Name: Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer een methode voor respirometrische analyse van mitochondriën geïsoleerd uit spierweefsel verkregen door percutane naaldbiopsie. Deze techniek vereist slechts 20 mg weefsel en is geschikt voor klinisch onderzoek naar mitochondriale dysfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, bedanken voor de nuttige discussies; mevrouw Karin Murphy, mevrouw Heather Gregory en de heer John Stone, allemaal van Wake Forest School of Medicine, voor de nuttige technische assistentie bij de ontwikkeling van dit protocol.

OPMERKING: De beschreven werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Wake Forest School of Medicine protocol. Geïnformeerde toestemming werd verkregen schriftelijk. Alle deelnemers waren gezonde oudere volwassenen (65-79 jaar) van beide geslachten, met BMIs variërend 23-35. 1. Skeletal spierbiopsie <ol><li> Zoals eerder beschreven, 9 voer alle biopsies in de vroege ochtend na een O / N fast. Vraag de onderwerpen afzien van aspirine, recept en over-the-counter niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen of andere verbindingen die bloeden, bloedplaatjes of kneuzingen kunnen beïnvloeden de week voor de biopsie. Vraag de deelnemers om ook onthouden van elke inspannende activiteit voor ten minste 36 uur voorafgaand aan de biopsie. OPMERKING: Spier verkregen uit de vastus lateralis met de percutane naald biopsie techniek een percutane naald onder plaatselijke verdoving met 1% lidocaïne. Geen medische complicaties of other gemelde bijwerkingen van de procedure hebben voorgedaan in onze klinische onderzoekseenheid. </li><li> Opmerking: De beschreven biopsie procedure wordt aangepast van die van Bergstrom 10. <ol><li> In het kort, lokaal toe te dienen 1% lidocaïne verzorgen de spieren niet te infiltreren. Volg deze met een 10 minuten wachttijd om voldoende verdoving toe. </li><li> Neem de biopten uit de buik van de spier (de middelste gebied van de spier tussen het inbrengen en herkomst) vermijden subfascial en myotendonous gebieden. <ol><li> Gebruik percutane naald (een zuig bijgestaan ​​herbruikbare apparaat met een kant snijden raam en innerlijke snijden cilinder) en volgen een fasciaal &quot;pop&quot; of weerstand van de fascia als een gids. </li><li> Schat de diepte van de anesthesie naald, dan weer het gevoel dat het met de smalle scalpel en maak een 4-5 mm incisie door de fascia. Vooraf de naald door de incisie totdat deze in de spier geplaatst. </li><li> Verzamelenmeerdere monsters met het raam gedraaid in verschillende richtingen. Solliciteer continue zuigkracht met een 60 cc spuit en bevordert tegelijk of intrekking van spieren monsters in de percutane naald twee tot vier keer in verschillende richtingen. Staak de zuig- en verwijder de naald. OPMERKING: Elke pas (inbrengen en verwijderen van de naald) dient minder dan een minuut duren. </li><li> Laat een helper van toepassing stevige druk op de bouwplaats te doorboren voor 5 min tot hemostase te vestigen. Koppel naald uit zuig slangen en verwijder voorzichtig de spieren monsters uit het raam en vat. </li></ol></li><li> Maak een tweede pas als er meer spieren nodig is door het proces te herhalen. </li><li> Verwijder alle zichtbare bloedstolsels van de spier monster met behulp van een tang, weegt het monster, en meteen plaatsen in een buisje met ijskoude DPBS. OPMERKING: De gemiddelde opbrengst met behulp van deze methode is 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Mitochondriale Isolatie &lt;ol&gt; <li> Vers bereiden Chappel-Perry (CP) en mitochondriale testoplossing (MAS) buffers (tabel 1) op de dag van het experiment of monster en bewaar ze bij -20 ° C. Bereid de verbindingen in dimethylsulfoxide in een concentratie van 2,5 mM en de hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. Gebruik de buffer en samengestelde monsters bewaard bij -20 ° C binnen de 2 maanden na de dag van de voorbereiding. </li><li> Verwijder zichtbare bindweefsel van het monster met behulp van een scherpe schaar en pincet; indien nodig gebruik een dissectie microscoop voor deze stap. Grondig te wassen exemplaren 3-4 keer met ijskoude DPBS buffer om bloed te verwijderen. Houd de monsters op ijskoude DPBS en het proces zo snel mogelijk, het verzorgen meer dan 45 min van biopsie niet te overschrijden. Neem voorzorgsmaatregelen om elk pezen of vetweefsel verwijder voorzichtig uit de spier monster. </li><li> Onmiddellijk Hak de spierweefsel in fijne stukjes met een steriele schaar en schorten in 500 pi tot 1 ml CPI met proteinase (Nagarse) bij een concentratie van 0,2 mg / g weefsel. Volg deze met een 5 min incubatie bij kamertemperatuur en vervolgens transfer naar het ijs. </li><li> Homogeniseer gehakt weefsel behandeld met Nagarse een