Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor gelokaliseerde Histopathologisch Analyse: Part 2 Epiretinal Implantaten met Retina Kopspijkers

Retinale prothesen met harde metalen componenten zijn niet compatibel met traditionele histologische processen. Hier beschrijven we technieken voor het beoordelen van de gezondheid van het oog direct grenzend aan een retinaal implantaat dat epiretinaal is gefixeerd met een metalen T. Dit wordt bereikt door het oog eerst te nucleëren en te fixeren volgens het protocol dat wordt beschreven in een bijbehorende video, en vervolgens een weefselmonster te dissecteren dat het implantaat en de retinale T bevat. De tweede stap is om het weefselmonster geleidelijk te dehydrateren en vervolgens in een epoxyhars in de gewenste oriëntatie in te bedden met behulp van een tweestaps-inbeddingsproces. Vervolgens wordt het uiteindelijke harsblok in een speciale houder gemonteerd en stapsgewijs afgeslepen totdat een dwarsdoorsnede door het implantaat en het omringende oculaire weefsel op het gewenste niveau is blootgelegd.

De laatste stap is het oppervlakte-kleuren van het blootgestelde weefsel, waarna beelden en foto's worden gemaakt met een dissectiemicroscoop bij hoge vergroting om de cellulaire architectuur naast de geïmplanteerde prothese te visualiseren. Deze stappen worden vervolgens meerdere keren herhaald indien nodig. Uiteindelijk wordt een reeks dwarsdoorsneden van het weefselmonster verzameld, inclusief het implantaat in situ, die gebruikt kunnen worden om het ontwerp van het apparaat of de chirurgische ingreep te verfijnen, evenals om te helpen bij het beoordelen van de veiligheid van de specifieke prothese.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele histologie op basis van snijden met een mesje, is dat in het hart geïmplanteerde objecten, inclusief metalen componenten, in situ kunnen blijven tijdens de procedure, waardoor visualisatie van de interface tussen implantaat en weefsel mogelijk is. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van retina-prothesen beantwoorden, zoals het beoordelen van de structurele integriteit van het delicate oogweefsel grenzend aan een geïmplanteerde retina-prothese. Na enucleatie van het oog en fixatie zoals beschreven in een bijbehorende JoVE-video, visualiseert u het implantaat en het punt waarop het aan de buitenkant van het oog is bevestigd.

Gebruik een mesje van 15 graden. Maak een circumferentiële transcorneale incisie en verwijder de cornea-cap om het binnenste van de oogbol bloot te leggen. Let op dat de lens eerder is verwijderd tijdens de lensectomie-vitrectomie, wat deel uitmaakt van de chirurgische procedure voor dit epiretinale implantaat.

Dissekeer vervolgens de iris en eventuele resterende Zonule-vezels van de lens om de achterste kamer met het epiretinale implantaat en de metalen T in situ bloot te leggen. Afhankelijk van het implantaat en de uitgevoerde studie worden overbodige componenten verwijderd voordat de dissectie wordt voortgezet. In het huidige voorbeeld bestaat de geëvalueerde epiretinale array uit een prototype hermetisch, diamanten elektrode- en elektronicapakket dat is ondergebracht in een conforme siliconen drager.

Disseceer zorgvuldig een monster dat de tack en het omringende weefsel in de gewenste oriëntatie bevat. Gebruik fijne dissectiescharen om stroken over de volledige dikte uit de achterzijde van het oog te knippen, inclusief de sclera, choroidea en retina. Extraheer hierna het diamant-elektrodepakket zorgvuldig door middel van fijne dissectie met het scalpel.

Laat het siliconen lichaam van het implantaat samen met de retinale hechting en de resten van de platina bedrading ter plaatse. Neem een monster dat een longitudinale dwarsdoorsnede van de hechting geeft, waarbij alle retinale lagen grenzend aan de hechting zichtbaar zijn. Plaats het monster vervolgens terug in 70% Ethanol.

Dehydrateer het monster gedurende drie dagen in opeenvolgende ethanolstappen. Dehydrateer het monster eerst twee keer gedurende twee uur in 70%ethanol. Dehydrateer het monster vervolgens twee keer gedurende twee uur in 80%ethanol, en daarna de volgende dag gedurende de nacht. Dehydrateer het monster vervolgens twee keer gedurende twee uur in 90%Ethanol, waarna het monster twee keer gedurende twee uur en vervolgens gedurende de nacht gedehydrateerd wordt in 100%ethanol.

