Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen
2 februari 2015
We presenteren een methode voor het induceren van verhoogde intraoculaire druk (IOP), door magnetische microsferen in het rattenoog te injecteren, om glaucoom te modelleren. Dit leidt tot sterke drukverhogingen en uitgebreide neuronale dood. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren, vereist geen herhaalde injecties en produceert stabiele langdurige IOP-verhogingen.
Het doel van deze procedure is om verhoogde intraoculaire druk bij de rat te induceren door injectie van paramagnetische microsferen in de voorste kamer van het oog. Plaats eerst een magnetische ring rond het oog van een verdoofd dier, was de magnetische microsferen, schorst ze opnieuw op in oplossing en laad ze vervolgens in een spuit. Injecteer vervolgens de magnetische microsferen in de voorste kamer van het oog.
Verwijder de magnetische ring tijdens het herstel. De procesgegevens verkregen uit histologische analyses zoals tunnelkleuring of optische zenuwkleuring kunnen de dood van retinale ganglioncellen meten die het resultaat is van verhoogde intraoculaire druk. Was de gesteriliseerde acht micron magnetische microsferenkralen drie keer in één milliliter Hank's gebufferde zoutoplossing door herhaaldelijk schorsen en centrifugeren bij 10.000 keer G gedurende vijf minuten.
Vervolgens schors opnieuw op in 0,5 milliliter HBSS voor een oplossing van 30 milligram per milliliter. Gebruik nu een rebound sonometer gekalibreerd voor gebruik in het rattenoog om vijf baseline IOP-metingen te nemen bij wakkere dieren. Na het verdoven, breng de ratten oculaire zalf aan op het niet-gerelateerde contralaterale oog om het vochtig te houden.
Breng tijdens de anesthesie 0,5%propaanhydrochloride, lokaal verdovend middel, aan op het operatieve oog. Was vervolgens dit oog met 5%povidoonjodium in water. Was na vijf minuten het povidoonjodium af en was het oog met 0,9% steriele zoutoplossing.
Houd het oog vochtig tijdens de anesthesie met regelmatige toepassing van steriele zoutoplossing. Plaats nu een steroïdale magneet rond het oog om het risico op irisletsel te minimaliseren en de verlies van kralen te beperken. Orienteer de naald tangiëntaal aan het oppervlak van het hoornvlies zo parallel mogelijk aan de iris.
Ga verder met het injecteren van 25 microliter van 30 milligram per milliliter, gammabestraalde magnetische microsferen in de voorste kamer. Laat de naald één minuut na de injectie op zijn plaats zitten om ervoor te zorgen dat de kralen zich in de IOC-hoornvinkel nestelen om de afvoer van water uit het trabeculaire netwerk te belemmeren. Werk de naald enkele seconden na de initiële nederzetting van de kralen iets schuin om enig lekken van water toe te staan en om tijdelijke stijgingen van de intraoculaire druk te minimaliseren.
Om het gebruik van de naald in afzonderlijke procedures te garanderen, spoel de naald met PBS. Vervolgens 70%ethanol, gevolgd door gedistilleerd water in dit stadium. Verwijder indien nodig de magneet en gebruik deze om kralen naar gebieden met onvolledige dekking te trekken.
Laat de magneet gedurende nog eens 10 minuten na de injectie om het oog heen liggen. Om ervoor te zorgen dat de kralen zich goed in de iridische hoornvinkel nestelen. Keer de anesthesie om met 0,25 milligram per kilogram ESOL-hydrochloride.
Dien 0,5 propaanhydrochloride toe voor analgesie en chloramfenicolzalf topisch om infectie te voorkomen. Laat de dieren herstellen op een verwarmingsmat totdat ze beweging herwinnen. Breng ze vervolgens over naar een warme box.
Gebruik het contralaterale oog als een niet-gerelateerde controle. Herhaal IOP-metingen om de twee tot drie dagen na toediening van de kralen en daarna om de twee tot drie dagen, definieer de criteria voor het opnemen van ogen in studies, inclusief de IOP die hoger is dan de contralaterale controledruk met vijf millimeter kwik, en de IOP mag niet hoger zijn dan 60 millimeter kwik. Ogen waarbij de druk binnen een week na de injectie terugkeert naar het uitgangspunt, mogen niet in de studies worden opgenomen. Het is echter mogelijk om opnieuw kralen te injecteren in ogen die geen hoge IOP ontwikkelen, indien gewenst.
Fixeer de gedissecteerde ogen en optische zenuw in 4%paraldehyde, beoordeel de schade aan retinale neuronen door tunnelkleuring en de schade aan de optische zenuw door toineblauw.Staining. In dit experiment induceerde injectie van magnetische kralen in de iridische hoornvinkel consequent een langdurige en robuuste stijging van de druk. Bovendien werd de drukstijging gedurende de gehele duur van het experiment gehandhaafd.
De gemiddelde IOP gemiddeld over de volledige lengte van het experiment voor controleogen zonder kraleninjectie was 19,7 plus minuus 0,3 millimeter kwik en 40,5 plus minuus 2,8 millimeter kwik voor ogen met kraleninjectie. Bovendien nam de piek-IOP toe van 22,8 plus minuus 0,3 millimeter kwik tot 49,9 plus minuus 2,3 millimeter kwik om te bepalen of verhoging van de IOP leidt tot de dood van retinale ganglioncellen. Tunnelkleuring werd uitgevoerd op retina's en histologie op transversale optische zenuwsecties in de retina.
