruikt om de toxiciteit van luchtvervuiling, zwevende deeltjes, nanodeeltjes, etc. In deze studie hebben we de Vitrocell systeem aan maximaal 48 verschillende monsters tegelijkertijd, waardoor grotere schaal experimenten en lagere variabiliteit behandelingen. Voor elke aerosol blootstelling in vitro, het risico van weefselkweek verontreiniging blijft een groot risico waarvan beperking vereist een zorgvuldige behandeling van het weefsel culturen in de experimenten. Het meten van de depositie van deeltjes in real time op de microbalans tijdens de eXposure experiment maakt het mogelijk om te controleren of de CS doses gegenereerd uit het belichtingssysteem te zijn dat voldoet aan de verwachtingen. Om de nauwkeurigheid van de gemeten deeltjes depositie waarborgen, opzetten het online meten juist vóór de belichting critial, bijvoorbeeld het opzetten van de schaal 0. Daarnaast, vanwege het verschil tussen de gebieden van de microbalans (cm2) en de weefselkweek insert (0,33 cm2), pasten we de uiteindelijke berekening van de oppervlakte van het kweekinsert: slechts 33% van de neerslag op de microbalans de werkelijke afzetting in de kweekinsert. Meting van TEER strak-splitsing barrière functionaliteit te kennen en om verstoring van de epitheellaag beoordelen is een relatief eenvoudige procedure te implementeren, die we hier gemeld. Omdat de bronchiale en nasale weefselmodellen bevatten slijmvormende afgewisseld slijmbekercellen, apicale wassen dient voor de TEER MMO te voerenurement. De apicale wassen is essentieel omdat de aanwezigheid van de mucuslaag en de variabiliteit van de dikte vertekening van de meting van TEER, interferring de gevolgen van CS blootstelling. Dit begrip is in overeenstemming met hetgeen is beschreven door Hilgendorf en collega&#39;s, waarbij de permeabiliteit van Caco-2 cellen werd beïnvloed door co-kweken met slijmvormende slijmbekercellen lijn HT29 23. Het slijm moet worden afgewassen vóór TEER meting, omdat apicale wassen vlak voor de belichting kan interfereren met het weefsel reacties op CS. Daarom wordt de meting uitgevoerd drie dagen vóór de blootstelling, en niet vlak voor blootstelling. We toonden aan dat CYP1A1 / CYP1B1 activiteit kan worden gemeten vanaf de organotypische cultuur modellen volgende CS blootstelling hoewel de activiteit werd slechts licht verhoogd met CS. Dit zwakke signaal kan worden versterkt door een langere incubatie van het CYP1A1 / 1B1 substraat (bijv., Luciferine-CEE), bijvoorbeeld voor24 uur (gegevens niet getoond). Een van de beperkingen van de CYP activiteitsmeting in dit werk is het ontbreken van normalisatie naar de CYP eiwitniveau of het aantal cellen, die in aanmerking kunnen worden genomen voor toekomstige studies dat de verandering van de enzymactiviteit niet beïnvloed Door de verandering van ofwel het eiwitniveau of het aantal cellen. We meldden dat CS blootstelling remde de ciliaire verslagen in zowel de nasale en bronchiale weefsel modellen. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan in diverse zoogdieren en niet-zoogdieren modellen 12. Voor ciliaire slaan meten, zodat de weefsels worden gehanteerd en behandeld op dezelfde wijze kritisch is, bijvoorbeeld als mediumverversing wordt uitgevoerd, moet worden toegepast voor alle monsters. Sutto en collega&#39;s gemeld dat de pH beïnvloed de zoogdieren ciliary verslaan frequentie 24. Dus, bij het vergelijken slaan frequenties tussen cellen behandeld met verschillende compounds / mengsels pHaanpassing moet worden overwogen om de variabiliteit van de ciliaire kloppend metingen te minimaliseren. Bovendien is de temperatuur waarbij de meting plaatsvindt is ook belangrijk als de frequentie van ciliaire slaan druppels met afnemende temperatuur. Om de variabiliteit door deze veranderingen een podium-top incubator, uitgerust met temperatuur, CO2 en luchtvochtigheid werd gebruikt in deze studie minimaliseren. Ondanks dit, we hebben geconstateerd dat de ciliaire frequenties verslagen in de bronchiale weefsels na CS blootstelling waren zeer variabel (dwz., Te verhogen in een insert en dalen in de andere insert), wat suggereert dat de ciliaire kloppend is zeer verstoorde direct na blootstelling. Daarentegen we de afwezigheid van meetbare ciliaire slaan frequenties waargenomen in de nasale weefsels na CS blootstelling suggereert dat de respons van de nasale weefsel gevoeliger en consistent. Dit is in overeenstemming met een eerdere publicatie blijkt dat de nasale weefsel een lagere capaciteit te ontgiftenvergeleken met de bronchus 25. Tot slot hebben we laten zien dat gen expressie profilering van de organotypic bronchiale en neusweefsel modellen blootgesteld aan CS een impact van CS op lichaamsvreemde metabolisme kon aantonen. Interessant is dat de waargenomen verandering in xenobiotische metabolisme in de organotypische bronchiale en nasale in vitro modellen blootgesteld aan CS lijken op die van de in vivo situatie rokers zoals in meer detail in een eerdere publicatie 15. Voor genexpressie analyses met de robotic instrument met een hoge doorvoer analyse mogelijk. Bovendien, robotachtige automatische handling verhoogt verder de consistentie en nauwkeurigheid van de resultaten genexpressie. Niettemin snelle verzameling van de weefselmonsters was cruciaal om RNA afbraak tijdens de RNA-extractie te vermijden. De RNA processing transcriptoom benaderingen beschreven kunnen ook worden toegepast op in vivo weefselmonsters.

