Name: Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer dendritische arborisatie beoordelen in de hippocampus van muizen met twee beeldvormingsmethoden. Real-time tracering en extended depth of field imaging bieden complementaire data voor kwantitatieve analyse van neuronale structuren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de LuMind Foundation, Research Down Syndrome en de Alzheimer's Association (AS). CP werd gedeeltelijk ondersteund door een ontwikkelingssubsidie voor faculteit van de College of Nursing and Health Professions aan de Arkansas State University.

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die door de Commissie voor Animal Research aan het Veterans Affairs Palo Alto Health Care System goedgekeurd. 1. Golgi-Cox kleuring <ol><li> Brain-extractie en vlekken <ol><li> Op de 1ste dag diep verdoven muizen met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine voor euthanasie via leegbloeden. </li><li> Verwijder voorzichtig de calvarium en ontleden van de hersenen. <ol><li> Verwijder eerst de huid op de bovenkant van de schedel, het plaatsen van een gebogen schaar bovenop het cerebellum en voorzichtig doorsnijden de calvarium evenwijdig aan de centrale sulcus met de punt van de schaar naar buiten gericht, in de richting naar de olfactorische knobbel. Herhaal deze taak op beide zijden. </li><li> Gebruik een chirurgische pincet om de calvarium tillen, terwijl het draaien in de richting van de olfactorische bollen en breek het af. Vervolgens draait u de schedel ondersteboven en gebruik een pick door de optiek te snijdenzenuwen en draai de hersenen. Gebruik tenslotte pick naar de hersenen scheiden van het ruggenmerg ter hoogte van het foramen magnum. </li></ol></li><li> Onmiddellijk dompel de hersenen in 15 ml van commercieel verkrijgbare, onverdund Golgi-Cox oplossing. Bewaar de hersenen Golgi oplossing in een afgedekte, 20 ml glazen fles bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Op de 2e dag, langzaam giet de oplossing en te vervangen door 15 ml vers Golgi-Cox oplossing. Sluit de fles met de hersenen en laat ongestoord voor nog eens 9 dagen in het donker. </li></ol></li><li> Snijden en inbedding <ol><li> Op de 11e dag, plaats de hersenen in 30% sucrose-oplossing, bereid in DDH 2 O voor uitdroging. Wijzig de oplossing met vers bereide 30% sucrose na 12 uur. Incubeer de hersenen in 30% sucrose-oplossing gedurende 3 dagen bij 4 ° C. </li><li> Op de 14e dag, vul het reservoir van de vibratome met een 30% sucrose oplossing totdat het mes is bedekt. Zet de snelheid op 1 mm / s met een amplitude van 0,95 mm. </li><li> Dep de hersenen met een Kimwipe om overtollig vocht te verwijderen en verwijder het cerebellum met behulp van een scheermesje coronaalwaarts snijden. </li><li> Stevig monteren van de hele hersenen op de vibratome platform met behulp van superlijm en laat het voor 2-4 minuten in te stellen. Plaats het platform met de gehechte hersenen in het reservoir en stel het mes naar de top van de hersenen. </li><li> De vibratome Snijd de hersenen in 150 urn dikke secties bij kamertemperatuur herinneren om het mes te veranderen na elke 3 hersenen. </li><li> Insnijding van het reservoir met een kleine tip borstel en dompel deze in een petrischaaltje met 0,3% gelatine in DDH 2 O. Terwijl de secties blijven in de petrischaal, voeg 0,5 ml 0,3% gelatine op elke dia en gebruik een borstel om de vacht van de SuperFrost + dia verspreiden en. </li><li> Zachtjes halen de ondergedompeld secties van de petrischaal en leg ze op de ontsloten glijbanen. Oriënteren de hersenen secties doorraken ze alleen op hun kant en niet op de toppen. </li><li> Na ongeveer tien minuten, de vacht van de secties met 30% sucrose voordat het weefsel