Name: Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer een experimenteel glaucoommodel bij ratten door injectie van magnetische microsferen in de voorste oogkamer. Deze methode induceert verhoogde intraoculaire druk en retinale ganglionceldood voor onderzoek naar neurodegeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Peter Munro PhD bedanken voor zijn hulp bij het secteren van de oogzenuw. Dit onderzoek werd ondersteund door de Medical Research Council (G0901303), en gedeeltelijk door de Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, de Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight en Moorfields special trustess.

Ethische verklaring: Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), en in overeenkomst met het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken richtlijnen (goedgekeurd <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , laatste toegang 10 juni , 2014) en de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , laatst geopend op 10 juni, 2014). 1. oculaire hypertensie Inductie <ol><li> Laten experimentele glaucoom door verhogen van de intraoculaire druk (IOP) via unilaterale injectie van paramagnetische microbolletjes in de voorste kamer van Brown Norway ratten, gebaseerd op de methode van Samsel et al. 3 andere gepigmenteerde ratten kunnen geschikt zijn, hoewel deze zouden moeten worden gevalideerd eerst door de gebruiker. </li><li> Huis 250-300 g vrouwelijkeex-fokker Brown Norway ratten in een constante omgeving met weinig licht (40-60 lux) om dagelijkse schommelingen te minimaliseren in IOP 7, met toegang tot voedsel en water ad libitum. </li><li> Neem basislijn IOP metingen in wakkere dieren 8 voor de anesthesie en bead injectie, met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog 9. IOP wordt genomen als het gemiddelde van vijf metingen. </li><li> Verdoven ratten met 37,5 mg / kg ketamine en 0,25 mg / kg medetomidine hydrochloride intraperitoneaal afgeleverd. Bevestigen diepte van de anesthesie door het testen achterste voet reflexen dier, voorafgaand aan jodium applicatie (zie stap 1.5), en de kraal injectie povidon (zie stap 1.8). Dien 0,5% proparacaïne hydrochloride voor analgesie. OPMERKING: Laat de leerling niet in elk stadium verwijden. Dit zal helpen de kralen om beter te vestigen in de iridocorneale hoek, en het voorkomen van binding aan de lens. Toepassing oculaire zalf aan het hoornvlies drogen op-un bediende contralaterale ogen te voorkomen. </li><li> WVerbrand het operatieve oog met 5% povidon jodium in het water 10 5 min voorafgaand aan de injectie. </li><li> Na 5 min, lont de povidonjood uit met steriel gaasje en spoel de ogen met 0,9% steriele zoutoplossing. Houd het oog vochtig tijdens anesthesie met regelmatige toepassing van steriele zoutoplossing. </li><li> Plaats een toroïdale magneet rond het oog. </li><li> Injecteer 25 pi van een oplossing bevattende 30 mg / ml van gammastraling gesteriliseerd 8 urn magnetische microsferen in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) in de voorste kamer, met een 33 G naald afgeschuind. <ol><li> Kralen bereiden wassen resuspenderen vervolgens centrifugeren 3 keer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten met 1 ml HBSS, alvorens de definitieve 30 mg / ml oplossing. Onderhouden steriele omstandigheden in. </li><li> Voor injectie, wees voorzichtig om te voorkomen dat de naald om de iris, om het risico van iris trauma te minimaliseren. Dit kan worden voorkomen door richten van naald raakt aan het corneale oppervlak parallel aande iris mogelijk. Dit zal ook helpen om kraal verlies uit de injectieplaats te minimaliseren. OPMERKING: Spuit kralen in een snel tempo tot een gelijkmatige verdeling over de hele iridocorneale hoek, die cruciaal is voor het verhogen van IOP garanderen. Bovendien opslag kralen, naalden en magnetische ringen afzonderlijk zodat de korrels geen clusters, waardoor ze moeilijk te laden in de injectiespuit en injecteer en de naald niet gemagnetiseerd. </li></ol></li><li> Laat de naald in de plaats voor 1 min na de injectie om ervoor te zorgen dat de kralen vestigen in de iridocorneale hoek met waterige afvoer belemmeren van het trabeculaire netwerk. Iets hoek van de naald na de kralen zijn in eerste instantie geregeld om een ​​aantal lekken van water mogelijk te maken, om een ​​tijdelijke verhoging van de IOP te minimaliseren. Aan het einde van de operatie spoelen de naald door eerst met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vervolgens 