Name: Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer de productie van EGFRvIII-specifieke CAR T-cellen voor adoptieve immunotherapie bij glioblastoom. Deze methode combineert standaardzorg met bestraling en temozolomide om de anti-tumorwerking te versterken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Laura Johnson en Dr. Richard Morgan danken voor het verstrekken van de CAR retrovirale constructie. De auteurs danken ook Giao Ngyuen voor haar hulp met de dosimetrie voor volledige hersenbestraling. Dit werk werd ondersteund door een NIH NCI-subsidie 1R01CA177476-01.

Dit protocol is gebaseerd op experimentele ontwerp waarbij 10 muizen behandeld met 10 7 CAR T-cellen elk. Dit betekent dat 10 8 CAR T-cellen nodig zijn; de opbrengst moet worden overschat door 5 x 10 7 -1 x 10 8 om rekening te houden voor het verlies van de levensvatbaarheid. Het volgende protocol wordt geschaald tot ongeveer 200 x 10 6 cellen genereren. De cellen worden vervolgens intraveneus toegediend aan vrouwelijke C57BL / 6 muizen met 9 dagen vastgesteld syngene EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren, ontwikkeld uit de bestaande KR158B astrocytoma of B16 melanoma cellijnen. Gelijktijdig met CAR T cel generatie worden tumordragende muizen waaraan klinisch relevante doses lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) en WBI (16.5 Gy). Muizen werden gehandhaafd en onder-pathogeen-vrije omstandigheden aan de Duke University Medical Center (DUMC) gefokt. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Duke University Institution goedgekeurdal Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Toediening van Temozolomide to-muizen met een tumor Dagen 0 tot 4: <ol><li> Bereken het totaal aantal muizen in te spuiten en vermenigvuldigen met 0,5 volume van TMZ oplossing nodig (bijvoorbeeld 30 muizen x 0,5 ml = 15 ml TMZ) bepalen en voeg 1,5 ml om deze hoeveelheid te verantwoorden overloop (16.5 ml TMZ ). </li><li> Vermenigvuldig dit totaal volume van 3 mg / ml van het gewicht van gevriesdroogde TMZ benodigde bepalen (bijvoorbeeld 16.5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Weeg deze in een 50 ml conische. LET OP: TMZ is giftig bij inademing, inslikken en contact met de ogen, huid en slijmvliezen. Overleggen met de veiligheid instelling beroeps- en / of milieu en gezondheid en wellness-afdeling voor aanbevelingen over het verminderen van het risico van blootstelling. </li><li> Vermenigvuldig het totale volume met 0,15 om de hoeveelheid dimethylsulfoxide bepalen (DMSO) vereist (bijvoorbeeld 16.5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter steriliseren dit volume DMSO (plus nog eens 2 ml te verantwoorden spill) door een 0,2 urn filter in een steriele buis. Voeg 2,475 ml steriel DMSO aan de TMZ poeder. </li><li> Plaats de TMZ / DMSO oplossing in een bekerglas met water over een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10-15 min. Zodra TMZ volledig is opgelost, moet de oplossing lichtgeel van kleur geworden; als de oplossing wordt roze, dan is de TMZ wordt afgebroken en een nieuwe oplossing moet worden bereid met een frisse veel TMZ. </li><li> Bereken het juiste volume steriele zoutoplossing nodig door vermenigvuldiging 0.85 door het totale volume (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml zoutoplossing). Voeg 15 ml steriele zoutoplossing in een 50 ml conische. Terwijl TMZ oplossen in de DMSO, warmte zoutoplossing tot 65 ° C. </li><li> Vortex de TMZ / DMSO-oplossing zodat de TMZ poeder volledig is opgelost en voeg langzaam opgewarmd fysiologische zoutoplossing om de TMZ / DMSO-oplossing. </li><li> Direct na bereiding, volledig laden 15 x 1 ml tuberculine syringes met TMZ oplossing voor toediening tot 4 dagen gevestigde muizen met een tumor. </li><li> Herhaal deze procedure op dagen 1 tot 4 voor een totaal van vijf TMZ besturen. </li></ol> 2. Whole Brain Bestraling van-muizen met een tumor Dagen 2 tot 4: <ol><li> Schakel de X-ray bestraler en laat deze warm-up van de volledige spanning. Zorg ervoor dat de juiste filter is op zijn plaats en het invoeren van de juiste spanning en de huidige instellingen (Figuur 2A). OPMERKING: De dosimetrie van de bestraler moet vooraf worden vastgesteld op het juiste voltage instellingen en grid (Figuur 2A, B) te bepalen. </li><li> Bereken de tijd die nodig is om te resulteren in 5,5 Gy röntgenstraling. Als bijvoorbeeld röntgenstralen worden geleverd met een snelheid van 2 Gy / min, vervolgens 2,75 min nodig om een ​​totaal van 5,5 Gy leveren. Voer de juiste tijdsduur. OPMERKING: Tabel 2 geeft de muis WBI doseert eennd hun klinische equivalenten mens. In het kader van hooggradig glioom, 60 Gy gefractioneerd WBI (2 Gy fracties, 5 dagen / week gedurende 6 weken) is de klinische kwaliteit van de zorg, en de muizen equivalente hier gebruikt wordt is 16,5 Gy (5,5 Gy x 3). </li><li> Bereid een verse oplossing van ketamine / xylazine systemische verdoving door toevoeging van 2 ml ketamine en xylazine 1 ml tot 17 ml zoutoplossing zodat de eindoplossing 10 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine. </li><li> Weeg muizen en beheren 10 pl ketamine / xylazine intraperitoneaal per gram lichaamsgewicht zodanig dat dieren krijgen een dosis ketamine 100 mg / kg en 10 mg / kg xylazine. Muizen moet volledig worden verdoofd en zichtbaar ademhaling binnen 2 min van ketamine / xylazine administratie. </li><li> Om oogheelkundige vocht in verdoofd dieren te behouden, wrijf een kleine hoeveelheid van kunsttranen zalf op elk oog. </li><li> Plaats verdoofde muizen op het net zodat koppen geplaatst in het gebied dat de hoogste X-ray in ontvangtintensiteit (Figuur 2B, C). Schild lichamen van de nek naar beneden met geschikte afmetingen lood slang aan systemische X-ray levering (figuur 2D) te