geautomatiseerd homogenisator. Houd het monster op het ijs in dit hele proces. Homogeniseer elk weefselmonster vier keer, telkens met een puls van 2 sec, de geautomatiseerde homogenisator bij een snelheid van 10.000 rpm. Was de sonde met 70% ethanol en vervolgens met gedestilleerd water tussen de weefsels. </li><li> Was het gehomogeniseerde weefsel met een gelijk volume CP I (500 ui 1 ml) en 2x volume CP II (1 ml tot 2 ml), en de inhoud in een centrifugebuis en centrifugeer verzamelen bij 600 xg, 4 ° C 10 min. Passeren de bovenstaande vloeistof op een bevochtigd kaasdoek, het eluaat en gooi de pellet, waardoor het verwijderen van de meerderheid van de niet-mitochondriale fracties. </li></ol> 3. Het wassen van de mitochondriën <ol><li> Centrifugeer het supernatant van de bovenstaande stap 10,000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. Suspendeer de pellet in 4 ml CP II buffer en verder centrifugeer bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. LET OP: In zeldzame gevallen wordt een dunne pellet van bloed onder de mitochondriale pellet gevormd. In dat geval verwijdert u de mitochondriale pellet door behoedzame aspiratie met CPII buffer. Deze stap kan worden vermeden door grondig te wassen weg bloed bij stap 2. </li><li> Hang de pellet verkregen in 2 ml van CP I buffer. In dit stadium gebruik maken van een kleine hoeveelheid van deze suspensie voor eiwit schatting. Resuspendeer de resterende monster in CP I buffer en centrifuge zoals hierboven. Suspendeer de uiteindelijke pellet in een minimale hoeveelheid (200 ui) van Mitochondriale testoplossing (MAS). OPMERKING: Eiwit wordt getest in dit stadium omdat CP-buffer geen BSA, terwijl MAS waarbij de monsters later opgeschort heeft BSA in. </li></ol> 4. Schatting van de mitochondriale inhoud van meten eiwitconcentratie met een BCA Protein Assay Kit <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NB: Met deze concentratie de hoeveelheid mitochondriën voor het laden berekend op een 24-well microplaat voor respirometrische metingen of Western blot experimenten. Rekening houden met de verdunningsfactor (10) voor de berekening van de eiwitconcentratie. 5. Voer de XF testen zoals beschreven door Rogers, GW, et al. 12 OPMERKING: Visualiseer de O 2 verbruik (OCR) in pMol O 2 / min, of absolute niveaus van O 2 en pH in de data-uitgang. <ol><li> Gebruik 1x MAS bereiden van verbindingen te injecteren. Voeg een 10x concentratie van de verbindingen om de poorten AD een eindconcentratie als volgt: poort A, ADP [Adenosine 5&#39;-diphosphate, 2 mM, 50 gl]; poort B, oligomycin (2 uM, 55 pl); poort C, FCCP [carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon, 6 uM, 60 gl]; en poort D, 2 uM antimycin-A (65 pl). Bereidenvoldoende volume van verbindingen voor het vereiste aantal putten. </li><li> Bepaal de optimale hoeveelheid mitochondria door titratie. Bijvoorbeeld, lading 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug mitochondriën per putje in een 50 pl volume ijskoude 1x MAS substraat. De variabiliteit tussen de putten te minimaliseren, eerst verdunnen 10x mitochondriën in koud 1x MAS + substraat. Vervolgens leveren 50 ul van deze suspensie aan elk putje (behalve de achtergrond correctie putten). </li><li> Centrifugeer de plaat bij 2000 xg, 20 min bij 4 ° C. Na centrifugeren zachtjes voeg 450 ul van 1 x MAS + succinaat (10 mM) en rotenon (2 uM) (beginwaarden; zie hieronder) aan elk putje. Bekijk de mitochondriën onder de microscoop om homogene naleving van de put voordat ervoor te zorgen dat de overdracht van de plaat om de XF analyser. OPMERKING: De beginwaarden zal afhangen of de ademhaling wordt aangedreven door ofwel ETC complex I of complex II. Voor complexe-II gedreven ademhaling, gebruik succinate (10 mm) en rotenon (2 uM) als initiële condities. Rotenon blokken complex I en succinaat voorziet brandstof voor complexe II (succinaat dehydrogenase). Ademhaling aangedreven door complexe I studie Gebruik een pyruvaat en malaat, elk bij een eindconcentratie van 5 mM of glutamaat en malaat elk bij een eindconcentratie van 10 mM als beginwaarden. De laatste kan helpen bij het onderscheiden van disfunctie onder citroenzuurcyclus en transport substraat. Ademhaling gedreven door zowel complex I en complexe II studie, onder meer pyruvaat en succinaat zonder rotenon of malaat als beginvoorwaarden. Gebruik palmitoyl carnitine als substraat voor β-oxidatie. </li><li> Sequentieel meet de mitochondriale ademhaling in real time via de respirometer door het programmeren van het zoals eerder beschreven 12. Gebruik de instellingen voor de respirometer in Tabel 2. OPMERKING: Een korte uitleg van de verschillende mitochondriale ademhaling toestanden zijn: </li><li&gt; State 2 = gekoppelde toestand met substraat aanwezig; State 