Longen worden direct en constant blootgesteld aan ingeademde lucht die diverse toxische stoffen kan bevatten, zoals verontreinigingen en bestanddelen van sigarettenrook (CS). Het bestuderen van de impact van blootstelling aan deze toxische stoffen op respiratoire weefsels is het meest informatief wanneer het wordt gedaan op een manier die lijkt op in vivo blootstelling. In vergelijking met de klassieke 2D ondergedompelde celculturen (bijv. normale menselijke bronchiale epitheelcellen (NHBE)), beter recapituleren 3D organotypische weefselmodellen de morfologische, fysiologische en moleculaire aspecten van het humane luchtwegepitheel in vivo1,2: de 3D weefselmodellen bevatten de diversiteit van de celtypen die in vivo worden waargenomen, inclusief gedifferentieerde epitheelcellen, geciliale en niet-geciliale cellen, slijmklieren en basale cellen. Ze hebben functionele strakke verbindingen en vertonen een mucociliair fenotype 1-3. Bovendien kunnen de culturen worden gekweekt op een doorlaatbare poreuze membraan, in een lucht-vloeistofinterface, waardoor een directe blootstelling aan aërosolen aan de apicale kant mogelijk is (terwijl de basolaterale kant is ondergedompeld in kweekmedium) 3-5. Dvorak en collega's rapporteerden dat genexpressieprofielen van bronchiale weefselmodellen vergelijkbaar waren met die verkregen uit menselijke bronchiale borstels 3. Bovendien toonden Mathis en collega's aan dat de reacties van deze weefselmodellen op CS vergelijkbaar waren met de verschillen die werden waargenomen tussen bronchiale epitheelcellen verkregen van rokers en cellen verkregen van niet-rokers 6. Ten slotte, omdat de bronchiale weefselmodellen tot wel enkele maanden kunnen worden gekweekt 4,5, kunnen ze mogelijk worden gebruikt om de effecten van langdurige blootstelling van testartikelen te onderzoeken.
Cytotoxiciteitsbeoordelingen zijn gebruikelijke parameters die worden gemeten na chemische aanvallen of om de toxiciteit van specifieke verbindingen of mengsels te beoordelen. Bijvoorbeeld, kan de membraanintegriteit worden gemeten door een luminescentie-assay en maakt het de meting van een dosisafhankelijk cytotoxisch effect op de celcultuur mogelijk 7. Om echter pathofysiologische effecten van verbindingen bij subtoxische concentraties te beoordelen, moeten andere parameters worden gemeten. Bijvoorbeeld, de weefselintegriteit bepaald met behulp van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) assay verzekert de functionaliteit van strakke verbindingen en monitort de verstoring van de epitheliale laag 8,9. Ciliair kloppenfrequentie maakt ook de meting van CS-gerelateerde effecten op respiratoire weefsels mogelijk. Een normale klopfrequentie voor de cilia die de grens vormen van de bovenste en onderste luchtwegen is belangrijk om te beschermen tegen luchtweginfecties 10. Elke geciliale cilindrische epitheelcel van het respiratoire epitheel heeft 200-300 cilia die kloppen met een bepaalde frequentie om infectieuze agentia of ingeademde deeltjes in het slijm vrijgegeven door verspreide slijmklieren te elimineren 11. CS bevat chemicaliën die het ciliaire kloppen kunnen remmen 12, wat leidt tot een verminderde bescherming van de luchtwegen. Dit werk laat zien dat ciliair kloppen kan worden gemeten in organotypische weefselmodellen. Deze benadering maakt het mogelijk te beoordelen of epitheliale cellen hun normale functie vertonen in de organotypische weefselcultuur. CS activeert ook xenobiotische metabolismeresponsen in de luchtwegen om tabaksrookconstituenten te metaboliseren 13. De activiteit van de fase I xenobiotische metabolisme-enzymen, CYP1A1 en CYP1B1, van de weefselmodellen kan worden gemeten. Bovendien, zoals eerder gerapporteerd, kan globale genexpressie worden gemeten in de organotypische bronchiale weefselmodellen 6,14,15. Een transcriptomische gegevens- en netwerkgebaseerde systeembicologie-benadering wordt gebruikt om de impact van CS op xenobiotisch metabolisme te beoordelen 15.
De methodologieën die worden gebruikt om organotypische 3D bronchiale en nasale weefselmodellen bloot te stellen aan hoofdstroom CS met behulp van een in vitro blootstellingssysteem en om de weefselreacties op deze blootstelling te meten in vergelijking met blootstelling aan verse lucht (controle) worden hier gedetailleerd beschreven.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-human fibroblasts-bronchia</td><td>Epithelix S&aacute;rl, Geneva, Switzerland</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute;rl, Geneva, Switzerland</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr><tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&amp;R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F reference cigarette</td><td>University of Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr><tr><td>30-port carousel smoking machine SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CiliaMetrix camera and software</td><td>La Haute &Eacute;cole de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMIL microscope&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick Electrode STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr><tr><td>EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin Detection Reagent&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyser Instrument&nbsp;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&amp;type=product&amp;id=66</td><td></td></tr><tr><td>chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip High throughput 3&rsquo;IVT Express Kit</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van organotypische 3d bronchiale en neusweefsel cultuur modellen naar whole sigarettenrook