blokkeren. </li><li> Plaats gepositioneerd muizen onder de x-stralen zodat de laser duidt het middelpunt van de röntgenbundel is de coördinaat (0,0) op de grid. Begin X-ray levering. </li><li> Als X-ray levering is voltooid, verwijdert dieren uit de bestraler en leg ze op een warme verwarming pad. Laat verdoofd dieren niet huis met dieren bij bewustzijn, totdat de dieren voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstbeen recumbence behouden. Zodra dieren borstbeen recumbence kan handhaven, plaats bewuste dieren terug in hun geschikte kooien. </li><li> Herhaal deze procedure op dagen 3 en 4 voor een totaal van drie gefractioneerde doses straling. </li></ol> 3. Transfectie Dag -1: <ol><li> Bereid D10 media door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS) tot 500 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM). </li><li> Bereid T cel media (TCM) door toevoeging van 5,5 ml L-Glutamine, 5,5 ml natrium pyruvaat, 5,5 ml niet-essentiële aminozuren, en 5,5 ml penicilline / streptomycine (pen / strep) tot 500 ml RPMI-1640 medium. Voeg vervolgens 550 pl 2-mercaptoethanol en 550 pl gentamicine. Tot slot, voeg 50 ml FBS. </li><li> Oogst in vitro gekweekte HEK293T cellen en breng aan een concentratie van 7,5 x 10 6 cellen / ml in D10 media. </li><li> Plaat 10 ml D10 medium en voeg 1 ml van HEK293T celsuspensie in elk van 16 x 10 cm poly-D-lysine (PDL) beklede platen. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> Dag 0: <ol start="6"><li> Vervang medium met 10 ml verse D10 tenminste 30 minuten voor het transfecteren van cellen. </li><li> Bepaal de hoeveelheid plasmide, PCL-Eco vector en liposomaal transfectiereagens vereist voor transfectie door het totale aantal platen vermenigvuldigen + 1 (16 + 1 = 17) met 14,1 ugvector plasmide (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 ug PCL-Eco vector (9,9 x 17 = 168.3 pg), en 60 pi liposomaal transfectiereagens (60 x 17 = 1020 pi). Alle reagentia moeten bij kamertemperatuur voor het bereiden van oplossingen. </li><li> Label twee buizen A en B. In buis A, voeg 239,7 ug vector plasmide en 168,3 ug PCL-Eco vector tot (1,5 x 17) ML verlaagde serum gemodificeerd Eagle&#39;s medium (RS-MEM). In buis B, voeg 1020 ul liposomaal transfectiereagens naar (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Incubeer A en B afzonderlijk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Mix A en B samen zachtjes (vortex gedurende 1-2 seconden of invertsuiker meerdere malen) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur lipide / DNA complex. </li><li> Voeg lipide / DNA-complex druppelsgewijs naar HEK293T cellen in 10 cm schotel. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 6-8 uur of overnacht (niet meer dan 24 uur). </li><li> Na 6-8 uur incubatie, vervangen medium met 12 ml vers TCM voor virale productie. Deze vergulde mediaworden gebruikt op dag 2 virale supernatant voor T-cel transductie. </li></ol> 4. Splenectomie en T Celbereiding Dag 0: <ol><li> Giet 10 ml van TCM in een 50 ml conische en plaats op ijs milt collectie. </li><li> Offer het juiste aantal dieren CO 2 stikken en secundaire onthoofding: Place dieren in een kooi ontvangende CO 2 bij een stroomsnelheid van 10-30% kooi / minuut, per American Veterinary Medical Association richtlijnen (niet meer dan 5 dieren worden tegelijkertijd opgeofferd) tot ademhaling eindigt en twee minuten daarna. Verwijder dieren uit de CO 2 kamer en onthoofden. OPMERKING: Een milt van een 6-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis zal ongeveer 4,5-5 x 10 7 splenocyten opleveren. Hier vindt 4 milt worden geoogst voor ongeveer 200 x 10 6 cellen. </li><li> Leg de muis zodanig dat de juiste zijde naar boven is gericht, enspuiten met 70% ethanol. Met de tang, pak een dunne huidplooi onder het linker ribbenkast en snijd een kleine incisie met de schaar. Trek de huid, voorzichtig pak een dunne plooi van het buikvlies met een tang, en snijd een kleine holte. </li><li> De milt is een klein, langwerpig, donkerrood orgaan dat een afgeplatte boon lijkt; delicaat pak de milt met de tang en accijnzen door het wegsnijden van het omringende bindweefsel. Plaats de uitgesneden milten in de conische 10 ml TCM op ijs. </li><li> Giet milten over een 70 urn maas zeef en splitsen door stampen met het stompe uiteinde van de binnenkant van een spuit 5 ml van een enkele celsuspensie te genereren. Er kunnen maximaal twee milt moeten worden uitgesplitst per zeef. </li><li> Gebruik een kleine hoeveelheid TCM zorgvuldig wassen zeef volgende uitsplitsing voor resterende splenocyten verzamelen. Bundelen alle uitgesplitste milt in een eencellige suspensie. Breng uiteindelijke volume op 50 ml met TCM voor een wasbeurt van eend draaien bij 300 xg gedurende 10 min. </li><li> Bereid een oplossing van 1x lysebuffer door toevoeging van 5 ml 10x lyseerbuffer tot 45 ml steriel water. Als rode bloedcellen, resuspendeer pellet in 5 ml van 1 x lysisbuffer per milt in 50 ml conische, goed mengen door voorzichtig pipetteren en neer te elimineren. Als meer dan 5 milt, gebruik maken van een 250 ml centrifugebuis. Plaats conische of centrifugebuis in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min. </li><li> Verwijder de lysis reactie van het waterbad en voeg TCM bij een 1: 1 verhouding met lysis buffer om de reactie te neutraliseren. Was door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min. </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer pellet volledig in TCM (2 ml / milt, 8 ml totaal 4 milten) door en neer te pipetteren. </li><li> Tellen cellen door toevoeging van 10 ui celsuspensie 190 pi trypan blauw (1:20 verdunning). Vermenigvuldig het aantal in één van de vier gerasterde vierkanten verkregen door 20 x 10 x 4 totaal volume (8 ml) aan het totale