volledig droogt. Dan is het bereid dia&#39;s in een donkere plaats lucht drogen in een dia rek voor 3 dagen. </li><li> Verdunnen in de handel verkrijgbare 10x ontwikkelen oplossing voor 1x gebruik van DDH 2 O. Dompel de objectglaasjes in ontwikkeloplossing 7-10 min. Spoel de glaasjes 3 keer in DDH 2 O. </li></ol></li><li> Uitdroging <ol><li> Bereid 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en 95% ethanoloplossingen met gedestilleerd DDH 2 O. </li><li> Dompel de objectglaasjes in steeds hogere ethanol oplossingen gedurende 10 minuten elk. </li><li> Dompel de objectglaasjes in 100% ethanol oplossing 3 maal gedurende 10 minuten elke keer. </li><li> Week de dia&#39;s in 100% xyleen 3 opeenvolgende keer gedurende 5 minuten elk, het bijhouden van de secties in de uiteindelijke oplossing tot ze-cover gleed. </li><li> Plaats een royale hoeveelheid DPX (Di-n-butylftalaat in xyleen) montage medium (about 1-1,5 ml) op elke dia met behulp van een plastic overdracht pipet. Plaats voorzichtig dekglaasjes om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Lucht drogen deksel gleed-hersensecties horizontaal voor 3 dagen. </li></ol></li></ol> 2. doublecortin kleuring <ol><li> Diep verdoven (zie stap 1.1.1) de dieren. </li><li> Voer cardiale perfusie met vers bereide 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer 12. </li><li> Extraheer de hersenen (zie 1.1.2) en bewaar in 45 ml 4% paraformaldehyde bij 4 ° C geïncubeerd op een schommelende shaker. </li><li> Breng de hersenen tot 30% sucrose-oplossing en wacht volledige dehydratie gedurende 48 uur bij 4 ° C. Verwijder de hersenen uit sucrose en leg ze direct op koperen blokken geplaatst op droog ijs. </li><li> Vul het blok met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en markeer de oriëntatie van de hersenen met behulp van de bulbus olfactorius als landmark. </li><li> Met behulp van een cryostaat, gesneden 70 micron-dikke secties bij -20 ºC en plaats zein cryobeschermingsmiddeloplossing (25% ethyleenglycol, 25% glycerol, in 0,05 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,4) en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Voeg een oplossing van 50% cryoprotectant en 50% methanol. Aan deze oplossing wordt 0,5% waterstofperoxide (vol / vol). Incubeer drijvende secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Warm secties 37 ° C in TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 30-40 min door ze in een histologische oven. </li><li> Incubeer de secties met 0,3% triton en 3% normaal paardenserum gedurende 45 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan immunokleuring. Incubeer de secties bij 4 ° C overnacht in 3 ml oplossing van het DCX antilichaam 1: 500 verdund in TBS met 0,3% Triton en 1% normaal paardenserum. </li><li> De volgende dag was de secties 3 keer achter elkaar in TBS (10 min elk). </li><li> Incubeer secties met gebiotinyleerd paard anti-geit (1: 200 in TBS) gedurende twee uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties 3 keer achter elkaar in TBS (10 min elk). </li><li> Incubeer tboord met ABC Lite (1: 1.000) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voeg 5 ul van 30% H 2 O 2 een tablet van 10 mg DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) oplossing opgelost in 15 ml van 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Incubeer de secties onmiddellijk in deze oplossing gedurende 5 min. </li><li> Beëindig de reactie door wassen met ijskoude TBS driemaal, gevolgd door een wassen in TBS bij kamertemperatuur. </li><li> Uitdrogen secties met behulp van een reeks van ethanol oplossingen (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min elk), duidelijk in xyleen, en bedek vervolgens slip met behulp van DPX zoals