Dehydrateer het monster ten slotte twee keer gedurende twee uur in 100% acetone. Verwijder het monster uit de acetone en observeer het onder een lichtmicroscoop terwijl het aan de lucht droogt bij kamertemperatuur. Het verwijderen van vloeistof uit het zachte weefsel leidt tot het inklappen van cellen en krimp.

Het monster wordt overgebracht naar epoxy vlak voordat het begint te krullen en in te zakken. Het inschatten van wanneer het krullen en inzakken van het weefsel optreedt, wordt met ervaring ontwikkeld. Om het monster in transparante epoxyhars in te bedden, wordt het oogweefsel ondergedompeld in vloeibare epoxy in een geschikte afsluitbare houder.

Ontgas de epoxy voorzichtig in een vacuümkamer en laat deze een nacht bij kamertemperatuur uitharden. Zorg ervoor dat het monster in de gewenste oriëntatie wordt ingebed door de uitgeharde epoxy en het monster met een lintzaag en schuurpapier op maat te brengen. Bed het op maat gemaakte blok met het oogweefsel in verse vloeibare epoxy, zodanig dat de lange as van de tack parallel aan de bodem van de mal is georiënteerd. Gebruik een druppel secondelijm om het op maat gemaakte monster aan de bodem van de monsteraanhanger te bevestigen.

Vul de monsterhouder met vloeibare epoxy en ontgas deze zoals voorheen; laat het geheel een nacht uitharden. Plaats de hars vervolgens in een houder voor het slijpen van monsters en slijp het monster handmatig bij 230 tot 250 RPM met waterkoeling met behulp van siliciumcarbidepapier. Dompel voor de kleuring het geslepen oppervlak drie tot vijf minuten in toine-blauw kleurstof, of totdat de kleuring zich heeft ontwikkeld.

Nadat het monster is afgespoeld met kraanwater, wordt het geslepen oppervlak van het specimen gefotografeerd met een dissectiemicroscoop bij een hogere vergroting. Om de cellulaire lagen van het netvlies te visualiseren, wordt een druppel gedestilleerd water op het bovenoppervlak van de epoxy direct boven het specimen aangebracht om de diffractie op de grensvlak tussen lucht en epoxy te minimaliseren.

Gebruik een optische vezel-zwanenhalslichtbron om het monster te verlichten. Herhaal de slijp- en beeldvormingsstappen telkens nadat een vooraf ingestelde dikte van het monster is weggeslepen. Het minimale precieze en reproduceerbare slijpinterval van de monsterhouder is 20 microns.

Dit proces wordt stapsgewijs herhaald totdat een dwarsdoorsnede door het implantaat en het omringende oogweefsel op het gewenste niveau is blootgelegd. Hier zijn voorbeeldbeelden van retinaweefsel dat direct naast een titanium retina T is gevisualiseerd op verschillende punten tijdens het slijpproces. De beelden tonen longitudinale doorsneden van de tack die door het oog dringt en de sclera verlaat, grenzend aan silicone en toluidineblauw gekleurde en ongekleurde retina.

Niet-artefactuele netvliesloslating en plooiing zijn zichtbaar aan weerszijden van de siliconen, zowel bij lage als hoge vergroting. De schacht van de hechting is zichtbaar ingebed in de siliconen, en de kop van de hechting is door het netvlies en de sclera gedrongen. Hier is duidelijk dat er sprake is van niet-artefactuele netvliesloslating in het niet-gekleurde netvlies aan weerszijden van de siliconen, gevisualiseerd bij zowel lage als hoge vergroting.

Het voorbeeld heeft aangetoond dat er retinale desorganisatie optreedt nabij de hechting en dat er aan één zijde compressie van het netvlies is door een schuine insertiehoek. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het monster zorgvuldig in te bedden, te oriënteren en in te gieten, zodat de resulterende geslepen oppervlakken in het gewenste vlak liggen. Daarnaast moeten er bij elke slijpfase meerdere foto's worden gemaakt, aangezien de geslepen monsters achteraf niet meer hersteld kunnen worden.

Deze methode kan inzicht bieden in de histologie van retinaprostheses. Deze kan ook worden toegepast om de interface tussen het apparaat en het weefsel te visualiseren in andere systemen die gebruikmaken van harde geïmplanteerde componenten, zoals diepe hersenimplantaten, vasculaire stents of orthopedische prostheses.