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Sigarettenrook (CS) heeft een grote impact op de longbiologie en kan leiden tot de ontwikkeling van longziekten zoals chronische obstructieve longziekte of longkanker. Om de onderliggende mechanismen van ziekteontwikkeling te begrijpen, zou het belangrijk zijn om de impact van CS-blootstelling rechtstreeks op longweefsels te onderzoeken. Deze benadering is echter moeilijk te implementeren in epidemiologische studies omdat longweefselbemonstering complex en invasief is. Alternatief kunnen weefselkweekmodellen de beoordeling van de impact van blootstelling op het longweefsel vergemakkelijken. Gedompelde 2D-celculturen, zoals normale humane bronchiale epitheliale (NHBE) celculturen, zijn traditioneel voor dit doel gebruikt. Ze kunnen echter niet direct worden blootgesteld aan rook op een vergelijkbare manier als de in vivo blootstellingssituatie. Recent ontwikkelde 3D-weefselkweekmodellen weerspiegelen de in vivo situatie beter omdat ze kunnen worden gekweekt op de lucht-vloeistofinterface (ALI). Hun basale zijden zijn ondergedompeld in het kweekmedium; terwijl hun apicale zijden aan lucht worden blootgesteld. Bovendien vertegenwoordigen organotypische weefselculturen die verschillende soorten cellen bevatten, beter de fysiologie van het weefsel in vivo. In dit werk wordt het gebruik van een in vitro blootstellingssysteem gedemonstreerd om humane organotypische bronchiale en nasale weefselmodellen bloot te stellen aan mainstream CS. Ciliaire klopfrequentie en de activiteit van cytochroom P450's (CYP) 1A1/1B1 werden gemeten om functionele effecten van CS op de weefsels te beoordelen. Verder werden, om CS-geïnduceerde veranderingen op moleculair niveau te onderzoeken, genexpressieprofielen gegenereerd uit de weefsels na blootstelling. Een lichte toename van CYP1A1/1B1-activiteit werd waargenomen in door CS blootgestelde weefsels vergeleken met door lucht blootgestelde weefsels. Een netwerk- en transcriptomics-gebaseerde systeeembenadering bleek voldoende robuust om CS-geïnduceerde veranderingen in xenobiotische stofwisseling aan te tonen die vergelijkbaar waren met die welke werden waargenomen in bronchiale en nasale epitheliale cellen verkregen van rokers.