3 = fosforyleren ademhaling in aanwezigheid van verzadigende ADP; Staat 4 o = niet-fosforylerende ademhaling veroorzaakt door oligomycin; Staat 3u = maximale ontkoppeld ademhaling gestimuleerd door de ontkoppelrail FCCP; Resterend niet-mitochondriale ademhaling = respiratie van complex III remming door antimycin-A. Voorts zij opgemerkt dat de lengte van de OCR meting in combinatie met de mitochondriale concentratie de gegevens door uitputting zuurstof tijdens de meetperioden kunnen beïnvloeden. </li></ol> 6. Western Blot OPMERKING: Bepaal de mitochondriale marker COX IV en hele weefsel GAPDH- door Western blotting aan verrijking van de mitochondriën te verzekeren in de uiteindelijke steekproef <ol><li> Scheid de geïsoleerde mitochondria en hele weefsel extract met 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gels. </li><li> Overdracht van de eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.</li><li> Incubeer met COX IV antilichaam (1: 20.000), gevolgd door mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen. Voor GAPDH- vastberadenheid, strip de vlek en sonde met een GAPDH monoklonaal antilichaam (1: 2.000). OPMERKING: Als de verschillen in ER verontreiniging van belang zijn, zijn onder andere ER markers zoals ERp72, calnexin, of calreticuline in de analyse. </li></ol>

<ol><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity%3A+effects+of+EDTA+and+EGTA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392(2013).</li>
<li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li>
<li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li>
<li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317(2011).</li>
</ol>

De auteur, George Rogers, is een medewerker van Seahorse Bioscience die het instrument produceert dat in dit artikel wordt gebruikt. De Open Access-kosten werden ondersteund door Seahorse Biosciences.

Geïsoleerde mitochondria worden vaak gebruikt in studies die de rol van ETC functie en andere mitochondriale activiteiten, waaronder substraattransport en TCA cyclusfunctie onderzoeken. Respirometrische testen met behulp van geïsoleerde organellen toestaan ​​rechtstreeks onderzoek van de fundamentele processen van oxidatieve fosforylering en de intrinsieke eigenschappen van de ETC. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondria in vergelijking met gehele cellen of permeabel spiervezels heeft de voordelen van relatief eenvoudige interpretatie van de gegevens en de afwezigheid van &quot;storing&quot; van niet-mitochondriale processen of veranderingen in mitochondriale massa / biogenese. Normalisatie van geeft de mitochondriale eiwitgehalte, waardoor eenvoudig onderling kunnen vergelijken mitochondriën tussen de monsters. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën is een voorkeur aanpak bij het doel van het onderzoek is om te bepalen onderliggende mechanismen en de specifieke doelen, zoals ETC components / complexen, of mitochondriaal transport mechanismen. Beschreven is een protocol voor spierbiopsie en isolatie van functionele mitochondriën van kleine weefselmonsters. Deze methode levert reproduceerbare resultaten tussen de gebruikers te wijten aan het gebruik van een geautomatiseerd homogenisator versus handbediende dounce homogeniseerapparaten. Isolatie van mitochondria kan worden uitgevoerd met slechts 20 mg van spierweefsel. Het bedrag van geïsoleerde mitochondriën die kunnen worden verkregen uit deze steekproef voldoende groot is om Seahorse-plaat gebaseerd respirometry draaien terwijl overschot mitochondriën voor andere experimenten en opslag voor verdere moleculaire analyses. Opgemerkt zij dat deze werkwijze kan worden vertaald naar de XF 96, waar nog kleinere hoeveelheden mitochondria worden gebruikt (1-2 ug per putje). Verscheidene protocollen voor het isoleren mitochondria afhankelijk dounce homogenisatoren initiële weefselverstoring. Een nadeel van deze methode is de praktische aard van het initiële weefselhomogenisering. De kracht en de snelheid van de stamper in de homogenisator kan sterk variëren tussen de exploitanten 6. Dit kan resulteren in experiment tot experiment variatie en lab tot lab variatie, en leidt tot moeilijkheden bij het vergelijken van gegevens tussen experimenten. Dit is van bijzonder belang in de menselijke interventiestudies bij de gegevens van de deelnemers worden verzameld op verschillende tijdstippen, meestal vóór en na de behandeling, en mogelijk op meerdere plaatsen. We maken gebruik van een geautomatiseerde homogenisator voor een meer consistente aanpak die meer reproduceerbare resultaten met beperkte persoon tot persoon verschillen oplevert. De snelheid van bereiding maakt deze aanpak geschikt voor het hanteren van meerdere monsters tegelijk. Meestal kan tot drie experimenten