We observeerden een toename van tunnelkleuring in ogen met kraleninjectie en verhoogde IOP. Het aantal apoptotische kernen steeg ongeveer 15 keer van contralaterale controle hypertensieve retina's zoals verwacht in ogen waarin magnetische kralen werden geïnjecteerd zonder druk, het aantal tunnel-positieve cellen was niet significant verschillend van die van niet geïnjecteerde controles. Verder onderzoek van de pathologie van de optische zenuw in het glaucoommodel toonde de accumulatie van odineblauw in veel van de axonen aan, wat duidt op degeneratie van deze cellulaire processen.
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het induceren van een verhoogde intraoculaire druk (IOP) bij ratten door magnetische microsferen in de voorste oogkamer te injecteren, ter modellering van glaucoom. De procedure leidt tot significante drukverhogingen en neuronale dood, waardoor een stabiele en langdurige stijging van de IOP wordt gerealiseerd zonder dat herhaalde injecties nodig zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Glaucoomonderzoek
Achtergrond
- Een verhoogde IOP is een belangrijke risicofactor voor glaucoom.
- Huidige modellen vereisen vaak meerdere interventies.
- Magnetische microsferen bieden een innovatieve benadering om IOP te induceren.
- Inzicht in neuronale dood bij glaucoom is cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar model op te zetten voor het bestuderen van glaucoom bij ratten.
- Om de impact van een verhoogde IOP op de dood van retinale ganglioncellen te beoordelen.
- Om de langetermijneffecten van injecties met magnetische microsferen op de IOP te evalueren.
Gebruikte methoden
- Injectie van paramagnetische microsferen in het oog van de rat.
- Meting van de IOP met behulp van een rebound-tonometer.
- Histologische analyse van schade aan het netvlies en de oogzenuw.
- Beoordeling van apoptotische celdood via TUNEL-kleuring.
Belangrijkste resultaten
- Significante en aanhoudende verhoging van de IOP in de met beads geïnjecteerde ogen.
- Toegenomen sterfte van retina ganglioncellen gecorreleerd aan de verhoogde IOP.
- Histologisch bewijs van degeneratie van de oogzenuw.
- Controleogen behielden normale IOP-waarden gedurende de gehele studie.
Conclusies
- De methode modelleert glaucoom bij ratten op effectieve wijze.
- Verhoogde IOP leidt tot significante neuronale schade.
- Dit model kan worden gebruikt voor toekomstig glaucoomonderzoek en therapeutische testen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode biedt een robuust en reproduceerbaar model voor het induceren van een aanhoudende verhoging van de intraoculaire druk bij ratten, wat mechanistische studies naar de pathofysiologie van glaucoom mogelijk maakt. Het ondersteunt de validatie van targets door de drukverhoging te koppelen aan de dood van retinale ganglioncellen en degeneratie van de oogzenuw, wat een voorspellende waarde biedt voor het screenen van neuroprotectieve therapieën. De eenvoud van het model en het langdurige effect verminderen de experimentele variabiliteit, wat cross-functionele samenwerking in discovery-pipelines vergemakkelijkt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de causale relatie tussen IOP en glaucoom mogelijk door het induceren van een aanhoudende drukverhoging.
- Operationele waarde: Biedt een consistent fenotype voor het evalueren van target engagement in pathogene pathways.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets die betrokken zijn bij de regulatie van het trabeculair netwerk en de dynamiek van het kamervocht.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare IOP- en histopathologische resultaten voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare basis- en verhoogde IOP-metingen voor screeningcampagnes van verbindingen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt dosis-responsevaluatie van IOP-verlagende middelen mogelijk via longitudinale drukmonitoring.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Recapituleert belangrijke glaucoompathologieën, waaronder apoptose van retinaire ganglioncellen en degeneratie van axonen in de oogzenuw.
- Operationele waarde: Faciliteert preklinische evaluatie van neuroprotectieve en IOP-modulerende verbindingen in een ziekterellevant systeem.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van biomarkers via correlatieve analyse van IOP-niveaus en metrieken voor neuronale sterfte.
Pipeline- & workflowintegratie
Het model past binnen het continuüm voor het ontdekken van behandelingen tegen glaucoom, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische werkzaamheidstesten, ondersteund door het vermogen om meetbare IOP-verhoging en daaropvolgende neurodegeneratie op te wekken.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk van IOP-gestuurde mechanismen bij pathologie van het netvlies en de oogzenuw.
- Screening: Gebruikt IOP als farmacondynamische biomarker voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de uitstroom van kamerwater.
- Analytics: Levert kwantitatieve IOP-metingen en histopathologische eindpunten voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt IOP-verhoging met mens-relevante neurodegeneratie, wat de translationele continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor IOP-inductie dat aanpasbaar is over diverse knaagdiermodellen voor longitudinale studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid over de causaliteit tussen IOP en glaucoom door aanhoudende drukverhoging en neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde microsfeerinjectie en magnetische positioneringstechnieken.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biologische variabiliteit in IOP-gebaseerde effectiviteitsstudies te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van glaucoomtherapie mogelijk op basis van IOP-verlagende en neuroprotectieve profielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in oogchirurgie bij knaagdieren en de meting van de IOP via rebound-tonometrie.
- Afhankelijk van de toegang tot steriele magnetische microsferen, sterilisatieapparatuur en reagentia voor histologische kleuring.
- Vereist cross-team standaardisatie van de criteria voor IOP-verhoging en de protocollen voor histologische beoordeling.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan de anatomie van het muisenz oog en het kleinere volume van de voorste oogkamer.
- Beperkt door de noodzaak van postoperatieve monitoring om transiënte pressure responders uit te sluiten en de consistentie van het model te waarborgen.