aantal cellen te verkrijgen (bijvoorbeeld 125 cellen x 20 x 10 4 </sup&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 splenocyten). </li><li> Verdun cellen tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml in TCM, gesupplementeerd met 2 ug / ml concanavaline A (ConA) en 50 IU / ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2). Aldus, 200 x 10 6 splenocyten, voeg 92 ml medium 8 ml cellen 200 ug ConA en 5000 IU rhIL-2. </li><li> Voeg 2 ml cellen aan elk putje van 24-well weefselkweek behandelde platen, zodanig dat 4 x 10 6 cellen in elk putje (bijvoorbeeld 100 ml cellen ongeveer 4 platen nodig). </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 5. Transduction Dag 1: <ol><li> Bereken het aantal niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes die nodig is voor transductie door het aantal milten geoogst 2 (8 platen nodig voor 4 milten) te vermenigvuldigen. </li><li> Bereken vervolgens de vereiste hoeveelheid recombinant humaan fibronectine fragment (RHFF) oplossingmoest coat platen door vermenigvuldiging (totaal aantal putten + 3) x 0,5 ml (8 x 24 wells platen = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Bereid 97,5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die RHFF in een concentratie van 25 ug / ml van het totale volume te vermenigvuldigen met 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 g). Voeg deze hoeveelheid RHFF tot 97,5 ml PBS. </li><li> Coat niet met weefselkweek behandelde platen met 24 putjes door het toevoegen van 0,5 ml PBS / RHFF oplossing per put. </li><li> Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li></ol> Dag 2: <ol start="6"><li> Dump PBS / RHFF oplossing van niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes. </li><li> Voeg 1 ml / putje 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Verwijder BSA door stevig upending plaat. Was door toevoeging van 2 ml PBS. </li><li> Verzamel viraal supernatant door de overdracht van de media uit elke HEK293T PDL plaat in een 250 ml centrifugebuis en spin 10 min bij 500 x g. </li><li> Breng zorgvuldig virale supernatant in een frisse 250 ml centrifugebuis, het zijn zeker niet naar de cel pellet die zich kunnen gevormd verstoren. </li><li> Voeg verse TCM aan de virale supernatant zodanig dat het uiteindelijke volume is 3 ml meer dan de hoeveelheid die nodig is voor RHFF-beklede putjes. Bijvoorbeeld, voor 192 RHFF beklede putjes, breng het volume van virale supernatant 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Verwijder gekweekte splenocyten uit de incubator en resuspendeer door voorzichtig pipetteren en neer 2-3 keer in elk putje. Over te dragen aan een 250 ml conische. Bij gebruik van een multichannel pipet, met behulp van een steriele reservoir vóór de overdracht zal helpen bespoedigen deze stap. Telling zoals eerder beschreven en rotatie bij 300 xg gedurende 10 min. </li><li> Voeg rhIL-2 virale supernatant bij een concentratie van 50 IE / ml. Voeg bijvoorbeeld 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml viraal supernatant. </li><li> Resuspendeer splenocyten virale supernatant bij 1 x 10 6 cellen / ml </li><li> Voeg 1 ml / putje van splenocyten suspensie RHFF-beklede platen met 24 putjes. </li><li>Spin voor 90 min op basis van de volgende instellingen: 770 xg, acceleratie = 4, rem / vertraging = 0, 32 ° C. </li><li> Bereid een TCM oplossing met 50 IU / ml rhIL-2. Bijvoorbeeld, bereiden 200 TCM door toevoeging 10.000 IE rhIL-2. Voeg 1 ml rhIL-2 / TCM aan elk putje na centrifugeren. </li><li> Kweek overnacht bij 37 ° C in 5% CO2. </li></ol> 6. AUTO T-cel Cultuur en Oogst Dag 3 en 4: <ol><li> Als T-cellen te bereiken&gt; 80% samenvloeiing, kunnen cellen worden gesplitst (dit gebeurt meestal op dag 3 of dag 4). Cellen splitsen voorzichtig pipetteren en neer in elk putje 2-3 keer, en beweeg 1 ml van elk putje naar nieuwe putjes van een verse 24-well weefselkweek behandelde plaat. Vervolgens voeg 1 ml vers TCM met 50 IU / ml IL-2 aan elk putje zodat uiteindelijk volume 2 ml in alle putjes. </li><li> Als cellen niet&gt; 80% samenvloeiing bereiken, het uitvoeren van een half media verandering door langzaam pipetteren off 1 ml van media vanaf de bovenkant van elk putje. Vermijd disturbing cellen vestigden zich op de bodem tijdens het verwijderen van de media. Voeg 1 ml vers TCM met 50 IE / ml rhIL-2. </li></ol> Dag 5: <ol start="3"><li> Resuspendeer CAR T-cellen door voorzichtig pipetteren en neer 3 keer in elk putje overgebracht in een 250 ml centrifugebuis. Spin-cellen bij 300 xg gedurende 10 min. </li><li> Volledig aspireren supernatans zonder verstoring van pellet. Eenmaal met PBS, tellen cellen zoals eerder beschreven, en wassen met PBS nogmaals. Een typische AUTO T-cel-opbrengst is ongeveer 1 x 10 6 cellen per putje (8 platen x 24 putten = 192 x 10 6 CAR T-cellen). </li><li> Resuspendeer cellen in PBS bij een concentratie van 5 x 10 7 / ml voor een injectie van 1 x 10 7 in een volume van 200 pg (bijvoorbeeld voor 192 x 10 6 CAR T-cellen, resuspendeer pellet gewassen in 3,84 ml PBS). </li></ol> 7. AUTO T-cel Administratie-muizen met een tumor Dag 5: <ol><li> Transport cellen op ijs dierenverblijf voor intraveneuze injectie. Load 500-1.000 ul in insuline spuit met 27-31 G naald, ervoor te zorgen dat alle luchtbellen worden uitgestoten. </li><li> Pak een muis aan de basis van de staart en plaats in buis restrainer. </li><li> Trek de staart strak met de ader naar boven en glijden de naald ongeveer 1-2 mm onder de huid in de ader door deze evenwijdig aan de staartader. Langzaam verdrijven 200 ul in de ader. Als de naald correct is geplaatst in de ader, zal het volume gemakkelijk stromen; anders zal er weerstand en de naald zal nodig hebben van de staart worden verwijderd en correct opnieuw geplaatst. </li></ol>