In onderstaande resultaten beschreven, de organotypic weefsels waren primaire menselijke epitheelcellen geïsoleerd van gezonde, niet-roken, blanke donoren en werden opgelost met behulp van fibroblasten 15. 3D bronchiale en neusweefsel modellen In vitro bronchiale en nasale organotypische modellen lijken op celniveau de menselijke luchtwegen epitheel (figuur 2). CS blootstelling Organotypische bronchiale en neusweefsel modellen kunnen herhaaldelijk worden blootgesteld aan mainstream CS aan de lucht-water grensvlak. De belichting rook experimentele procedure voor de resultaten hier weergegeven is in Figuur 1. Opname van ciliaire kloppend Cilia slaan werd opgenomen in de weefsels lucht blootgesteld zoals in de video. CS blootstelling werd geassocieerd met een vermindering van de ciliaire slaan frequentie: hoe sterker piek rond waargenomen4 Hz in de sham blootgesteld en vóór blootstelling is niet langer na CS blootstelling (figuur 3) waargenomen. Dit verminderde frequentie zou de trilharen maken verslaan minder efficiënt om slijm en ziekteverwekkers 22 verwijderen. Meting van TEER en CYP1A1 / 1B1 activiteit TEER werd gemeten 48 uur na de laatste blootstelling aan ervoor te zorgen het weefsel is nog steeds functioneel. CYP1A1 / 1B1 activiteit werd gemeten 48 uur na afloop van blootstelling in figuur 1. De TEER waarden in het CS-blootgestelde weefsels waren niet significant verschillend in vergelijking met de lucht blootgestelde weefsels bevestigd dat er geen grote cytotoxisch effect van rook bij deze concentratie. Op 48 uur na blootstelling werd CYP1A1 / 1B1 activiteit van de weefsels iets toegenomen, hetgeen een bescheiden toename van weefsel afweermechanisme na belichting (figuur 4). Genexpressie profielen en netwerk-gebaseerde systemen biologie aanpak om de impact van CS blootstelling op de wijziging van xenobiotisch metabolisme Weefsels werden verzameld op 48 uur na blootstelling tijdstippen. Vervolgens werd microarray analyse om gen-expressie profielen van de CS- en weefsels lucht blootgestelde genereren. Impact van de CS blootstelling aan lichaamsvreemde metabolisme werd onderzocht met behulp van een netwerk-gebaseerde systeembiologische aanpak leveraged van het gen-expressie profielen en zoals eerder 15 gemeld. Met een netwerkgebaseerde Systeembiologische analyse blijkt dat CS blootstelling effecten op het niveau van backbone knooppunten in het xenobiotisch metabolisme netwerkmodel goed gecorreleerd tussen de in vitro en in vivo datasets (figuur 5). Daarentegen, op het niveau van elke afzonderlijke veranderingen genexpressie, slechte correlatie waargenomen tussen de in vitro (CS-blootgestelde versus lucht blootgesteld) en in vivo (rokers versus niet-rokers). Figuur 1. Schematische voorstelling van de herhaalde blootstelling van CS naar de organotypische bronchiale weefsel modellen Afkortingen:. CYP, cytochroom P450; CS, sigarettenrook; TEER, transepithele elektrische weerstand. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Figuur 2. Organotypische bronchiale en nasale epitheelweefsel cultuur modellen. Cartoon illustratie van de bronchiale (A) en nasale (B) weefselkweek insert in de lucht-water grensvlak. De in vitro modellen die haarcellen in de apicale laag van de hematoxyline &amp; eosine gekleurde cellen (C bronchiale, D voor nasale) zoals eerder 15 beschreven. De modellen werden samen gekweekt met fibroblasten die belangrijk zijn<html> voor de groei en differentiatie van epitheelcellen (aangegeven door pijlen). Kleuring van de luchtwegen lineage markers: P63 (E voor bronchiale, F voor nasale) en MUC5AC (G voor bronchiale, H voor nasale) getoond zoals eerder 15 gemeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Figuur 3. Cilia slaan frequentie. Cilia kloppende frequentie (CBF) werd gemeten in lucht blootgesteld en in de kweek vóór en na blootstelling. Verminderde CBF werd gezien na CS blootstelling (representatieve resultaten van twee insert worden getoond als herhaalde 1 (R1) en repliceren 2 (R2)). ad / 52.325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Meting van CYP1A1 / CYP1B1 activiteit en TEER. Left panelen geven de CYP1A1 / CYP1B1-activiteit in de bronchiale (A) en nasale (B) weefselmodellen. Rechts panelen geven de TEER meting in het bronchiale (C) en nasale (D) weefselmodellen. Gemiddelden ± SD worden getoond. Afkortingen: CS, sigarettenrook; CYP, cytochroom P450; TEER, transepithele elektrische weerstand; RLU relatieve luminescense unit. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Figuur 5. Netwerkgebaseerde Systeembiologische analyse van de effectbeoordeling van CS blootstelling in de context van xenobiotische metabolisme. De veranderingen van gen expressie niveaus werden gebruikt om de activering van ruggengraatknooppunt van de lichaamsvreemde Metabolisme netwerkmodel (A) berekenen </<html> strong&gt; zoals gerapporteerd in een eerdere publicatie 15. De figuur rechts illustreert het concept van de kwantificering van de backbone knooppunten, ook wel bekend als &quot;differentiële netwerk backbone waarde,&quot; met behulp van de NPA aanpak. De blauwe ovalen geven de activiteit van de backbone knooppunten (bijv., De functionele laag) en de groene ballen vertegenwoordigen de expressie van genen (bijv., De transcriptionele laag). Effecten van CS blootstelling in organotypische bronchiale weefsels (in vitro, CS belichte versus lucht blootgesteld) en 48 h postexposure werden vergeleken met die van roken op humane bronchiale epitheel van bronchoscopie en nasale epitheelcellen verzameld door burshing de inferieure turbinate (GSE16008 ) (in vivo, rokers versus niet-rokers) (B). Bijvoegsels, correlatie van de genexpressie verandert tussen de in vitro en in vivo datasets. Afkortingen: CS, sigarettenrook; NPA, netwerk verstoring amplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Het doel van dit protocol is om humane organotypische 3D bronchiale en nasale weefselmodellen bloot te stellen aan mainstream sigarettenrook (CS) bij de lucht-vloeistofinterface. De impact van CS op de weefsels wordt vervolgens onderzocht met behulp van een cytochrome P450 activiteitsassay, een trilhaarcellenmeting en een systeembiologie-aanpak.