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water, om verder gebruik van de naald in afzonderlijke procedures. Als alternatief kan men gebruikwegwerp naalden als de juiste dikte en spuit combinatie is beschikbaar. Optioneel: naalden worden geslepen met een beveller gebruik ervan verlengen. </li><li> In dit stadium, indien nodig, verwijder de magneet, en het gebruiken om kralen te trekken naar gebieden van onvolledige dekking. </li><li> Laat de magneet op zijn plaats rond het oog voor een verdere 10 minuten na de injectie om ervoor te zorgen kralen vestigen ver in de iridocorneale hoek. </li><li> Reverse anesthesie met 0,25 mg / kg atipemezole hydrochloride. </li><li> Dien chlooramfenicol of andere antibiotische zalf, bijvoorbeeld gentamycine of terramycine topisch om infectie te voorkomen, en 0,5% proparacaïne hydrochloride analgesie. Verlaat dieren om te herstellen op een warmte mat, totdat zij weer beweging, vervolgens overbrengen naar een warme doos en voeding met extra voeding, zoals een voedingssupplement of bevochtigd normale dieet totdat herstel is voltooid. Systemische of lokale analgesie moet worden gegeven aan dieren met tekenen van pijn 24 uur na de operatie. Als these symptomen aanhouden, ondanks de behandeling, moeten de dieren op humane wijze worden gedood. </li><li> Gebruik het contralaterale oog als geopereerde controle. </li><li> Neem IOP metingen om de 2-3 dagen na toediening kraal en elke 2-3 dagen daarna met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog 9. </li><li> De criteria om ogen studies zijn: indien 1) de IOP boven de contralaterale stuurdruk verhoogd door 5 mmHg, en 2) niet meer dan 60 mmHg. </li><li> Ogen waar de druk terugkeert naar basislijn (gewoonlijk met 1 week na injectie) niet worden opgenomen in het onderzoek, maar het is mogelijk om opnieuw injecteren kralen in ogen die niet aan hoge IOP ontwikkelen indien gewenst. </li><li> Euthanaseren dieren naar CO 2 stikken aan het einde van het experiment. </li><li> Ontleden ogen en oogzenuwen en repareren in 4% paraformaldehyde (PFA) &#39;s nachts voor verdere histologische analyse. </li></ol> 2. Het beoordelen van het netvlies Neuron Schade Met behulp van TUNEL Sbevattende <ol><li> Apoptotische cellen te kwantificeren in ganse berg retinasuse de terminal deoxynucleotidyl-transferase gemedieerde dUTP nick-labeling (TUNEL) assay, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Prepareer het netvlies van het oog beker, wassen 3 x 5 minuten in 0,3% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS-T). </li><li> Permeabilize het weefsel in 3% T-PBS gedurende 2 uur. </li><li> Pre-evenwicht netvlies in equilibratiebuffer gedurende 10 min vóór incubatie in TUNEL reactieoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Was het weefsel voor 3 x 5 min in 0,3% T-PBS, spoelen in 0,3% T-PBS met 5 uM DAPI, en een flatscreen-mount in de montage media. </li><li> Te kwantificeren TUNEL positieve kernen gebruik maken van een confocale microscoop tot 10 pm z-stacks door het ganglion cellaag nemen bij een vergroting van 20x. Neem 3 plaatjes op elk van de 4 blaadjes, op plaatsen dicht bij de optische zenuw, halverwege de periferie, en aan de andere rand van de retina, dus in totaal 12 afbeeldingen per geheel bert, bemonstering ongeveer 7.000 cellen. Morfologische criteria gediscrimineerd niet-neuronale (endotheel en gliale) cellen van neuronale cellen. </li><li> Stalling voor beeldvorming met alleen de DAPI kanaal, en het masker onderzoekers behandelingsgroepen. </li></ol> 3. Het beoordelen van schade aan de oogzenuw behulp toluïdineblauw kleuring <ol><li> Fix oogzenuwen overnachting in oplossing Karnovsky&#39;s bij 4 ° C. </li><li> Behandel specimens 2 uur in 1% (w / v) osmiumtetroxide en vervolgens drogen in 100% ethanol. </li><li> Incubeer optische zenuwen in propyleenoxide gedurende 30 min, en plaats in een 50:50 mengsel van propyleenoxide: Araldite overnight. </li><li> Verander deze oplossing tot 100% Araldite, gevolgd door incubatie overnacht bij 60 ° C. </li><li> Cut semithin secties (0,75 mm dik) en de vlek met 1% toluïdineblauw / borax (TB) in 50% ethanol voor het onderzoek met lichtmicroscopie. </li></ol> 4. Statistische analyse <ol><li> Uit te voeren statistische analyseert behulp van een geschikte statistische softwarepakket. Een twee-weg ANOVA met Newman-Keul&#39;s post-hoc test kan worden gebruikt om statistische significantie berekenen IOP tijd verandert. </li><li> Een p waarde van minder dan 0,05 kan significant worden beschouwd. </li></ol>