worden uitgevoerd in een enkele dag. Mogelijke beperkingen van de hier beschreven techniek ontstaan ​​door het gebruik van geïsoleerde organellen en het gebruik van een plaat gebaseerd formaat. Bijvoorbeeld, Picard et al. hebben demontoond dat geïsoleerde mitochondriën bezitten functionele eigenschappen die fundamenteel verschillen van die van intacte mitochondriën in gepermeabiliseerde myovezels. Ze stelden mitochondriale isolatietechnieken resulteren in gewijzigde bioenergetica functie als aanzienlijk toegenomen RCR opzichte permeabel spiervezels gaan met een grotere productie van reactieve zuurstof 13. Vergeleken met gepermeabiliseerd spiervezels, isolatie van mitochondria vereist langere bereidingstijd. Ook verlies van cellulaire gehalte vermindert fysiologische relevantie, iets dat wordt vastgehouden in volledige cellen en zelfs gepermeabiliseerd vezels. Het gebruik van de plaat gebaseerd respirometry met de beschreven techniek het toelaat repliceren runs per monster. Echter, moet mitochondriën goed aan de bodem van elk. Deze configuratie verschilt van de normale omgeving en kunnen beïnvloeden functionele eigenschappen. Voorts zij opgemerkt dat het gebruik van dit protocol voor mitochondriële isolatie ther,e kunnen nog verontreiniging van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het mitochondriale preparaat. Verschillen in ER verontreiniging kan de bepaling van de mitochondriale opbrengst en invloed resultaten beïnvloeden. Kortom, deze studie bevat gegevens die bevestigt dat mitochondriën geïsoleerd uit weefsels met behulp van deze procedure functioneel actief en kan worden gebruikt voor onderzoek / toepassingen die hoogwaardige geïsoleerde mitochondriën van minimale skeletspier monsters vereisen. Het voordeel van deze methode is dat: i) het is mogelijk om mitochondriën te isoleren van geringe hoeveelheden van skeletspieren, ii) de werkwijze is snel, iii) de plaat gebaseerde technologie, is het mogelijk om meerdere monsters draaien op hetzelfde moment, en iv) er genoeg van overtollig weefsel en geïsoleerde mitochondria na de bio-energetische test voor opslag van monsters en andere moleculaire biologische onderzoeken.

Mitochondriën zijn de primaire energieproductie sites in de cel een belangrijke rol bij veroudering en diverse leeftijd gerelateerde aandoeningen zoals cardiovasculaire aandoeningen, ziekte van Alzheimer, diabetes, kanker, en obesitas. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën biedt een directe analyse van elektron transport keten (ETC) functie en heeft een belangrijke bijdrage geleverd aan ons begrip van mitochondriale biologie en haar rol in gezondheid en ziekte. Geïsoleerde mitochondria worden gebruikt om verschillende aspecten van bio-energetica zoals, substraattransport, ATP synthase activiteit, proton lek, etc. De in deze handschrift beschreven methode is geoptimaliseerd respirometrische analyse van mitochondria geïsoleerd uit skeletspier weefsel biopsieën verkregen bij proefpersonen toe te bestuderen. De biopsie protocol in dit manuscript beschreven werd gebruikt door onze medewerkers voor de afgelopen 12 jaar. Onze groep heeft uitgevoerd meer dan 700 procedures op volwassenen van verschillende leeftijden,tot 90 jaar oud, en verschillende chronische ziektetoestanden zonder nadelige veiligheid. Een belangrijk aspect van dit protocol is dat het specifiek is ontworpen om minimale hoeveelheden weefsel te gebruiken, waardoor het gebruik in klinische studies te vergemakkelijken. Verschillende protocollen ontwikkeld voor het isoleren mitochondria. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beschreef een werkwijze voor het isoleren mitochondriën uit verschillende rattenweefsels en gekweekte cellen. Garcia-Cazarin et al. 3 heeft een werkwijze voor het isoleren mitochondria uit skeletspieren van ratten en muizen gerapporteerd. Werkwijze voor het isoleren mitochondria uit rattenhersenen werd ook gerapporteerd door Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. Rapporteerde een 5 werkwijze voor het isoleren mitochondria met de barocycler en / of PCT shredder. Recentelijk Franko et al. 6 meldde een werkwijze voor het isoleren sterk verrijkt mitochondriën met anti-TOM22 Magnetische korrels. Hoewel deze protocollen leveren uitstekende resultaten, weefsel grootte eisen zijn hoog in vergelijking met de in dit manuscript beschreven methode. Bijvoorbeeld, Gross et al. 5 gebruikt 1,5-1,8 g gastrocnemius en ongeveer 2 g van het nierweefsel. Evenzo Franco et al. 6 gebruikt 500 mg muis leverweefsel. Vanuit onze ervaring, typische opbrengsten die worden verwacht van percutane naaldbiopsie van de skeletspieren (vastus lateralis) range 100-200 mg. De mogelijkheid om mitochondriale functie getest 20-50 mg spierweefsel volgens de