in stap 1.3. </li></ol> 3. Visualisatie <ol><li> Na volledige droging van de secties, verwijder overtollig DPX op de top van de dia&#39;s met een scherp mes, en leg ze op de scan fase van de microscoop. Het systeem bestaat uit een microscoop uitgerust met scannende platform, joystick, en een kleur 12-bit camera. </li><li> Start het programma. Open een nieuw bestand. </li><li> Plaatseen referentiepunt op het scherm door te klikken met de muis op elke plaats. Dit zal alle pictogrammen van het instrument panel van programmavenster te activeren. </li><li> Klik op het pictogram &quot;Joystick gratis&quot; op de werkbalk en gebruik dan de joystick om de dentate gyrus van de hippocampus vinden in het eerste deel. </li><li> In het tabblad &quot;Extra&quot; van het programmavenster, selecteer &quot;Serial Section Manager&quot;. Klik op het icoontje &quot;Nieuwe sectie&quot; op de linker benedenhoek van het venster. Dit zal het venster &quot;Serial Sectie Setup&quot; te openen. </li><li> Selecteer de Serial venster Sectie Setup en voer vervolgens het totaal aantal secties die hippocampus regio&#39;s bevatten. Selecteer de evaluatie interval. Voer de sectie cut dikte (70 micrometer voor DCX en 150 pm voor Golgi-gekleurde coupes). </li><li> Start het opsporen van de gyrus dentatus regio door te klikken op het pictogram &quot;Freehand Contour Tekening&quot; in de werkbalk. Schets de dentate granulaire cellaag. &lt;/ Li&gt; <li> Selecteer &quot;100X&quot; uit het menu &quot;Vergroting&quot;. Voeg een druppel immersie olie op het onderdeel en schakel de doelstelling om 100X. Zoek de dentate korrel cellichamen en dendrieten kader van deze doelstelling. </li><li> Focus op een geselecteerde neuron en klik op het icoon &quot;Neuron Tracing&quot; op de werkbalk. Teken de omtrek van de dentate korrel cel lichaam. Wanneer u klaar bent tracing, klik met de rechtermuisknop op &quot;Finish Cell Body&quot; te selecteren. </li><li> Start het opsporen van de dendrieten handmatig in x, y en z-richtingen en volg elke tak met de joystick en de z-motor draaien. Bij een splitsing of trifurcation knooppunt, selecteert u de desbetreffende optie in het dropdown-menu op de rechtermuisknop klikken. Trace elk van de takken die voortvloeien uit deze knooppunten. Aan het eind van elke tak klik met de rechtermuisknop en selecteer &quot;Ending&quot; uit het dropdown menu. </li><li> Met behulp van de pijltjestoets iconen in de software venster selecteert willekeurig ander dentate korrel cel en volgt u dezelfde procedure als described in stap 3,9-3,10. Sla het gehele tracing. </li><li> Start de neuronale tracing software. </li><li> Open de eerste NRX databestand van de eerste muis van de experimentele groep. Voeg de NRX-bestand van de tweede muis van de experimentele groep. Ga door tot alle NRX bestanden van deze groep worden toegevoegd. </li><li> Selecteer op het tabblad Analysis &quot;Fan In-diagram&quot;. Dit opent de ventilator in-analyse venster. Vinkje &quot;dendrieten&quot; en klik op Display, die de lengtes en vertakking patronen van dendrieten toont voor deze groep muizen (figuur 1). </li></ol> 4. EDFI Opmerking: deze methode kan de gebruiker snel opnemen van een groot aantal beelden door de z-as van elk veld en het genereren van een 2D afbeelding die alle pixels gerichte gehele z-as bevat. Het resultaat zal een samengesteld beeld dat alle gerichte pixels van verzamelde beelden bevat zijn. <ol><li> Sluit de microscoop op een digitale camtijdperk. Plaats de secties voor het eerst op het scannen podium verbonden met de microscoop en dan overschakelen naar een 10X objectief. Verplaats het podium om het gebied van belang. </li><li> Start een video-capturing programma. </li><li> Druk op de opnameknop. Zodra