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Het algemene doel van deze procedure is om de impact te beoordelen van herhaalde blootstelling van organotypische 3D bronchiale en nasale weefselkweekmodellen aan volledige sigarettenrook. Dit wordt bereikt door eerst organotypische, bronchiale en nasale weefselkweekmodellen te kweken bij de lucht-vloeistofmassa-interface. De tweede stap is het genereren van een aerosol met een rookmachine en het blootstellen van de weefselculturen volgens het experimentele ontwerp in een blootstellingssysteem.Vervolgens wordt de impact van de blootstelling beoordeeld door de frequentie van het ciliaire kloppen en de integriteit van het weefsel van de cultuur te meten. De laatste stap is het meten van de transcriptoomuitwisselingen die worden geïnduceerd door de aerosol met behulp van microarray-technologie. Uiteindelijk worden netwerkgebaseerde systemenbiologiebenaderingen gebruikt om de impact van volledige sigarettenrook op de weefselcultuur te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden in de respiratoire toxicologie is dat de benaderingen zijn afgestemd op de vereisten van regelgevende instanties om alternatieven te vinden voor dierproeven, ze maken de beoordeling mogelijk van de effecten van kortdurige blootstelling aan sigarettenrook op cellen die worden gekweekt bij de lucht-vloeistofmassa-interface, waardoor de omstandigheden worden nagebootst die zich voordoen in de menselijke luchtwegen. Om het experiment te beginnen, voegt u 0,7 milliliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put van een steriele 24-welplate. Vervolgens verwijdert u de weefselverpakking en brengt u de weefselkweekinserts over naar de vers bereide 24-welplate.Bewaar de weefselkweek in een incubator en ververs het medium elke twee dagen tijdens de mediumwissel. Onderzoek de weefsels onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van besmetting en dat er geen lekkage van medium is. Drie dagen vóór de blootstellingsexperimenten spoelt u de apicale zijde van de weefselkweek met 200 microliter kweekmedium.Vervolgens verwarmt u de klimaatkamer van het in vitro-systeem en de kweekbasismodule tot 37 graden Celsius. Nadat het is verwarmd, vult u de kweekbasismodule met 17,5 milliliter medium per rij. Verwijder de weefsels uit de incubator en breng de weefselkweekinserts over van de kweekplaat naar de kweekbasismodule van het in vitro-blootstellingssysteem.Bedek vervolgens de kweekbasismodule met een glazen deksel. Breng de weefsels over in de klimaatkamer voor blootstelling aan hoofdstroom sigarettenrook of cs. Genereer sigarettenrook met behulp van een gekalibreerd rookmachine met 30 poorten.Roken de sigaretten tot een standaard maar lengte van ongeveer 35 millimeter bij 55 milliliter. Een trek duurt twee seconden, twee keer per minuut en een afzuigtijd van acht seconden. De gegenereerde hoofdstroom sigarettenrook wordt opgehoopt en vrijgelaten in het in vitro-blootstellingssysteem.Stel de weefsels bloot gedurende zes tot zeven minuten. Nadat u de weefsels terug heeft overgebracht naar een kweekplaat, plaatst u ze één uur terug in de incubator. Verwijder de weefselkweekplaten uit de incubator en laat ze 30 minuten onder de kap op kamertemperatuur om de CLIA-klopfrequentie te stabiliseren.Na stabilisatie observeert u de weefsels onder een lichtmicroscoop die is aangesloten op de cliometrische software. Vervolgens registreert u de frequentie van het ciliaire kloppen, de frequentie elke drie seconden gedurende één minuut, gedurende 48 uur. Na de blootstelling voegt u 200 microliter kweekmedium toe aan de apicale zijde van de humane bronchiale epitheelweefsels en meet u de weerstand van het weefsel door een stokje-elektrode in het basale medium en in het nieuw toegevoegde medium aan de apicale zijde van de weefselkweek te steken zonder het weefsel aan te raken.Na de metingen verwijdert u voorzichtig het medium van de apicale zijde van de weefselculturen met behulp van een pasterpipet dat is aangesloten op een vacuümpomp en brengt u de weefsels terug naar de incubator. Om de enzymatische activiteit van cytochroom P vier 50 te meten, bereidt u een nieuwe plaat voor met eerder bereid Lucifer en CEE-substraat en brengt u de inserts over naar die plaat, bedekt en incubeert u de weefselinserts een nacht.Voeg vervolgens 50 microliter Lucifer-detectiereagens toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Zodra de incubatie is voltooid, meet u de luminescentie met de luminometer. Verzamel de plaat met 3D organotypische weefselinserts uit de incubator en was elke insert op de plaat drie keer met koud PBS en aspireer de PBS met een pastpijpje tussen de wasbeurten.Na de laatste wasbeurt aspireert u de PBS en bedekt u de plaat om te voorkomen dat de insert uitdroogt. Vervolgens snijdt u de insertmembraan voor elke insert uit de plaat totdat het membraan plat op de kling ligt. Breng het weefsel van de kling over naar de homogeniseerbuis en schroef het deksel op de buis.Schud het, vortex het en plaats het op droog ijs. Ontdooi en vermaal de monsters met het homogeniseerinstrument bij 6.000 RPM gedurende 45 seconden. Laat het vijf minuten op kamertemperatuur staan en voeg vervolgens 140 microliter chloroform toe aan het monster en vortex het opnieuw gedurende 15 seconden.Breng het hele monster van de homogeniseerbuis over in een faseslotbuis. Plaats het op een thermo shaker en schud het gedurende twee minuten bij 1400 RPM op kamertemperatuur. Laat het vervolgens twee minuten op kamertemperatuur staan.Zodra het schudden is voltooid, centrifugeert u de buis gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius bij 12.000 G. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter. Volg met RNA-precipitatie, wassing, suspensie en zuivering. Eenmaal geëxtraheerd, worden de RNA's op kwaliteit gecontroleerd.Om de hoeveelheid en integriteit te beoordelen, bereidt u het vloeistofbehandelingssysteem en de doelsynthese voor. Plaats het geëxtraheerde RNA. De platen en alle benodig

