Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Het algemene doel van deze procedure is om twee in vitro ontwikkelingstoxiciteitstestsystemen te beschrijven op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoomstudies. Dit wordt bereikt door eerst menselijke embryonale stamcellen te kweken op muis-embryonale fibroblasten. De tweede stap is om de menselijke embryonale stamcellen ofwel Embry-lichamen te laten vormen waarin ze cellen van alle drie de kiembladen kunnen genereren, of om ze te differentiëren in neuroectodermale progenitoren.

Vervolgens worden de embryolichamen of neuroectodermale progenitoren behandeld met verbindingen van belang in verschillende concentraties tijdens de differentiatie. De laatste stappen zijn om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen en het RNA te isoleren. Uiteindelijk wordt transcriptoom-microarray-analyse gebruikt om de veranderingen in RNA-expressie van cellen te tonen die zijn behandeld met een verbinding van belang in vergelijking met niet-behandelde controlecellen. Op basis van menselijke neonic-stamcellen en DNA-macrogebieden hebben we een in vitro-methodologie ontwikkeld die het mogelijk maakt om menselijke relevante ontwikkelingstoxiciteitseffecten te volgen.

De methodologie kan worden toegepast door de farmaceutische en chemische industrie voor veiligheidsscreening van potentiële geneesmiddelen en omgevingstoxicanten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingstoxiciteit te beantwoorden, zoals het effect van chemicaliën op de zeer vroege neuro-ontwikkeling. Om te beginnen, ontdooi het stamcelmediumsupplement bij kamertemperatuur en voeg 100 milliliter ervan toe aan 400 milliliter van het basale stamcelmedium.

Ontdooi vervolgens de basementmembraanmatrix op ijs en voeg vervolgens het aangevulde volume matrix toe aan 24 milliliter gekoeld dmm. F 12 basaal medium zoals aanbevolen door de fabrikant, meng een oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren en voeg vervolgens twee milliliter van het mengsel toe aan 12 afzonderlijke zes centimeter platen. Bewaar de platen bij kamertemperatuur gedurende een uur terwijl de matrix de platen bedekt.

Verwijder vervolgens het medium en voeg twee milliliter stamcelmedium toe. Verwijder vervolgens vier confluente platen uit de incubator die menselijke embryonale H negen cellen bevatten die zijn gekweekt op muis-embryonale fibroblasten die zijn voorbereid zoals beschreven in het bijbehorende protocol in de tekst onder een stereoscoop, gebruik een een milliliter pipettetip en verwijder de gedifferentieerde kolonies van de plaat.

Ongedifferentieerde kolonies hebben goed gedefinieerde randen en cellen zijn compact, terwijl gedifferentieerde cellen beginnen uit te groeien vanaf de randen en hun cellen zijn groter van formaat. Amputeer het medium en was de cellen met vier milliliter PBS. Voeg vervolgens twee milliliter stamcelmedium toe met de acht van een stereoscoop.

Snij de kolonies in stukken van zes tot negen stuks met een 26 gauge naald en schraap de klonten met een milliliter pipettetips. Verzamel de gesneden kolonies voorzichtig in een 50 milliliter falconbuisje en pellet ze bij 200 G gedurende vijf minuten. Zuig vervolgens de snatra op en resuspendeer de cellen in 12 milliliter stamcelmedium.

Plaats 20 microliter van de celsuspensie op een glazen plaatje en tel het aantal klonten onder de microscoop. Pas de concentratie van de suspensie aan op 150 klonten per milliliter en voeg vervolgens twee milliliter van de suspensie toe aan elke zes centimeter plaat. Beweeg de platen heen en weer en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen en bewaar de platen vervolgens om de dag in een celkweekincubator.

Ververs voorzichtig het medium Na het verwijderen van de gedifferentieerde kolonies, voeg 40 microliter van een steriele 5% blokcopolymeeroplossing toe aan elk putje van een Vbo 96-putjesplaat en laat het 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verwijder een confluente plaat met kolonies uit de incubator en pluk eventuele gedifferentieerde kolonies uit onder een stereomicroscoop met een een milliliter pipettetip. Amputeer vervolgens het medium van de plaat en was de cellen voorzichtig met vier milliliter PBS.

Voeg vervolgens twee milliliter willekeurig differentiatiemedium toe aan elke plaat. Gebruik het overloopgereedschap om de H negen-celkolonies in klonten van uniforme grootte te snijden. Schraap de klonten met een celschraper en verzamel ze voorzichtig in een 50 milliliter falconbuisje centrifuge.

De klonten worden gecentrifugeerd bij 200 G gedurende vijf minuten en vervolgens wordt de snatra opgezogen en worden de cellen en het willekeurige differentiatiemedium resuspendeerd bij 1000 klonten per milliliter. Zuig vervolgens het blokcopolymeer uit de V-vormige 96-putjesplaat met behulp van een meerkanaalspipet en voeg 100 microliter van de klontensuspensie toe aan elk putje. Aggregeer de klonten naar de bodem van de V-vormige putjes door de plaat gedurende vier minuten bij vier graden Celsius en 400 G te centrifugeren. Plaats vervolgens een plaat in de incubator gedurende vier dagen met behulp van bredere 200 microliter tips. Verwijder de embryolichamen van de 96-putjesplaat en plaats ze in een steriele 122 millimeter vierkante plaat.

Gebruik vervolgens een 10 milliliter steriele serologische pipet om de embryolichamen van de vierkante plaat over te brengen naar een 15 milliliter falconbuisje. Laat de embryolichamen twee minuten bezinken en zuig vervolgens de snatra op en was de embryolichamen met vijf milliliter PBS. Wacht weer twee minuten tot de embryolichamen bezinken en zuig vervolgens de supernatant op.

Resuspendeer de embryolichamen dit keer in vijf milliliter willekeurig differentiatiemedium. Breng vervolgens de embryolichamen over naar een 10 centimeter bacteriologische plaat en voeg nog eens 10 milliliter willekeurig differentiatiemedium toe. Bewaar de platen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 op een horizontale shaker.

Bij 50 RPM worden de representatieve embryolichamen getoond voor dag vijf, dag negen en dag 14. Ververs voorzichtig het medium om de dag, vervang alle 15 milliliter door vers willekeurig differentiatiemedium. Om het effect van een geneesmiddel op differentiatie te beoordelen, begin met het toevoegen van het geneesmiddel aan het medium op dag vijf gedurende 10 dagen zoals beschreven