Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van membraaneiwitten die tot expressie komen in SIA coli voor structurele en functionele analyses. Eerst worden de bacteriën geoogst, gelyseerd en geanalyseerd via SDS-PAGE om de correct gevouwen GFP-eiwitten te visualiseren met behulp van InGel-fluorescentie. In de tweede stap wordt de productie van de E. coli die de gewenste membraaneiwitten tot expressie brengt opgeschaald, waarna een totale membraanfractie uit de cellen wordt geprepareerd na inductie van de eiwitexpressie.

Ten slotte wordt de totale membraanfractie gesolubiliseerd in vier verschillende detergentia en wordt de monodispersiteit van de gesolubiliseerde GFP-eiwitten geanalyseerd middels size-exclusion chromatografie. De eiwitten kunnen vervolgens worden gemonitord via fluorescentie, waarbij de elutieprofielen worden uitgezet om de aggregatie, monodispersiteit en het vrije GFP in de monsters te beoordelen.

De productie van recombinante membraaneiwitten voor structurele en functionele studies blijft technisch uitdagend vanwege hun lage oplosbaarheid en de instabiliteit die optreedt zodra ze in detergentia worden geëxtraheerd. Ervaring heeft aangetoond dat het screenen van meerdere varianten van membraaneiwitten, zoals orthologen van verschillende soorten, het succespercentage van de expressie van membraaneiwitten kan verhogen. Fusie met groene fluorescerende eiwitten wordt gebruikt om authentieke vouwing aan te tonen.

De eerste stap in ons GFP-gebaseerde protocol voor de expressiescreening van membraaneiwitten in E. coli maakt gebruik van in-gel fluorescentie van detergentlysaten van hele cellen om de membraaneiwitconstructen voor verdere analyse te identificeren op basis van het expressieniveau in de screening. Het gedrag van de geselecteerde membraaneiwitten in verschillende detergentia wordt vervolgens geëvalueerd met behulp van fluorescentiedetectie gekoppeld aan size-exclusion chromatografie. Dit verschaft informatie over de monodispersiteit van de detergent-eiwitcomplexen. Om de IPTG-geïnduceerde bacteriële expressie te analyseren, begint u met het overbrengen van één milliliter IPTG-behandelde E. coli in duplikaat van overnight-culturen in 24-deep-well blocks naar 96-deep-well blocks; verzegel de blocks en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij 6.000 ×g bij kamertemperatuur.

Keer het blok daarna om om het medium af te gieten en tik voorzichtig op een papieren handdoek om resterende vloeistof te verwijderen. Sluit de plaat opnieuw af en bewaar de cellen na ten minste 20 minuten bij -80 °C. Ontdooi de pellets gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de cellen vervolgens volledig in 200 µL lysisbuffer met behulp van een multichannelpipet.

Behandel de cellen met 20 µL DLPI-oplossing onder schudden bij 1000 RPM en 4 °C gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 25 µL 10% DDM toe aan elke put en incubeer de cellen nogmaals 60 minuten onder schudden. Centrifugeer na de DDM-behandeling het deep-wellblok en breng vervolgens 10 µL van het geklaarde lysaat over naar een microtiterplaat en voeg 10 µL SDS-PAGE-laadbuffer toe.

Laad de gel nu met 10 µL van de lysaatbufferoplossing per putje en laat de gel lopen bij een constant voltage tussen 100 en 120 volt in een koudekamer gedurende twee tot 2,5 uur, totdat het diafragma de onderkant bereikt. Plaats de gel op een imager met een blauw lichtfilter om de fusie-eiwitten te detecteren voor het opschalen van de celculturen. Na het transformeren van competente E. coli, wordt een kolonie overgebracht naar 10 mL power broth voor overnight groei bij 37 °C.

Verdun de volgende ochtend vijf milliliters van de overnight-cultuur in 500 milliliters power broth en laat de culturen verder groeien onder schudding bij 250 RPM en 37 °C. Wanneer de OD bij 595 nanometers ongeveer 0,5 is, induceer dan de expressie door IPTG toe te voegen tot een eindconcentratie van one millimolar, en plaats de cultuur vervolgens overnight terug in de schudmachine, ditmaal bij 20 °C. Oogst de volgende ochtend de cellen door centrifugatie en bewaar de pellets bij -80 °C.

