Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in Escherichia coli

Het algemene doel van deze procedure is om membraaneiwitten die in SIA coli tot expressie worden gebracht, te identificeren voor structurele en functionele analyses. Eerst worden de bacteriën geoogst, geanalyseerd door SDS-pagina voor visualisatie van de correct gevouwen GFP-eiwitten door Ingel-fluorescentie. In de tweede stap wordt de productie van de e coli die bepaald is om de membraaneiwitten van belang tot expressie te brengen, opgeschaald en een totale membraanfractie wordt bereid uit de cellen na inductie van de eiwitexpressie.

Ten slotte wordt de totale membraanfractie gesolubiliseerd in vier verschillende detergenten en wordt de monodispersiteit van de detergent.Solubilized. GFP-eiwitten geanalyseerd door middel van uitsluitingschromatografie. Uiteindelijk kunnen de eiwitten worden gemonitord door fluorescentie en kunnen de eluciaprofielen worden geplot om de aggregatiemonodispersiteit en vrij GFP in de monsters te beoordelen.

De productie van recombinante membraaneiwitten voor structurele en functionele studies blijft technisch uitdagend vanwege hun lage oplosbaarheid en ze erven instabiliteit zodra ze in detergenten worden geëxtraheerd. Ervaring heeft geleerd dat het screenen van meerdere varianten van membraaneiwitten, zoals orthologen van verschillende soorten, de succesratio van membraaneiwitexpressie kan verbeteren. Fusie met groen fluorescerende eiwitten wordt gebruikt om authentieke vouwing te rapporteren.

De eerste stap in ons GFP-gebaseerde protocol voor de expressiescreening van membraaneiwitten en e coli gebruikt ingel-fluorescentie van detergentlysaten van hele cellen om de membraaneiwitconstructies te identificeren voor verdere analyse op basis van het expressieniveau in het scherm. Het gedrag van het selecteren van membraaneiwitten en verschillende detergenten wordt vervolgens geëvalueerd met behulp van fluorescentiedetectie gekoppeld aan uitsluitingschromatografie. Dit geeft informatie over de monodispersiteit van de detergent-eiwitcomplexen. Om IPTG-geïnduceerde bacteriële expressie te analyseren, begint u door een milliliter IPTG-behandelde e coli-duplicate van een overnachtelijke kweek in 24 diep welblokjes over te brengen naar 96 diep welblokjes, sluit de blokken en centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 6.000 keer G bij kamertemperatuur.

Keer daarna de blok om om het medium te decanteren en tik zachtjes op een papieren handdoek om eventueel resterend vocht af te tappen. Sluit de plaat weer af en bewaar de cellen op min 80 graden Celsius na minimaal 20 minuten. Ontdooi de pellets gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en gebruik vervolgens een meerkanaals pipet om de cellen volledig te resuspenderen in 200 microliters lysbuffel.

Behandel de cellen met 20 microliters DLPI-oplossing, schudden bij 1000 RPM en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 25 microliters van 10%doda multiside toe aan elke put en incubeer de cellen nog eens 60 minuten met schudden. Na de DDM-behandeling centrifugeer de diep welblok en breng vervolgens 10 microliters van het geklaarde lysate over naar een microtiterplaat en voeg 10 microliters SDS-pagina gelloading buffer toe.

Laad nu het gel met 10 microliters van de lysate buffer oplossing per put en laat het gel draaien bij een constante spanning tussen 100 tot 120 volt in een koude kamer gedurende twee tot 2,5 uur wanneer het diafragma de bodem bereikt. Plaats de gel op een imager met een blauw lichtfilter om de fusie-eiwitten te detecteren om de celculturen op te schalen. Na het transformeren van een Eloqua van competente e coli, plukt u een kolonie in 10 milliliter powerbroth voor overnachtelijke groei bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend verdunt u vijf milliliter van de overnachtelijke kweek in 500 milliliter powerbroth en blijft u de culturen laten groeien met schudden bij 250 RPM en 37 graden Celsius. Wanneer de OD bij 595 nanometer ongeveer 0,5 is, induceert u de expressie door IPTG toe te voegen tot een eindconcentratie van één millimolair, en plaatst u de kweek vervolgens terug in de shaker overnacht, dit keer bij 20 graden Celsius. De volgende ochtend oogst u de cellen door centrifugatie en bewaart u de pellets bij min 80 graden Celsius.

Om de celmembranen voor te bereiden. Resuspendeer de derde kamertemperatuur pellets in vijf milliliters PBS per gram celpellet, verhoog het volume indien nodig tot de viscositeit is verminderd tot een vloeibare consistentie. Voeg vervolgens magnesiumchloride toe tot een eindconcentratie van één millimolair DNA tot een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter en één voorverpakte protease-remmertablet per 20 gram celpellet aan de cellen.

Breek vervolgens de cellen open met behulp van een gekoelde celdisruptor bij een druk van 30 KPSI en pellet vervolgens de ongebroken cellen en het puin gedurende 15 minuten bij 30.000 keer G en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een ultracentrifugeerbuis en verzamel de totale membraanfractie door het supernatant gedurende een uur bij 200.000 keer G en vier graden Celsius te centrifugeren. Gebruik vervolgens de cellhomogenisator om de membraanpellet in 10 milliliter ijskoud PBS te resuspenderen om de membranen te solubiliseren voor elk te gebruiken detergent.

Breng 900 microliters van de membraansuspensie aan in 1,5 milliliter polycentrifugetbuisjes. Voeg vervolgens 100 microliters van elk vers bereid detergent toe aan de juiste 1,5 milliliter buisjes en incubeer de mengsels bij vier graden Celsius met milde vegetatie. Na een uur, pellet de detergent en oplosbare fracties met een tafelcentrifuge, zorg ervoor dat de buisjes minimaal halfvol zijn en bewaar het supine-agens voor fluorescentie-gedetecteerde uitsluitingschromatografie of FEC-analyse.

Injecteer vervolgens een equator uitsluitingskolom met een breed fractioneringsbereik met stromende bufferstroom bij een snelheid van 0,3 milliliter per minuut. Injecteer vervolgens 100 microliters van een gesolubiliseerde membraanmonster op de kolom bij dezelfde stromingssnelheid en bewaak het eluciaprofiel met behulp van fluorescentie-optica. Importeer ten slotte de eluciavolume en fluorescentie-intensiteitsgegevens in een spreadsheetprogramma voor grafische weergave en analyseer het resterende gesolubiliseerde membraanmateriaal door middel van ingel-fluorescentie