de opnameknop drukt de macro scherpstelknop om van boven naar beneden van de sectie voor een totaal van 4 sec. Sla het resulterende videobestand. </li><li> Gebruik ImageJ freeware om de AVI video bestanden te converteren naar een niet-gecomprimeerd formaat door het openen van het bestand en ze op te slaan in ongecomprimeerd bestandsformaat. </li><li> Start een beeldanalyse programma en open het AVI-bestand. Ga naar het menu &quot;Actie&quot; en klik op &quot;Extended Depth of Field&quot;. Selecteer het bijbehorende videobestand. In &quot;Output&quot; opties, selecteer &quot;Genereer Composite Best-Focus Image&quot;. </li><li> In &quot;Focus Analysis&quot; opties, selecteer &quot;genormaliseerde Verlichting&quot; en &quot;Max Local Contrast&quot; opties. Selecteer vervolgens &quot;Creat &quot;. Het resulterende beeld vertegenwoordigt alle gerichte pixels gehele z-as (figuur 2). </li><li> Sla het resulterende beeld. </li></ol> 5. Het genereren van Extreem-beelden met hoge resolutie OPMERKING: Deze methode kan de gebruiker automatisch genereren van lage vergroting en extreem hoge-resolutie beelden van sterk vergrotende-beelden met hoge resolutie op een geautomatiseerde manier. <ol><li> Plaats de eerste gedeelten van het scannende platform aangesloten op de microscoop. De microscoop is verbonden met een digitale camera. Verplaats het podium om het gebied van belang. </li><li> Start een beeld acquisitie programma. </li><li> Gebruik een 10X objectief en het verwerven en op te slaan met een hoge resolutie (4076 x 3116) beelden uit de regio van belang ervoor te zorgen dat ten minste 10% overlap hebben. </li><li> Run Image Composite Editor om afbeeldingen te stikken. </li><li> Ga naar het menu Bestand en klik op &quot;New Panorama&quot;. Selecteer de map waarin de beelden zijn stORed. Selecteer de beelden die behoren tot dezelfde regio en druk op &quot;ok&quot;. </li><li> Druk op &quot;Exporteren naar schijf&quot; knop en sla de afbeelding op. Dit beeld vertegenwoordigt een extreem hoge-resolutie afbeelding van het gebied van belang dat kan worden gebruikt voor analyse en / of demonstratie (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse%3A+center+stage+for+many+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li>
<li>Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synapses and Alzheimer’s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777(2012).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li>
<li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formoterol%2C+a+long-acting+%CE%B22+adrenergic+agonist%2C+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li>
<li>Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Nerv+Syst+Agents+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li>
<li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li>
<li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566(2011).</li>
<li>Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult%3A+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li>
<li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693(2013).</li>
<li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
</ol>

Publicatie vergoedingen voor dit artikel worden gesponsord door MBF Bioscience.

Hier werden twee methoden beschreven te kwantificeren van de omvang van dendritische arborization in volwassen en pasgeboren neuronen met behulp van conventionele kleuringsmethoden in combinatie met RTI en EDFI. De acquisitie van hoge resolutie beelden van neuronen biedt een zeer nuttige methode voor het testen van de schadelijke effecten van neurodegeneratieve aandoeningen en, op zijn beurt, een middel voor therapeutische strategieën die hippocampale neuronen doelsoorten. Terwijl de RTI met...