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%3A+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li>
<li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li>
<li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li>
<li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li>
<li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li>
<li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+application+of+povidone-iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li>
<li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li>
</ol>

David T. Shima is een werknemer van Hofmann-La Roche, Zwitserland. De overige auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier tonen we een werkwijze voor het induceren van verhoogde IOP in ratten door injectie magnetische microsferen in de voorste kamer van het oog. Deze methode is eenvoudig uit te voeren, en vereist weinig chirurgische deskundigheid, of uren van de praktijk en verfijning. Bovendien is de procedure effectief; zelden die meer dan een enkele injectie van kralen tot een sterke en robuuste drukstijging (ongeveer 10% herinjectie rate) induceren. Dit kan een voordeel bieden ten opzichte van bestaande induceerbare methoden, zoals de technisch uitdagende episceral ader sclerose 11 model, of laserfotocoagulatie protocol 6, die meerdere procedures voor het onderhouden verhoogde IOP kan eisen. Om de methode echter succesvol zijn, zijn er enkele kleine kritische stappen die moeten worden genomen. Allereerst is het nuttig om een ​​toroidale vorm magneet om parels te trekken in de iridocorneale hoek. Deze stap is een wijziging van het oorspronkelijke protocol Where de korrels werden geïnjecteerd in de voorste kamer, en daarna verplaatst vrije hand rond de ogen 3. Met behulp van een ringkern magneet betekent dat microsferen gelijkmatig genoegen zou moeten nemen om de hoek, met minimale handmatige herverdeling. Te traag en de kralen overwegend ophopen op één zijde van de hoek, wat leidt tot onvolledige dekking, en mogelijk geen drukstijging - tweede dient de injectiesnelheid snel. Maar over het algemeen gesproken is de werkwijze eenvoudig genoeg dat de gebruiker gemakkelijk wijzigingen in het protocol, zoals variëren van de grootte of het volume van de microsfeer deeltjes, misschien proberen om de mate van de IOP hoogte veranderen kunnen maken. Echter, een potentieel nadeel van de methode is dat men weinig controle over de omvang van de hypertensie, die ongeveer 5-10% van de gevallen zagen we steeg boven 60 mmHg. Excessieve stijgingen van de IOP kan zeer destructief te netvliesweefsel, en kunnen maken het bestuderen van de mechanismen en biologie van celdood uitdagend. Echter produceert de werkwijze een consistente neuronale pathologie, zowel in de retina en optische zenuw, die farmacologisch 12 kunnen worden gemanipuleerd. Dit kan het model aantrekkelijk voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van glaucoom te maken. Bovendien, omdat de korrels worden gericht in de iridocorneale hoek laat dit de zichtas gratis live beeldvorming van de retina of optische schijf. We verwachten dat dit model zal worden aangepast en gebruikt voor toekomstige toepassingen in andere soorten, met inbegrip van de muis.