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li>
<li>Hodi, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).</li>
<li>Schwartzentruber, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gp100+peptide+vaccine+and+interleukin-2+in+patients+with+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).</li>
<li>Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+effector+T+cells+expressing+chimeric+T+cell+receptor+with+antibody+type-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity.</a> Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+T+cells+engineered+to+coexpress+tumor-specific+receptors%3A+persistence+and+antitumor+activity+in+individuals+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma.</a> Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+and+remissions+of+malignancy+along+with+cytokine-associated+toxicity+in+a+clinical+trial+of+anti-CD19+chimeric-antigen-receptor-transduced+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.</a> Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).</li>
<li>Wikstrand, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+EGFRvIII+are+tumor+specific+and+react+with+breast+and+lung+carcinomas+and+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.</a> Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).</li>
<li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFRvIII+mCAR-modified+T-cell+therapy+cures+mice+with+established+intracerebral+glioma+and+generates+host+immunity+against+tumor-antigen+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.</a> Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).</li>
<li>Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lymphocyte+function+by+glioblastoma-derived+transforming+growth+factor+beta+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2.</a> J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).</li>
<li>Wintterle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+B7-related+molecule+B7-H1+by+glioma+cells%3A+a+potential+mechanism+of+immune+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis.</a> Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).</li>
<li>Fecci, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li>
<li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-homolog+1+expression+by+human+glioma%3A+a+new+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li>
<li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells%2C+upon+contact+with+human+glioma+cells%2C+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li>
<li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide%3A+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li>
<li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li>
<li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li>
<li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li>
<li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li>
<li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li>
<li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li>
<li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide%3F+The+glioblastoma+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li>
<li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dense+temozolomide+regimens%3A+antitumor+activity%2C+toxicity%2C+and+immunomodulatory+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li>
<li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li>
<li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li>
<li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma%3A+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li>
<li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8%28%2B%29+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li>
<li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+CD4%2B+lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide%3A+a+toxicity+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li>
<li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li>
<li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
<li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