Dynamische wijzigingen in het aantal en de structuur van synapsen zijn kenmerken van ontwikkeling, veroudering, en talrijke neurodegeneratieve aandoeningen 1-3. Het vermogen van neuronen synaptische ontvangen en integreren afhankelijk dendritische morfologie en dynamische veranderingen in synaptische verbindingen. Inderdaad bestaat er een positieve correlatie tussen dendritische wervelkolom en synaps nummer, die zowel van invloed cognitieve functie 4. Het is dus niet verwonderlijk dat afnames in dendritische wervelkolom nummer zijn geassocieerd met cognitieve dysfunctie bij een aantal neurologische aandoeningen 5-7, gevraagd grote belangstelling dendritische wervelkolom kwantificering. Toch is de kwantificering van de wervelkolom dichtheid blijft een tijdrovende en vervelende taak die niet aan nuttige informatie over de topografie en de verdeling van synapsen over de dendritische boom te genereren. Gelukkig kleuringsmethoden (bijv, Golgi-Cox en doublecortin (DCX)), in samenhangmet geavanceerde beeldvormende technieken kunnen worden gebruikt om bestaande barrières te overwinnen en produceren van hoge-resolutie afbeeldingen van dendritische arborization op een betrouwbare en snelle wijze. Terwijl Golgi-Cox kleuring methode kan worden ingezet om de toestand van dendritische arborization in alle neuronen 8 beoordelen, kan DCX worden ingezet om pasgeboren neuronen label name in de dentate gyrus en subventriculaire zone 9, een belangrijke overweging omdat neurogenese plaatsvindt in beide deze regio&#39;s over de hele levensduur 10,11. Volgende kleuring werden twee beeldvormende methoden ingezet om dendritische kenmerken te beoordelen: i) real-time beeldvorming (RTI) en ii) uitgebreid scherptediepte imaging (EDFI). De RTI-techniek zorgt voor een gemiddelde op te sporen en te kwantificeren de lengte en volgorde van arborization langs de individuele dendritische segmenten en takken. Zo maakt het mogelijk om de oppervlakte en het volume ingenomen door elk dendritische structuur schatten. Meer specifically in de RTI werkwijze de gebruiker identificeert continu de segmenten en nieuwe focus iteratief de neuron vindende software verzamelt de x, y en z coördinaten van de dendritische structuur en reconstrueert het traject van de dendritische structuur 3D. Relatief, de EDFI methode biedt een vrij eenvoudige en versnelde middelen voor het beoordelen van dendritische dichtheid in plaats van dikke weefselmonsters door het genereren van een samengesteld beeld, het verstrekken van informatie over de totale z-as. Om dit te doen, de gebruiker registreert high definition video bestanden over de dikte van de sectie en vervolgens maakt gebruik van software om de videobeelden te zoeken om punten te identificeren waarin een pixel is geheel in focus. Vervolgens worden de gerichte pixels samengevoegd en geïntegreerd in een afbeelding composiet 2D hoge-resolutie,. Dit samengestelde beeld bevat alle pixels die in-focus waren, ongeacht hun positie in de z-as. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van deze 2D-beelden kunnen vervolgens worden gebruikt om de dichtheid te bepalenvan dendritische vertakking in elk veld. Tot slot presenteren we een panoramisch methode voor het genereren van extreem hoge-resolutie beelden voor de analyse en beoordeling van dendrieten in een hele regio van belang. Deze techniek kan worden ingezet om het gebrek aan toegang tot zeer hoge resolutie en dure digitale camera overwinnen. Met deze methode legt men serie beelden op verschillende locaties langs de x- en y-as en dan automatisch steken ze samen met een freeware (bijv Image Composite Editor). Met name kan deze methode worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van dendritische arborization in een tamelijk groot gebied.

<table><tbody><tr><td>Gewijzigde Golgi-cox kleuringsoplossing&nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>bewaar bij 4&deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>1x Ontwikkelingsoplossing (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>bewaar bij 4&deg;C tot gebruik</td></tr><tr><td>30% Sucrose,</td><td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>maak vers &nbsp;in ddH2O</td></tr><tr><td>0.3% Gelatine</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Gegradueerde Ethanoloplossingen (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medium</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) wit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dekglas 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>CAS Nummer 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>CAS Nummer 77-86-1 &nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12 bit Camera&nbsp;</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Systeem</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in muizen

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritische arborisatie is aangetoond als een betrouwbare marker voor het onderzoek van de structurele en functionele integriteit van neuronen. Inderdaad correleert de complexiteit en de omvang van dendritische arborisatie goed met de synaptische plasticiteit in deze cellen. Een betrouwbare methode voor de beoordeling van dendritische arborisatie is nodig om de nadelige effecten van neurologische aandoeningen op deze structuren te karakteriseren en om de effecten van therapeutische interventies te bepalen. Echter, kwantificering van deze structuren heeft een formidabele taak gebleken gezien hun complexe en dynamische aard. Gelukkig kunnen geavanceerde beeldvormingstechnieken worden gecombineerd met conventionele kleuringsmethoden om de staat van dendritische arborisatie te beoordelen, wat een betrouwbaardere en sneller middel van beoordeling biedt. Hieronder staat een voorbeeld van hoe deze beeldvormingstechnieken werden gecombineerd met kleuringsmethoden om de dendritische arborisatie bij wild type muizen te karakteriseren. Deze complementaire beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt om dendritische arborisatie kwalitatief en kwantitatief te beoordelen die zich uitstrekken over een vrij breed gebied binnen de hippocampale regio.