impact-assessment-repeated-exposure-organotypic-3d-bronchial-nasal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren, kweken en het blootstellen van deze cellen om te mainstream sigarettenrook, om moleculaire reacties studie om deze milieu-toxine.

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

Het doel van dit protocol is om geautomatiseerde methoden te bieden om chronische longpathologieën te kwantificeren in een muismodel van COPD. Het protocol omvat het blootstellen van muizen aan sigarettenrook (CS), het meten van longfunctie, het opblazen van de longen en het gebruik van morfometrische methoden om emfyseem en kleine luchtwegremodellering bij muizen te meten.

Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen

Elektronische sigaret (e-cig) gebruikers zijn toeneemt wereldwijd. Weinig, echter is bekend over de effecten op de gezondheid geïnduceerd door geïnhaleerde e-cig aërosolen. Dit artikel beschrijft een e-cig aërosol generatie techniek geschikt voor dierlijke blootstellingen en latere toxicologische studies. Dergelijke protocollen moeten experimenteel reproduceerbaar en gestandaardiseerde e-cig blootstelling systemen opzetten.

Generatie van elektronische sigaret aërosol door een apparaat van de derde-generatie-Machine-Vaping: toepassing op toxicologisch onderzoek

We presenteren een robuust, overdraagbaar en voorspellend in vitro blootstellingssysteem voor de screening en monitoring van deeltjes in de lucht met betrekking tot hun acute longcytotoxiciteit door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de lucht-vloeibare interface (ALI).

Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface

Hier beschreven is een protocol om te bestuderen hoe sigarettenrook extract bacteriële kolonisatie in longepelliële cellen beïnvloedt.

Het bestuderen van effecten van sigarettenrook op pseudomonas infectie in longepitheelcellen

Beschreven is de celkweek en blootstellingsmethode van een in vitro bronchiaal model voor realistische, herhaalde inhalatieblootstelling aan deeltjes voor toxiciteitstests.

Een lucht-vloeistof interface bronchiale epitheel model voor realistische, herhaalde inhalatie blootstelling aan deeltjes in de lucht voor toxiciteit testen

Dit protocol toont de studie van de pathofysiologische effecten van sigarettenrook (CS) met een in eigen huis gebouwd inhalatiesysteem (WBI) voor het hele lichaam (WBIS). Dit systeem kan dieren blootstellen aan CS onder gecontroleerde herhaalbare omstandigheden voor onderzoek naar CS-gemedieerde effecten op longemfyseem en hematopoiese.

Blootstelling aan sigarettenrook bij muizen met behulp van een inhalatiesysteem voor het hele lichaam

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

Leer het effect van herhaalde sigarettenrookblootstelling op organotypische 3D bronchiale en neusweefselmodellen. Deze methode meet trilhaarfrequentie en transcriptoomveranderingen voor toxicologisch onderzoek.

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook (Video) | JoVE Journal

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Meer video's verkennen