De behandeling tijdlijn hier beschreven is ontworpen voor het modelleren klinische kwaliteit van de zorg en het benutten ervan bij de CAR adoptieve therapie. CAR T cel doses TMZ regimes en radiotherapie toediening kan worden gemodificeerd ter verbetering van in vivo T-cel activiteit lymphodepletion en tumor doden. TMZ regimes kan worden verhoogd tot gastheer myeloablatie en verhoogde expansie van adoptief overgedragen cellen 30 verkregen. Bovendien kan de lymphodepletive effecten van TMZ worden geïnc...

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersentumor en is altijd fataal. Chirurgische resectie gekoppeld aan aspecifieke zorgstandaard chemotherapie en radiotherapie niet volledig te elimineren kwaadaardige cellen, resulterend in een sombere prognose van minder dan 15 maanden bij patiënten met deze ziekte 1. Daarentegen immunotherapie biedt een nauwkeurige benadering specifiek richten op tumorcellen, en heeft dus de potentie om te dienen als een zeer effectieve behandeling platform met verminderd risico van toxiciteit zekerheden 2-4. T-cellen ontwikkeld ex vivo te uiten chimeer antigen receptoren (auto&#39;s) bieden een veelzijdige strategie voor tumor immunotherapie. Auto&#39;s worden gegenereerd door het fuseren van het extracellulaire variabele gebied van een antilichaam met één of meer intracellulaire T-cel signalerende moleculen (s), in plaats van een full-length major histocompatibility complex (MHC) -beperkte T-cel receptor 5. Deze wijze van antilichaam-achtige antigeen erkennOp maakt reactieve antigen-specifieke T-cellen te herkennen en tumorantigenen in afwezigheid van MHC en kan worden aangepast voor een virtueel oneindig antigeen repertoire. CAR T-cellen gemanipuleerd tegen diverse tumor antigenen aangetoond preklinische werkzaamheid en uitstekende belofte in de kliniek 6-9. Met name in de context van GBM, auto T cel targeting epidermale groeifactorreceptor variant III (EGFRvIII), een tumor-specifieke mutatie expressie op het celoppervlak 10, bleek de overleving verlengen-glioom dragende muizen 11. Ondanks hun veelzijdigheid, maar de klinische voordelen van CAR adoptieve therapie is nog niet volledig gerealiseerd, mede als gevolg van tumor-geassocieerde immunosuppressie en het immuunsysteem belastingontduiking 12-16 evenals uitdagingen bij het ​​opzetten en onderhouden van antigeen-specifieke T-cellen in vivo. Gebruik te maken van standaard van zorg (SOC) met immunotherapie kan mogelijk overwinnen een aantal van deze limitaties, resulterend in verhoogde werkzaamheid in zowel de preklinische en klinische setting. SOC voor post-resectie GBM bestaat uit een hoge dosis temozolomide (TMZ), een DNA-alkylerende stof 17, en het hele brein bestraling (WBI) 1. Deze behandelingen worden geacht om synergie met tumor vaccins via opregulatie van tumor MHC expressie 18-20 en het loskomen van antigenen door dode tumorcellen 17,19,21,22. Inderdaad, de toevoeging van TMZ 20,23 of 18,24 WBI leidt tot verhoogde antitumorale werkzaamheid van immuun gebaseerde behandelingen in de preklinische omgeving. Bovendien, net als vele niet-specifieke cytotoxische chemotherapeutica, TMZ bekend systemische lymfopenie 25,26, die kan worden benut als middel gastheer-conditioning voor adoptieve therapie platforms 27-29 veroorzaken. TMZ-gemedieerde lymphodepletion is aangetoond dat de frequentie en de functie van de antigeen-specifieke T-cellen verbeteren, wat leidt tot verhoogde werkzaamheid van een Adoptieve therapie platform tegen intracraniële tumoren 30. In de context van CAR therapie lymphodepletion fungeert als middel gastheer-conditioning zowel vermindering van het aantal endogene suppressor-T-cellen 31 en induceren homeostatische proliferatie 32 via verminderde concurrentie voor cytokinen 33, waardoor antitumoractiviteit 11,34 verbeteren. Gezien de synergetische relatie tussen GBM SOC en immunotherapie platforms evalueren adoptieve nieuwe therapieën en vaccins platforms in de context van SOC is essentieel voor het trekken van zinvolle conclusies inzake werkzaamheid. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het genereren en intraveneuze toediening van muizen EGFRvIII specifieke CAR T-cellen naast TMZ en WBI in muizen met EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren (zie Figuur 1 voor de behandeling tijdlijn). In het kort worden AUTO T-cellen gemaakt door retrovirale transductie. Menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen worden getransfecteerd met een DNA / lipide-complex (met de CAR vector en PCL-Eco plasmiden) virus, die vervolgens wordt gebruikt om geactiveerde muriene splenocyten die zijn geoogst en gekweekt in parallel transduceren produceren. Tijdens CAR generatie, zijn murine gastheren dragen EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren toegediend gefractioneerde hele brein röntgenbestraling en systemische TMZ behandeling bij doses vergelijkbaar klinische SOC. AUTO T-cellen worden vervolgens intraveneus te lymphodepleted gastheren geleverd. De volgende procedure wordt beschreven in zeven afzonderlijke fasen: (1) Toediening van temozolomide tumordragende muizen, (2) Whole Brain Bestraling van tumordragende muizen, (3) transfectie (4) Splenectomie en T cel bereiding, (5 ) Transduction, (6) AUTO T-cel Cultuur en Harvest, en (7) AUTO T-cel toediening aan muizen met een tumor. Deze fasen bestaan ​​uit verschillende stappen die 6-7 dagen bestrijken en tegelijkertijd worden uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Helper vector voor het genereren van CAR-retrovirus</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Niet-specifiek mitogeen om T-cel proliferatie en virale transductie te induceren</td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Faciliteert retrovirale transductie van T-cellen</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, pyruvaat</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293 kweekmedia</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life technologies</td><td>11058-021</td><td>Transfectie media</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>Aanvulling T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td>Aanvulling T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Life technologies</td><td>11140-050</td><td>Aanvulling T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>Reducerend middel om vrije radicalen te verwijderen</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>Aanvulling T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>Gentamicine (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td>Aanvulling T-cel kweekmedia</td></tr><tr><td>GemCell U.S. Origin Foetale Runderserum</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Biedt groeifactoren en voedingsstoffen voor in vitro celgroei</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA), Fractie V&ndash;Standaardkwaliteit</td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td><td>Blokkeert niet-specifieke binding van retrovirus aan retronectin-gecoate platen</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (10x concentraat)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lyseert rode bloedcellen tijdens de verwerking van splenocyten</td></tr><tr><td>70 &mu;m Steriele Cel Zeef</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtert grote weefseldeeltjes weg tijdens de verwerking van splenocyten</td></tr><tr><td>100 mm BioCoat Cultuurschotels met Poly-D-Lysine</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>Bevordert HEK293 cel adhesie om proliferatie na transfectie te maximaliseren</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Lyofilisaatpoeder bereid op de dag van toediening</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Noodzakelijk voor volledige oplossing van temozolomide</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Oplosmiddel voor temozolomide en ketamine/xylazine</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Ketamine oplossing</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Xylazine steriele oplossing 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