De omvang van arborization gevolg van bestaande en pasgeboren dentate granule cellen werd geanalyseerd wildtype muizen met behulp van Golgi-Cox of DCX kleuring (figuur 1). Dendritische segmenten van DCX-positieve cellen bleken 13-36 micrometer lang. De normale verdeling van dendritische lengte werd getest met Kolmogorov-Smirnov-test (D = 0,1217, p &lt;0.01, Liliefors p &lt;0,001; Figuren 4 en 5). In de analyse van de lengte van de segmenten ...

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de mate van dendritische arborisatie in de hippocampus van een muismodel te bestuderen. Dit wordt bereikt via twee verschillende methoden. Bij de eerste methode worden dendrieten handmatig in real-time getraceerd door de gehele dikte van elke sectie.Na het traceren kan de volledige dendritische boom worden gereconstrueerd en geanalyseerd. De fan-diagramanalyse van verschillende fan-diagrammen afkomstig van diverse muizen kan worden gebruikt als een objectieve vergelijkingsmethode. De tweede methode is het visualiseren van de dendritische arborisatie met extended depth of field-beeldvorming.Ten slotte wordt een panoramische methode gebruikt om meerdere beelden met hoge vergroting samen te voegen tot één compositiebeeld met een hoge resolutie voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van dendrieten in het gehele gebied van interesse. De demonstratie van deze procedure zal GI mobi. AMI research flows uit mijn laboratorium zijn. Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden is het gebruiksgemak en de snelheid van acquisitie en gegevensverzameling.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurobiologie, zoals de beoordeling van dendritisering in aangetaste hersengebieden en de evaluatie van de effecten van verschillende therapieën op dendrieten. In deze procedure wordt het muizenbrein, één dag nadat het is gefixeerd in 4% Paraformaldehyde, gedurende 48 uur bij vier graden Celsius in een sucrose-oplossing geplaatst voor dehydratie. Verwijder de hersenen uit de sucrose en plaats ze direct op koperblokken die op droogijs zijn geplaatst.Vul het blokje met OCT en markeer de oriëntatie van de hersenen met de bulbus olfactorius als referentiepunt. Snijd coupes van 70 micron dikte bij -20 °C met een cryostaat, plaats deze in cryoprotectant-oplossing en bewaar ze bij -20 °C tot gebruik. Incubeer de coupes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in waterstofperoxide in methanol, gevolgd door een opwarmingsperiode van een half uur bij 37 °C in TBS.Incubeer de coupes gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur met 0,3% Triton en normaal paardenserum vóór de kleuring met het DCX-antilichaam op de volgende dag. Was de coupes drie keer opeenvolgend met TBS en incubeer de coupes gedurende twee uur bij kamertemperatuur met een gebiotinileerd paardanti-go. Was de coupes drie keer opeenvolgend met TBS gedurende telkens 10 minuten en incubeer ze gedurende 1,5 uur met een B, C light.Voeg bij kamertemperatuur waterstofperoxide toe aan de DAB-oplossing en incubeer de coupes onmiddellijk vijf minuten in deze oplossing. Beëindig de reactie door ze drie keer te wassen met ijskoude TBS, gevolgd door één wasbeurt in TTBS bij kamertemperatuur. Dehydrateer de coupes met behulp van een serie ethanoloplossingen.Vijf minuten elk, eerst met xyleen en vervolgens met een heldermiddel, en dek daarna af met een dekglas met behulp van DPX. Nadat de coupes volledig zijn opgedroogd, wordt overtollig DPX op de glasoppervlakken met een scherp mesje verwijderd en worden ze één voor één op de scantafel van de microscoop geplaatst. Het visualisatiesysteem bestaat uit een microscoop die is uitgerust met een joystick voor de scantafel en