Primair glaucoom is een verwoestende oogziekte die naar schatting 60,5 miljoen mensen in de hele wereld 1, wat kan leiden tot levensveranderende verlies van gezichtsvermogen en blindheid 2. Onderzoek naar de ziekte mechanismen, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor glaucoom, zijn afhankelijk van goede modellen van de ziekte die enkele van de kenmerken van de pathologie recapituleren. We presenteren hier een rat glaucoom model gebaseerd op de methode van Samsel et al. 3 Het algemene doel van deze techniek is om intraoculaire druk (IOP) in het oog te verhogen door het injecteren magnetische microsferen in de voorste kamer en door een magnetische ring, rechtstreekse ze in de iridocorneale hoek. Dit belemmert waterige uitstroom, die IOP toeneemt, wat leidt tot neuronale beschadiging en celverlies. Het protocol werd ontwikkeld om te proberen een eenvoudiger, induceerbare model van glaucoom verschaffen. Dit protocol kan een aantal voordelendan bestaande technieken. Genetische muismodellen zoals de DBA / 2J beschikbaar zijn, die geen procedures vereisen te initiëren; maar deze kan een onvoorspelbare begin van ziekteprogressie 4 hebben. Daarentegen induceerbare modellen, waarvan de meeste afhankelijk chirurgisch verhogen IOP bij knaagdieren, het voordeel dat initiatie kan worden door de gebruiker. Sommige van deze methoden kunnen nadelen van hun eigen hebben echter, met inbegrip van technisch uitdagende 5, en kan meerdere procedures vereisen om verhoogde IOP 6 te behouden. In tegenstelling, de induceerbare werkwijze beschreven in dit manuscript is een eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare techniek die stabiele, robuuste toename in druk, met minimale behoefte herinjectie produceert. Bovendien is het niet betrekken dure apparatuur en vereist slechts eenvoudige chirurgische vaardigheden uit te voeren. Dit protocol kan geschikt zijn voor lezers die op zoek zijn naar het opzetten van een technisch minder veeleisend geïnduceerd zijnglaucoom model in hun laboratorium.

<table><tbody><tr><td>250 - 300g vrouwelijke Brown Norway ex-fokkersratten</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamin)</td><td>Fort Dodge Animal health</td><td>BN1000118</td><td>37,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidine hydrochloride)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0,25 mg/kg</td></tr><tr><td>Povidon-jodium</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H2O</td></tr><tr><td>Minim's Saline Solution</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Toroïdale magneet</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G afgeschuinde naald</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Aangepaste naald</td></tr><tr><td>Luer tip spuit</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0,25 mg/kg</td></tr><tr><td>Chloramfenicol zalf</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL staining kit</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montagemedia</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van magnetic microsferen

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Vooruitgang in het begrijpen van de pathofysiologie en het bieden van nieuwe behandelingen voor glaucoom hangt af van goede diermodellen van de ziekte. We presenteren hier een protocol voor het verhogen van de intraoculaire druk (IOP) bij de rat, door magnetische microsferen in de voorste kamer van het oog te injecteren. Het gebruik van magnetische deeltjes stelt de gebruiker in staat om de korrels in de iridocorneale hoek te manipuleren, waardoor een zeer effectieve blokkade van vloeistofuittocht uit het trabeculair maaswerk ontstaat. Dit leidt tot langdurige stijgingen van de IOP en uiteindelijk neuronale dood in de ganglioncel laag (GCL) evenals pathologie van de oogzenuw, zoals gezien bij patiënten met de ziekte. Deze methode is eenvoudig uit te voeren, omdat er geen machines, specialistische chirurgische vaardigheden of vele uren oefening nodig zijn om deze te perfectioneren. Verder zijn de drukstijgingen zeer robuust en herinjectie van de magnetische microsferen is meestal niet nodig, in tegenstelling tot sommige andere modellen die plastic korrels gebruiken. Daarnaast zijn we van mening dat deze methode geschikt is voor aanpassing voor het muizenoog.