generatie van de car t-cellen voor adoptieve therapie in de context van glioblastoma standard of care

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptieve T-cel immunotherapie biedt een veelbelovende strategie voor het specifiek targeten en elimineren van kwaadaardige glioma's. T-cellen kunnen ex vivo worden gemodificeerd om chimere antigeenreceptoren te gaan uitdrukken die specifiek zijn voor glioma-antigenen (CAR T-cellen). De expansie en functie van adoptief overgedragen CAR T-cellen kan worden versterkt door de lymfodeletieve en tumordodende effecten van standaard chemotherapie en radiotherapie. We beschrijven een methode voor het genereren van CAR T-cellen die EGFRvIII targeten, een glioma-specifiek antigeen, en evalueren hun effectiviteit in combinatie met een muismodel van glioblastoma standaard behandeling. T-cellen worden gemodificeerd door middel van transductie met een retrovirale vector die het anti-EGFRvIII CAR-gen bevat. Diermodellen met tumoren worden onderworpen aan hostconditionering door een kuur van temozolomide en bestraling van de hele hersenen met dosisregimes die zijn ontworpen om de klinische standaardbehandeling te modelleren. CAR T-cellen worden vervolgens intraveneus toegediend aan geprimeerde gastheren. Deze methode kan worden gebruikt om de antitumoreffectiviteit van CAR T-cellen te evalueren in de context van standaard behandeling.

AUTO T-cellen worden gegenereerd door transductie met de EGFRvIII CAR retrovirale vector 11. Deze vector, MSGV1, werd ontwikkeld op basis van de SFGtcLuc_ITE4 vector 35, waarin de muizen stamcellen virus (MSCV) lange terminale herhalingen, de uitgebreide gag regio en envelop splice site bevat (splitsingsdonor, sd, en splice acceptor, nv), en virale verpakkingssignaal (ψ). De EGFRvIII CAR die het humane anti-EGFRvIII variabel fragment enkele keten (scFv) 139, samen met murine CD8TM, CD28, 4-1BB, en ...