een 12-bits kleurencamera.Start vervolgens het NeuroLucida-programma en open een nieuw gegevensbestand. Plaats een referentiepunt op het scherm door met de muisaanwijzer op een willekeurige plek te klikken om alle pictogrammen van het gereedschapspaneel van het programmavenster te activeren. Klik daarna op het pictogram voor vrije joystickbediening in de werkbalk en gebruik de joystick om de gyrus dentatus van de hippocampus te lokaliseren.Selecteer in het eerste gedeelte van het tabblad 'tools' in het programma venster de 'serial section manager'. Klik op het icoon voor nieuwe secties in de linkerbenedenhoek van het venster om het instelvenster voor seriële secties te openen. Selecteer vervolgens het instelvenster voor seriële secties en voer het totale aantal secties in dat hippocampale regio's bevat.Select vervolgens het evaluatie-interval en voer de dikte van de sectie in. Begin met het traceren van de gyrus dentatus-regio door op het icoon voor vrije hand contourtekenen in de werkbalk te klikken. Omtrek vervolgens de korrelcellaag van de gyrus dentatus.Selecteer 100 x in het vergrotingsmenu. Voeg vervolgens een druppel immersie-olie toe aan het coupesectie en schakel het objectief over naar 100 x. Lokaliseer de cellichamen en dendrieten van de dentate granulaire cellen onder dit objectief.Focus vervolgens op een geselecteerd neuron en klik op het icoon voor neuron-tracing. Trek op de werkbalk de omtrek van het cellichaam van de dentate granulecel na. Klik met de rechtermuisknop wanneer het traceren is voltooid om 'finish cell body' te selecteren.Begin nu met het handmatig traceren van de dendrieten in de X-, Y- en Z-richting, en volg elke vertakking met behulp van de joystick en de Z-motorstuurknop. Selecteer bij een bifurcatie- of trifurcatieknooppunt de desbetreffende optie. Traceer via het vervolgkeuzemenu elke vertakking die vanuit deze knooppunten ontstaat aan het einde van elke tak. Klik met de rechtermuisknop en selecteer 'ending' (einde) in het vervolgkeuzemenu.Gebruik de pijltoets-pictogrammen in het softwarevenster. Selecteer willekeurig een andere korrelcel van de gyrus dentatus en herhaal de traceringsprocedure zoals zojuist gedemonstreerd. Sla de volledige tracering op.Start nu NeuroLucita Explorer voor neuronanalyse. Open het eerste NRX-gegevensbestand van de eerste muis uit de experimentele groep. Voeg het NRX-bestand van de tweede muis uit de experimentele groep toe en ga zo verder tot alle NRX-bestanden van deze groep zijn toegevoegd.Select onder het tabblad analyse 'fan in diagram' om het venster 'fan in analysis' te openen, vink 'dendrites' aan en klik op 'display' voor de verbindingen en vertakkingspatronen van dendrieten voor deze groep muizen. Sluit bij deze procedure de microscoop aan op een digitale camera. Plaats een coupesectie op de scantafel die is aangesloten op de microscoop en schakel over naar een 10 x objectief.Verplaats vervolgens de tafel naar het gebied van interesse. Start een programma voor videocapturing en druk op de opnameknop. Zodra op de opnameknop is gedrukt, gebruikt u de macro-focusknop om in totaal vier seconden lang van de bovenkant naar de onderkant van de sectie te bewegen. Gebruik nu de freeware Image J om de VI-videobestanden om te zetten naar een ongecomprimeerd formaat voordat u het resulterende videobestand opslaat.Start een programma voor beeldanalyse en open het VI-bestand. Ga naar het procesmenu en klik op extended depth of field. Selecteer het bijbehorende videobestand in de uitvoeropties.Selecteer 'generate composite best focus image' in de opties voor focusanalyse. Selecteer de opties 'normalized illumination' en 'max local contrast'. Klik vervolgens op 'create' om een