hieronder beschreven protocol laat gebruikers meerdere bepalingen uit te voeren per biopsie en opslaan monsters voor toekomstig gebruik in andere moleculaire biologische experimenten. Dit is een cruciale functie in klinisch onderzoek en andere studies die ijverig gebruik van samples nodig. Opgemerkt moet worden dat eerder bevroren mitochondria niet goed voor het bestuderen gekoppeld ademhaling door outer mitochondriale membraan schade en verlies van cytochroom C-activiteit. Onze werkwijze is aangepast en gewijzigd vanaf de methode gepubliceerd door Chappell en Perry 7. Met behulp van de in dit manuscript beschreven methoden, hebben we onlangs gemeld dat de respirometrische profiel van mitochondriën geïsoleerd uit menselijke Vastus lateralis is direct gecorreleerd met fysieke vermogen, gemeten als loopsnelheid 8.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analyzer</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak camera assembly</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered saline&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial proteinase</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K+ salt)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito stress test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en respirometrische beoordeling van mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel verkregen door percutane naaldbiopsie

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën wordt vaak gebruikt om elektronen transportketen functie te onderzoeken. We beschrijven een methode voor het verkrijgen van monsters van menselijke Vastus lateralis, het isoleren van mitochondriën van minimale hoeveelheden van de skeletspier weefsel, en de plaat gebaseerd respirometrische profilering met behulp van een extracellulair flux (XF) analyser. Vergelijking van respirometrische profielen verkregen met 1,0, 2,5 en 5,0 ug mitochondria geven aan dat 1,0 ug voldoende is om ademhaling te meten en dat 5,0 ug levert gelijkmatig resultaat gebaseerd op vergelijking standaardfouten. Western blot analyse van geïsoleerde mitochondria voor mitochondriële marker COX IV en niet-mitochondriale weefselmarkeerder GAPDH geven dat er beperkte niet-mitochondriale verontreinigingen door dit protocol. De mogelijkheid om mitochondriale respirometry bestuderen in slechts 20 mg spierweefsel kunnen gebruikers individuele biopsieën voor meerdere eindpunten in klinische gebruikonderzoeksprojecten.

Figuur 1 toont een gedetailleerd stroomdiagram van het gehele protocol. Western blot profielen van COX IV / GAPDH (figuur 2) tonen de expressie van het mitochondriale eiwit, COX IV, en de niet-mitochondriale marker, GAPDH. Expressie van zowel COX IV en GAPDH zijn duidelijk in alle spieren lysaat. Na mitochondriën zijn geïsoleerd met behulp van de in dit protocol beschreven techniek, COX IV bands zijn nog steeds zichtbaar, terwijl GAPDH- afwezig is op dezelfde belichting. Langere blootstelling kan een zwakke GAPDH- band onthullen. Deze blots geven aan dat de geïsoleerde mitochondriën een minimale niet-mitochondriale besmetting. Bovendien COX IV expressie in geïsoleerde mitochondriën is consistent tussen de monsters. Figuur 3 toont typische respirometrische profielen dankzij complex II (succinaat en rotenon) met 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug mitochondria. Zoals verwacht, is de algehele OCR verhoogd wi grotere hoeveelheden mitochondria. De berekende respiratoire controle ratio (RCR) voor deze test is 7,95, wat aangeeft dat de mitochondriale voorbereiding is van hoge kwaliteit. Verder staat 3u OCR is iets hoger dan die van de staat 3, bevestigt mitochondriale kwaliteit. Ter vergelijking consistente resultaten bij profileren verschillende hoeveelheden mitochondria, voerden we ANOVA (variantieanalyse) en berekende de som van kwadraten (SS) als werkelijke waarden van de variantie met 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug per mitochondria geladen en (Figuur 4). SS wordt gepresenteerd voor toestand 2, staat 3, staat 3u, antimycin A, en RCR. Voor toestand 2 en 3 staat metingen een ANOVA was statistisch significant (p &lt;0,01 en p &lt;0,05, respectievelijk). Ook de ene ANOVA was statistisch significant voor antimycin en RCR (p &lt;0,01 en p &lt;0,0001, respectievelijk. Geen significant verschil werd gezien staat 3U tussen groepen. These resultaten geven aan dat 5,0 ug mitochondriën per putje gaf de laagste SS vergelijking met andere concentraties en is de optimale hoeveelheid te gebruiken in de XF 24 systeem onze bevolking deelnemers. Figuur 5 is een leidraad te geven hoeveel mitochondriale eiwit worden verwacht op basis van de oorspronkelijke musculaire steekproef. Zoals verwacht is er een sterke correlatie tussen de hoeveelheid spier (mg) behandeld en het mitochondriale totale eiwitgehalte (mg) van het eindmonster. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry buffer I (CPI) </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry buffer II (CPII) </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Vetzuurvrij BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Assay Solution (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mm </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Vetzuurvrij BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Assay Solution (MAS) met complexe II beginvoorwaarden </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Assay Solution (MAS) met complexe Ik beginvoorwaarden </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvaat</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malaat </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Alle buffers worden in gedeïoniseerd water </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Solution en buffer recepten. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protocol Stappen </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Commando </td><td> Tijd (min) </td><td> Poort </td></tr><tr><td> Kalibreren </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> Een </td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Maatregel </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Mix, meten en meng cyclus instelling voor de respirometer. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van het gehele protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Een representatieve Western blot voor volle skeletspierweefsel en geïsoleerde mitochondria. Totaal weefselextract en geïsoleerde mitochondriën werden immunoblotting met COX IV antilichaam zoals mitochondriale marker en GAPDH antilichaam voor niet-mitochondriale control. Geen GAPDH- band werd waargenomen in de geïsoleerde mitochondriën aangeeft weinig of geen verontreiniging van niet-mitochondriale bronnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger respirometrische profiel van mitochondriën geïsoleerd uit menselijke Vastus lateralis. Drie concentraties van geïsoleerde mitochondriën, 5,0 ug, 2,5 ug, en 1,0 ug wij<html> opnieuw gebruikt in deze test. Uiteindelijke concentraties van verbindingen na poort injecties 2 mM ADP (poort A); 2 uM oligomycin (poort B); 6 uM FCCP (poort C); en 2 uM antimycin A (poort D). Berekend RCR voor deze run was 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figuur 4. Som van de kwadraten. Som van de kwadraten van de verschillende mitochondriale ademhaling staten en RCR met behulp van 5,0 ug, 2,5 ug, en 1,0 ug mitochondriën. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Dit kan worden gebruikt als een leidraad voor de hoeveelheid mitochondriaal eiwit te verwachten op basis van de oorspronkelijke musculaire monstergewicht Regressieanalyse schatten. Van hoeveelheid spier (mg) en totale mitochondriale eiwit opbrengst (mg). Zoals verwacht, is er een direct positieve correlatie tussen de hoeveelheid spieren en de totale mitochondriale eiwit verkregen.

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van de respiratoire controle in mitochondriën, geïsoleerd uit gebiopsieerd skeletspierweefsel. Dit wordt bereikt door eerst een kleine hoeveelheid spierweefsel te verkrijgen via een percutane naaldbiopsie. De tweede stap is het isoleren van mitochondriën uit de gebiopsieerde spier door middel van homogenisatie.Vervolgens worden de geïsoleerde mitochondriën gewassen en gescheiden van de niet-mitochondriale fracties door middel van centrifugatie en door het monster door een laag kaasdoek te filteren. De laatste stap is het uitplaten van de geïsoleerde mitochondriën om respirometrische analyse uit te voeren via extracellular flux-assays om de zuurstofconsumptiesnelheid te visualiseren. Uiteindelijk wordt de Seahorse extracellular flux analyzer gebruikt om de respiratoire controle in geïsoleerde mitochondriën te onderzoeken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat er een minimale hoeveelheid spierweefsel van slechts 20 milligram nodig is en dat de inter-experimentele variabiliteit wordt beperkt. Deze kenmerken maken deze techniek geschikt voor klinische onderzoeksapplicaties. De implicaties van deze techniek liggen in het diagnosticeren van mitochondriale dysfunctie bij patiënten.