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van genetisch gemodificeerde muizen T-cellen met een chimeer antigeenreceptor en het evalueren van de effectiviteit ervan in de context van de standaardbehandeling. Voor hooggradig glioom wordt dit bereikt door eerst te beginnen met de standaardbehandeling, bestaande uit bestraling van de gehele hersenen en toediening van temozolomide aan muizen. Vervolgens wordt een retrovirus geproduceerd dat de CAR-vector tot expressie brengt, waarna muizen T-cellen worden getransduceerd met het CAR-retrovirus.Ten slotte worden CAR T-cellen toegediend aan muizen die een standaardbehandeling hebben ondergaan, waarbij de CAR T-cellen uiteindelijk in combinatie met全hersenenbestraling en temozolomide worden toegediend. Deze toediening wordt gebruikt om te testen of conditionering van de gastheer door de standaardbehandeling de effectiviteit van een adoptieve T-celplatform verbetert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het veld van immunotherapie voor hersentumoren, zoals de anti-tumoreffectiviteit van nieuwe immunotherapieën in de context van de standaardbehandeling voor hooggradige gliomen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de effectiviteit van gen-gemodificeerde mi en T-cellen tegen hooggradige glioma's, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de evaluatie van T-celtherapie tegen melanomen, longtumoren en andere modellen van hersenmetastasen. Over het algemeen kunnen personen die onbekend zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat deze procedure vereist dat verschillende stappen parallel worden uitgevoerd.Een goede planning en organisatie van taken is daarom cruciaal. De procedure wordt gedemonstreerd door Catherine Uni en Carter s Deva, beide getalenteerde promovendi uit mijn laboratorium. Plaats de oplossing, na het bereiden van 3 mg/mL temozolomide of TMZ in DMSO, in een bekerglas met water op een warmteplaat bij 65 °C gedurende 10 tot 15 minuten.Zodra het TMZ volledig is opgelost, moet de oplossing lichtgeel van kleur worden. Vul 15 spuiten van één milliliter volledig met de TMZ-oplossing. TMZ moet binnen 90 minuten na bereiding worden toegediend om te voorkomen dat TMZ uit de oplossing neerslaat. Om de bestraling van de gehele hersenen uit te voeren, dient de röntgenbestraler te worden ingeschakeld en op te warmen; controleer of het juiste filter is geplaatst en voer de juiste instellingen voor spanning en stroom in.Zodra de muizen zijn gesedeerd, conform het tekstprotocol, worden de gesedeerde muizen op het rooster geplaatst met hun koppen in het gebied waar de röntgenintensiteit het hoogst is. Gebruik loden buisjes om de lichamen vanaf de nek naar beneden af te schermen om systemische röntgenbestraling te voorkomen. Plaats de muizen in de röntgenmachine wanneer de röntgenbestraling voltooid is.Haal de dieren uit de bestralingsinstallatie. Wanneer de dieren voldoende bij bewustzijn zijn en in sternumligging blijven, plaatst u ze terug in hun respectievelijke kooien. Nadat het D 10-medium is voorbereid en de HEC 2 93 T-cellen zijn geoogst volgens het tekstprotocol, voegt u één milliliter celluspendie van 7,5 × 10⁶ cellen per milliliter toe aan elk van de 10 cm poly-L-lysine-gecoate platen die 10 ml D 10-medium bevatten en incubeert u deze gedurende de nacht tot de volgende dag.Nadat het car-plasmide en het transfectiereagens zijn voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het lipide-DNA-complex druppelsgewijs toegevoegd aan de HEK 293T-cellen en zes tot acht uur geïncubeerd. Vervang vervolgens het medium door 12 ml vers T-celmedium of TCM. Giet daarna één milt door een cellzeef van 70 µm en disaggregeer deze met het stompe uiteinde van een 5 ml spuit om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.Nadat er een verse TCM-pool is bereid, wordt de milt gedisaggregeerd in een conische buis van 50 milliliter met TCM en gecentrifugeerd. De rode bloedcellen worden geëlimineerd door de cellen te resuspenderen in vijf milliliter 1x lysisbuffer per milt, waarbij de cellen goed worden gemengd door voorzichtig met de pipet op en neer te bewegen. Plaats de celsuspensie gedurende vijf minuten in een waterbad op 37 °C. Haal de lysisreactie uit het waterbad en voeg TCM toe in een verhouding van één-op-één met de lysisbuffer om de reactie te neutraliseren; was vervolgens door te centrifugeren bij 300 Gs gedurende 10 minuten.Nadat het supernatant is afgezogen, gebruik twee milliliter TCM per milt om de pellet opnieuw te resuspenderen. Om de cellen te tellen, voeg 10 µL cel-suspensie toe aan 190 µL trypaanblauw. Zodra het totale aantal cellen is berekend, gebruik TCM aangevuld met twee µg/mL concanavaline A en 50 IU/mL recombinant humaan interleukine 2 om de cellen te verdunnen tot een concentratie van 2 × 10⁶ cellen/mL. Voeg twee milliliter of 4 × 10⁶ cellen toe aan elke put van een behandelde 24-wells weefselkweekplaat en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO₂ op de dag na de splenectomie.Bereid PBS voor met 25 µg/mL recombinant menselijk fibronectinefragment (RHFF) en coat niet-tissue-culture-behandelde 24-wells platen door de volgende dag 0,5 mL van de oplossing aan elke well toe te voegen. Verwijder de oplossing uit de wells en voeg één mL per well 2% BSA in PBS toe; incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de BSA door de plaat stevig om te keren voordat u twee milliliters PBS toevoegt om te wassen. Nadat het virale supernatant van de HEC 2 93 T-cellen is verzameld, voegt u verse TCM toe tot een eindvolume in milliliters dat gelijk is aan het aantal met RHFF gecoate wells, plus een extra drie milliliters. Haal de gekweekte miltcellen uit de incubator en resuspendeer deze door twee tot drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren in elk.De cel-suspensies worden overgebracht naar een conische buis van 50 milliliter. Resuspendeer vervolgens de cellen in viraal supernatant tot een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Voeg daarna één milliliter van de complete suspensie per putje toe aan de putjes van de met RHFF gecoate platen.Centrifugeer de platen nu gedurende 90 minuten bij 32 graden Celsius en 770 GS, met een versnelling van vier en een reminstelling van nul tijdens het centrifugeren. Bereid 50 internationale eenheden per milliliter recombinant humaan IL twee voor in TCM. Voeg na het centrifugeren één milliliter van het medium toe aan elke put van de platen en incubeer dit gedurende de nacht.Als de T-cellen een confluentie van meer dan 80% bereiken, moeten de cellen worden gesplitst door in elke put twee tot drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren. Draag vervolgens één milliliter uit elke put over naar nieuwe putten van een verse, weefselkweek-behandelde 24-wells plaat. Voeg één milliliter vers TCM toe aan elke put, met 50 internationale eenheden per milliliter IL 2. Indien de cellen geen confluentie van meer dan 80% bereiken, moet de helft van het medium worden vervangen door voorzichtig één milliliter medium van bovenaf uit elke put weg te pipetteren en dit te vervangen door één milliliter vers TCM met 50 internationale eenheden per milliliter recombinant humaan IL 2. Resuspendeer de CAR T-cellen door in elke put drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren en breng deze over naar een centrifugebuis van 250 milliliter.Centrifugeer de cellen bij 300 GS gedurende 10 minuten. Aspireer vervolgens het supernatant volledig zonder het pellet te verstoren. Was de cellen met PBS en tel ze vervolgens voordat u ze een tweede keer wast.Een typische opbrengst van CAR T-cellen is ongeveer 1 × 10⁶ cellen per well met PBS Resus. Suspendeer de cellen bij een concentratie van 5 × 10⁷ per milliliter voor een injectie van 1 × 10⁷ in een volume van 200 µL. Gebruik voor injectie in tumordragende muizen een naald met een gauge van 27 tot 31 om 500 tot 1000 µL in een insulinespuit te laden, waarbij wordt gewaarborgd dat alle luchtbellen zijn verwijderd. CAR T-cellen werden gegenereerd door transductie met de E GFR V three CAR retrovirale vector, die de rine stamcelvirus- of MSCV long terminal repeats bevat.De uitgebreide gag-regio en envelope-spliceplaats en een viraal verpakkingssignaal. De EG FFR V three car die het humane anti EEG FRV three single chain variabel fragment 1 39 bevat, werd gekloond in de retrovirale vector in tandem met murine CD eight, tm CD 28 4 1 BBB en CD three zeta intracellulaire regio's. Na transductie kunnen EG FFR V three CAR T-cellen worden gekwantificeerd en gefenotypeerd via flowcytometrie met een tweekleurenpaneel bestaande uit een STRT bico rine-geconjugeerde gebiotineerde, EG FFR V three-afgeleide multimer en anti CD three fit C. Met behulp van het in deze video beschreven protocol wordt CAR-expressie routinematig waargenomen in 55 tot 70% van de CD three-positieve murine T-cellen.CAR T-cellen kunnen verder worden gefenotypeerd door andere fluorescentiegelabelde antilichamen toe te voegen aan het tweekleuren-CAR-panel, zoals te zien is in dit voorbeeld; kleuring voor CD8 en CD4 laat zien dat 70% van de getransduceerde CAR-cellen CD8-positieve T-cellen zijn, terwijl 20% CD4-positieve T-cellen zijn. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 12 uur gedurende een periode van één week worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals ELISA, ELISpot en/of intracellulaire cytokinestaining worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.Zijn uw met chimeer antigeenreceptor getransduceerde T-cellen bijvoorbeeld functioneel responsief op antigeenherkenning en is hun functionaliteit antigeenspecifiek? Vergeet niet dat werken met retrovirussen, temozolomide en röntgenstraling uiterst gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen vereist, zoals werken onder BSL-2 omstandigheden, het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, het uitvoeren van experimenten in de aangewezen gebieden en het volgen van een passende training voor het werken met dieren.En er moet altijd rekening worden gehouden met het gebruik van röntgenapparatuur bij het uitvoeren van deze procedures.