resultaatbeeld te genereren, dat alle gefocuste pixels over de Z-as representeert.Sla daarna het resulterende beeld op. Plaats in deze stap een sectie op de scantafel die is verbonden met de microscoop. Verplaats de tafel naar het gebied van interesse.Start vervolgens het programma voor beeldacquisitie met een 10 x objectief, neem beelden met een hoge resolutie op van het interessegebied en sla deze op, waarbij u ervoor zorgt dat er een overlap van ten minste 10% tussen de beelden is. Gebruik daarna de Image Composite Editor om de beelden achteraf samen te voegen. Ga naar het bestandmenu en klik op 'nieuw panorama'.Selecteer de map waarin de afbeeldingen zijn opgeslagen. Selecteer vervolgens de afbeeldingen die bij dezelfde regio horen en klik op Okay. Klik op de knop voor export naar schijf en sla de afbeelding op.Deze afbeelding is een foto met extreem hoge resolutie van het gebied van interesse die voor analyse kan worden gebruikt. Deze figuur toont de visualisatie van dendritische arborisatie met en zonder EDFI-methoden. De traditionele methode om het beste focusvlak te vinden werd vergeleken met EDFI, waarbij significant hogere waarden voor het dendritische oppervlak werden gevonden.Er werden resultaten gevonden met behulp van de EDFI-methode. De kwantificering van de lengte en het volume dat wordt ingenomen door dendrieten van verschillende vertakkingsordes wordt hier getoond. De maximale lengte en het maximale volume werden bereikt bij orde één.Hier is een histogram van de dendritlengte van granulaire cellen in de gyrus dentatus. De meeste dendritische segmenten van de DCX-gekleurde DDR's hadden een lengte van 13 tot 26. Deze rode stippellijn geeft de normale verdeling weer van de gegevens die na deze procedure zijn verkregen.Andere klassieke methoden, zoals neuro Lucid, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over het volume en het oppervlak dat door dendrieten wordt ingenomen. De techniek die we hier hebben gedemonstreerd, zal onderzoekers op het gebied van de neurobiologie enorm helpen om niet alleen de organisatie van neuronale structuren te beoordelen, maar ook om niet-neuronale kleine structuren, zoals microglia, in dikke hersensecties te evalueren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de omvang van neuronale projecties in een relatief korte periode kunt beoordelen.

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop werd aangetoond in deze video opgenomen protocol.

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Dit protocol laat zien hoe u een betrouwbare HFS-methode in muizen. Neuronen in de hippocampal getand gyrus zijn elektrisch gestimuleerd door HFS direct en niet indirect in vivo. Neuronale activiteit en moleculaire signalering zijn onderzocht door c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring, respectievelijk; neurogenese wordt gekwantificeerd door bromodeoxyuridine labeling assay.

Een invasieve methode voor de activatie van de muis getand Gyrus door hoogfrequente stimulatie

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

De gyrus dentatus van de hippocampus vervult essentiële en verschillende functies bij het leren en het geheugen. Dit protocol beschrijft een reeks robuuste en efficiënte procedures voor in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de gyrus dentatus bij vrij bewegende muizen.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

Leer dendritische arborisatie beoordelen in de hippocampus van muizen met twee beeldvormingsmethoden. Real-time tracering en extended depth of field imaging bieden complementaire data voor kwantitatieve analyse van neuronale structuren.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Meer video's verkennen