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de spierbiopsie en de isolatie van mitochondriën nauwkeurige handelingen vereisen die bij voorkeur visueel worden aangetoond in plaats van uitsluitend in tekst worden beschreven. Dien voor het lokaal uitvoeren van de biopsie 1% lidocaïne toe, waarbij u erop let dat de spier niet wordt geïnfiltreerd. Wacht vervolgens 10 minuten.Om voldoende verdoving mogelijk te maken, worden de biopten genomen uit het middengebied van de spier tussen de aanhechting en de oorsprong, waarbij subfasciale en myotendineuze gebieden worden vermeden. Om dit te bereiken, wordt eerst een percutane naald gebruikt, waarbij een fasciale 'pop' of de weerstand van de fascia als leidraad dient. Schat de diepte in met de anesthesienaald, voel dit vervolgens met het smalle scalpelblad en maak een incisie van vier tot vijf millimeter door de fascia.Voer de naald via de incisie door tot deze in de spier is geplaatst. Verzamel meerdere monsters door het venster in verschillende richtingen te draaien. Pas continue zuiging toe met een spuit van 60 cubic centimeter terwijl spierbiopten twee tot vier keer in verschillende richtingen in de percutane naald worden getrokken en weer teruggeplaatst.Stop de zuigwerking en verwijder de naald. Laat een assistent vijf minuten lang stevige druk uitoefenen op de punctieplaats. Om hemostase te bewerkstelligen, wordt de naald losgekoppeld van de zuigslang en worden de spierstalen voorzichtig uit het venster en de cilinder verwijderd.Herhaal deze procedure indien er meer spierweefsel nodig is voor een tweede passage. Verwijder eventuele zichtbare bloedstolsels uit het spiermonster met een pincet. Weeg vervolgens het monster en plaats het onmiddellijk in een buis met ijs.Koel de ECCO's af met fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS. Verwijder zichtbaar bindweefsel van het monster met een scherp schaartje en pincetten. Was de monsters grondig drie tot vier keer met ijskoude DPBS-buffer.Om bloed te verwijderen, bewaart u de monsters in ijskoud DPBS en verwerkt u deze zo snel mogelijk. Verwijder binnen 45 minuten na de biopsie voorzichtig alle pezen of vetweefsel uit het spiermonster. Verwijder een klein deel van elk extra weefsel voor bewaring bij -80 °C.Dit kan worden gebruikt voor andere experimenten, zoals Western blots. Snijd het spierweefsel onmiddellijk in kleine stukjes. Gebruik hiervoor een steriel schaartje en suspendeer het weefsel vervolgens in 500 µL tot 1 mL van een cystine-proteaseremmer, zoals nagarse opgelost in CP1-buffer bij een concentratie van 0,2 mg per gram weefsel.Maal het monster fijn totdat het goed gesuspendeerd lijkt. Laat dit vervolgens vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur voordat u het op ijs plaatst, waarbij u ervoor zorgt dat de homogenisator vooraf grondig is gereinigd. Homogeniseer het fijngemaalde weefsel dat is behandeld met nagars.Gebruik een automatische homogenisator. Houd het monster gedurende dit hele proces op ijs. Homogeniseer elk weefselmonster vier keer met telkens een puls van twee seconden.Plaats de monster opnieuw op ijs nadat de geautomatiseerde homogenisator op een snelheid van 10.000 RPM is gebruikt. Was de probe tussen de weefsels door met 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water. Was het gehomogeniseerde weefsel vervolgens met een gelijk volume chapel Perry one of CP one-buffer.Was daarna het weefsel met tweemaal het volume CP two-buffer. Voeg de balansbuis toe door water tot hetzelfde volume in een andere conische buis te brengen. Verzamel de inhoud in een centrifugebuis en centrifugeer bij 600 GS op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Maak de kaasdoek vooraf nat om ervoor te zorgen dat alle partikels passeren en niet door de doek worden tegengehouden.Filter het supernatant door een natte kaasdoek, verzamel het filtraat en gooi de pellet weg om zo het grootste deel van de niet-mitochondriale fracties te verwijderen. Centrifugeer het supernatant vervolgens in een ultracentrifuge bij 10,000 GS bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Suspendeer de pellet in vier milliliters CP 2-buffer voordat u op dezelfde wijze een tweede keer centrifugeert na de eerste centrifugatie.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in twee milliliters CP one-buffer. Neem op dit punt een kleine aliquot van deze suspensie op in een aparte reageerbuis voor eiwitbepaling. Resuspendeer de resterende monsterinhoud in CP one-buffer en centrifugeer.Zoals eerder vermeld, dient de eiwitplaat tijdens de eerdere centrifugatiestappen samen met de standaarden te worden klaargezet. Resuspendeer tot slot de uiteindelijke pellet in een minimale hoeveelheid mitochondriale assay-oplossing of massa. Voer XF-assays uit om de zuurstofconsumptiesnelheid of OCR in picomol zuurstof per minuut of de absolute niveaus van zuurstof en pH te visualiseren.Voeg aan de data-output een 10 x concentratie van de verbindingen in een X massa toe aan de poorten A tot en met D van de plaat-gebaseerde respirometer, om een uiteindelijke concentratie te verkrijgen zoals vermeld in het tekstprotocol. Bereid een voldoende volume van de verbindingen