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a technique for the ex vivo generation of tumor antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Retroviral vectors carrying transgenic RNA are mixed with spleen cells in a medium supplemented with interleukin-2 to promote T-cell survival and proliferation. The mixture is then transferred to a plate coated with recombinant human fibronectin fragments and centrifuged to facilitate the fusion of the virus with the cell, allowing the RNA to integrate into the host...

An Ex Vivo Technique to Generate Tumor-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells

Een nieuwe methodologie die wordt gebruikt voor de behandeling van recidiverende glioblastoma beschreven. Deze behandeling benadering maakt gebruik van de toepassing van wisselende elektrische velden behandelen tumor (TTFields), bekend als TTF therapie in combinatie met bevacizumab, een doelgericht gestuurd middel dat momenteel FDA als monotherapie.

Tumor Behandeling Field Therapy in combinatie met bevacizumab voor de behandeling van terugkerende glioblastoma

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Hier presenteren we een protocol voor de productie en de preklinische beproeving van lymfkliertest CD19 auto T-cellen door retrovirale transductie en gebruik als een therapie tegen gevestigde syngeneic A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen met of zonder lymphodepleting Preconditionering.

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij kinderen, en locoregionale immuungebaseerde therapieën worden steeds vaker getest voor patiënten in klinische onderzoeken. Dit protocol beschrijft methoden voor locoregionale canule-implantatie bij muizen voor de preklinische evaluatie van immunotherapeutische infusies gericht op CZS-tumoren.

Intracraniële canule-implantatie voor seriële locoregionale chimere antigeenreceptor (CAR) T-celinfusies bij muizen

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Dit protocol schetst een gedetailleerde procedure voor het genereren van voorbijgaande chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen met behulp van niet-integrerend mRNA voor kankerimmunotherapie en biedt betrouwbare methoden voor het evalueren van CAR-T-cellen en hun cytotoxische functie.

Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker

Leer de productie van EGFRvIII-specifieke CAR T-cellen voor adoptieve immunotherapie bij glioblastoom. Deze methode combineert standaardzorg met bestraling en temozolomide om de anti-tumorwerking te versterken.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Meer video's verkennen