Om de celmembranen voor te bereiden: resuspendeer de pellets bij kamertemperatuur in vijf milliliter PBS per gram celpellet, waarbij het volume indien nodig wordt verhoogd totdat de viscositeit afneemt tot een vloeibare consistentie. Voeg vervolgens magnesiumchloride toe tot een eindconcentratie van one millimolar, DNA tot een eindconcentratie van 10 micrograms per milliliter en één voorverpakte protease-remmertablet per 20 gram celpellet aan de cellen toe.

Breek vervolgens de cellen open met een gekoelde celdisruptor bij een druk van 30 KPSI en pellet daarna de niet-gebroken cellen en het debris gedurende 15 minuten bij 30,000 ×g en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een ultracentrifugebuis en verzamel de totale membraanfractie door het supernatant één uur lang te centrifugeren bij 200,000 ×g en vier graden Celsius. Gebruik vervolgens de celhomogenisator om het membraanpellet te resuspenderen in 10 milliliters ijskoud PBS om de membranen te solubiliseren voor elk te gebruiken detergent.

Pipetteer aliquoten van 900 µL van de membraansuspensie in 1,5 mL polypropyleen centrifugebuisjes. Voeg vervolgens 100 µL van elk vers bereid detergent toe aan dedesbetreffende 1,5 mL buisjes en incubeer de mengsels bij 4 °C onder milde agitatie. Pellet na een uur het detergent en de oplosbare fracties met een benchtop ultracentrifuge, waarbij wordt gewaarborgd dat de buisjes ten minste halfvol zijn, en bewaar het supernatant voor fluorescentie-gedetecteerde grootte-uitsluitingschromatografie of SEC-analyse.

Gebruik vervolgens een Equator size-exclusion kolom met een breed fractioneringsbereik met een doorstroomsnelheid van de buffer van 0,3 milliliters per minuut. Injecteer daarna 100 microliters van een gesolubiliseerd membraanmonster op de kolom bij dezelfde stroomsnelheid en monitor het elutieprofiel met fluorescentie-optiek. Importeer tot slot de gegevens van het elutievolume en de fluorescentie-intensiteit in een spreadsheetprogramma voor grafische weergave en analyseer het resterende gesolubiliseerde membraanmateriaal via in-gel fluorescentie.

Zoals eerder aangetoond, is de genoemde eiwitfamilie essentieel voor de bacteriële celdeling. In deze afbeeldingen wordt een representatieve in-gel fluorescentievisualisatie van 24 van de 47 genoemde constructen getoond. De intensiteit van de banden geeft een indicatie van het expressieniveau.

Bijvoorbeeld, het fusieprotein in baan scène vier wordt in beide stammen goed tot expressie gebracht. De extra banden met een lager molecuulgewicht suggereren echter dat het protein in veel banen gedeeltelijk is gedegradeerd. Er is een band aanwezig die qua grootte overeenkomt met GFP alleen.

Bijvoorbeeld, G vier en H vier worden in de C 41 DE drie P lys S-stam volledig afgebroken tot vrij GFP. Terwijl er in de LEMO 21 DE drie in deze grafieken wel enig intact eiwit aanwezig is. Analyse van twee constructen die goed presteerden in de primaire screening via fluorescentie-gedetecteerde grootte-uitsluitingschromatografie demonstreert hoe de eiwitten zich verschillend gedragen, afhankelijk van welk van de vier detergentia werd getest.

Bijvoorbeeld, dit eiwit gaf in Dool Multiside slechts een symmetrische piek met weinig aggregatie, waardoor dit het detergens van voorkeur was voor de daaropvolgende zuivering. Daarentegen vertoonde het andere fusie-eiwit een vergelijkbaar profiel in alle geteste detergentia. Dit protocol kan eenvoudig worden uitgebreid om bijvoorbeeld verschillende e coli-stammen die onder verschillende expressiecondities zijn gekweekt en aanvullende detergentia in zowel primaire als secundaire screenings op te nemen.

Samenvattend is het hoofddoel van dit protocol om een groot aantal membraaneiwitten te kunnen screenen op expressie en detergentisatie, om zo kandidaten voor verdere analyse te identificeren.