voor het vereiste aantal putjes voor.Gebruik de eerder gemeten eiwitberekeningen om de concentraties mitochondria te bepalen die moeten worden toegevoegd. Bepaal de optimale hoeveelheid mitochondria door één microgram, 2,5 microgram en vijf microgram mitochondria per putje van de 24-wellplaat te titreren om de variabiliteit tussen de putjes te minimaliseren.Verdun eerst 10 x mitochondria in koud, one x mass plus substraat. Breng vervolgens 50 µL van deze suspensie aan in elke well. Laat vier wells over die enkel 50 µL mass bevatten om als achtergrondmetingen te worden gebruikt.Plaats de vooraf geweekte kalibratieplaat samen met de eerder voorbereide bovenste cartridge in de respirometer om de instrumentkalibratie uit te voeren. Ter voorbereiding op de run van de testplaat wordt de plaat 20 minuten gecentrifugeerd bij 2000 GS bij vier graden Celsius. Na centrifugatie.Voeg voorzichtig 450 µL van één x mass, plus succinaat en rotten known toe aan elke put. Bekijk de mitochondriën onder de microscoop om een homogene hechting aan de put te bevestigen voordat de plaat naar de XF-analyzer wordt overgebracht. Meet sequentieel de mitochondriale respiratie in real-time met de respirometer door deze te programmeren volgens de instellingen voor de respirometer die in het tekstprotocol zijn beschreven; hieronder volgen typische respirometrische profielen aangestuurd door complex II met gebruik van 1 µg, 2,5 µg en 5 µg mitochondriën zoals verwacht.Over het algemeen neemt de OCR toe bij hogere hoeveelheden mitochondria. De berekende respiratory control ratio of RCR voor deze assay is 7,95, wat aangeeft dat de mitochondriale preparatie van hoge kwaliteit is om de consistentie van de resultaten te kunnen vergelijken. Bij het profileren van verschillende hoeveelheden mitochondria werd een analyse van varianten (ANOVA) uitgevoerd en werd de som van de kwadraten berekend. De som van de kwadraten of SS wordt gepresenteerd voor toestand twee, toestand drie, toestand drie ongekoppeld, antimycine A en de RCR voor metingen in toestand twee en toestand drie via een eenweg-analyse.Innova was statistisch significant, evenals ANTIMYCIN en RCR. Er werd geen significant verschil waargenomen voor state three ongekoppeld tussen de groepen. Deze resultaten geven aan dat vijf microgram mitochondriën per put de laagste SS opleverde in vergelijking met andere concentraties.Deze grafiek dient als richtlijn om aan te geven hoeveel mitochondriaal eiwit kan worden verwacht op basis van de initiële grootte van het spiermonster. Zoals verwacht is er een sterke correlatie tussen de hoeveelheid verwerkt spierweefsel en het totale mitochondriale eiwitgehalte van het uiteindelijke monster. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in minder dan drie uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd.Na het spierbiopt is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de patiënt de komende drie dagen geen aspirine, ibuprofen of andere vrij verkrijgbare niet-steroïde anti-inflammatoire middelen gebruikt, om een goede genezing van de gebiopteerde weefsels te waarborgen. Daarnaast moeten we ervoor zorgen dat zij de volgende anderhalve dag geen zware lichamelijke inspanningen leveren, dus niets dat schokkend is, zoals basketballen, trampolinespringen of soortgelijke activiteiten, hoewel zij hun normale dagelijkse bezigheden wel kunnen voortzetten.We vragen hen daarnaast om het gebied 24 uur droog te houden, maar dat de eerste keer dat het nat wordt in een douche is, zodat eventuele bacteriën op de huid die we niet hebben gereinigd niet in de incisie terechtkomen. Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht moeten hebben in hoe u een biopsie van S lateral skeletspierweefsel uitvoert, mitochondriën isoleert en de respiratoire controle meet.

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

We ontwierpen en bouwden een mobiel laboratorium om de ademhalingsfrequentie te meten in geïsoleerde mitochondriën van wilde dieren die op veldlocaties zijn gevangen. Hier beschrijven we het ontwerp en de inrichting van een mobiel mitochondriaal laboratorium en de bijbehorende laboratoriumprotocollen.

Ontwikkeling van een mobiel laboratorium voor mitochondriale fysiologie voor het meten van mitochondriale energetica in het veld

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie.  Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.

Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer een methode voor respirometrische analyse van mitochondriën geïsoleerd uit spierweefsel verkregen door percutane naaldbiopsie. Deze techniek vereist slechts 20 mg weefsel en is geschikt voor klinisch onderzoek naar mitochondriale dysfunctie.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Meer video's verkennen