Injectie van magnetische korrels in de iridocorneale hoek constant induceerde een langdurige en sterke drukstijging (figuur 1), die gemakkelijk waarneembaar was het eerste tijdstip, 3 dagen na injectie. Bovendien is de druktoename werd gehandhaafd gedurende de duur van het experiment en hoewel onze tijdsverloop eindigde op 18 dagen na injectie, maar andere die druk blijft langdurig 3. De gemiddelde IOP gemiddeld over de volledige lengte van het experiment voor de controle, niet-bead-geïnjecteerde ogen was 19,7 ± 0,3 mmHg ten opzichte van 40,5 ± 2,8 mmHg voor bead geïnjecteerde ogen (p &lt;0.001). Daarnaast piek IOP steeg van 22,8 ± 0,3 mmHg tot 49,9 ± 2,3 mmHg. Om te bepalen of de verhoging van de IOP leidt tot de dood van retinale ganglioncellen, voerden we TUNEL kleuring op netvlies en histologie Dwarsafschot oogzenuw secties (figuur 2). In de retina<html> we een toename waar TUNEL kleuring (figuur 2A) in bead geïnjecteerde ogen met verhoogde IOP. Het aantal apoptotische kernen nam ongeveer 15-voudig, 1,6 ± 0,5 cellen contralaterale controles, 24,5 ± 0,5 cellen in hypertensieve retina (Figuur 2B; P &lt;0,05). Bovendien, in de ogen waarin magnetische bolletjes werden geïnjecteerd maar druk niet verhoogde (waarschijnlijk door onvolledige blokkering van de iridocorneale hoek), het aantal TUNEL-positieve cellen waren niet significant verschillend van die van niet-geïnjecteerde controles (P&gt; 0,05). Dit suggereert dat celdood gerelateerd aan druk toeneemt, niet door directe toxiciteit van de magnetische microsferen. Tenslotte onderzochten we oogzenuw pathologie in de glaucoom model en zag accumulatie van toluidineblauw in veel van de axonen, aangeeft degeneratie van deze cellulaire processen (figuur 2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Verhoging van intraoculaire druk met behulp van magnetische microsferen. Injectie magnetische microsferen in de voorste kamer induceerde een sterke, significante toename van de intraoculaire druk (IOP) in vergelijking met contralaterale controle, niet-geïnjecteerde ogen. Y-as eenheden = millimeter kwik (mm Hg). Data = gemiddelde ± SEM. * = P &lt;0,001; N = 12. Dit cijfer is gewijzigd van Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Elevation IOP door injectie van magnetische microsferen in de iridocorneale hoek geïnduceerde neuronale dood in de ganglion cellaag (GCL). (A) Representatieve beelden van netvliezen van controle (links) en glaucoom (rechts) gekleurd voor ogen apoptotische kernen door TUNEL (green;witte pijlen) en DAPI (blauw), met vermelding van het aantal apoptotische kernen verhoogd als IOP roos. (B) Kwantificering van TUNEL positieve cellen in de GCL, waaruit blijkt dat de ogen met verhoogde IOP (midden), hadden significant meer apoptotische cellen in vergelijking met control (links). Daarentegen, in bead geïnjecteerde ogen waar de druk niet stijgt (rechts) geen significante toename TUNEL kleuring waargenomen. Data = gemiddelde ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8 (C) Representatieve beelden van oogzenuw kleuring, waaruit een verhoging toluidine blauw accumulatie (zwarte pijlen) in beschadigde axonen van glaucoom (rechts) maar geen controle ogen (links).. Schaalbalken = 50 urn. Dit cijfer is gewijzigd van Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

We presenteren een methode voor het induceren van verhoogde intraoculaire druk (IOP), door magnetische microsferen in het rattenoog te injecteren, om glaucoom te modelleren. Dit leidt tot sterke drukverhogingen en uitgebreide neuronale dood. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren, vereist geen herhaalde injecties en produceert stabiele langdurige IOP-verhogingen.

Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Het doel van deze procedure is om een verhoogde intraoculaire druk bij de rat op te wekken door paramagnetische microsferen in de voorste oogkamer te injecteren. Plaats eerst een magnetische ring rond het oog van een geanestheseerd dier, was de magnetische microsferen, resuspendeer deze in een oplossing en vul vervolgens een injectiespuit ermee. Injecteer daarna de magnetische microsferen in de voorste oogkamer van het oog.Verwijder de magnetische ring tijdens het herstel. De procesgegevens verkregen uit histologische analyses, zoals tunnel-kleuring of kleuring van de oogzenuw, kunnen de dood van retinale ganglioncellen meten die het gevolg is van een verhoogde intraoculaire druk. Was de gesteriliseerde magnetische microsfeer-kraaltjes van acht micron drie keer in 1 mL Hank's gebufferde zoutoplossing door middel van resuspensie en centrifugatie bij 10 000 ×g gedurende vijf minuten.Resuspendeer ze vervolgens in 0,5 milliliter HBSS voor een oplossing van 30 milligram per milliliter. Neem nu, met gebruik van een rebound-tonometer die is gekalibreerd voor gebruik in het rattoog, vijf baseline-metingen van de IOP bij de wakkeren dieren. Breng na het anesthetiseren van de ratten oogzalf aan in het niet-behandelde contralaterale oog om dit vochtig te houden.Breng tijdens de anesthesie 0,5% propaankaliumchloride, een plaatselijk anestheticum, aan op het te opereren oog. Was dit oog vervolgens met 5% povidonjodium in water. Spoel na vijf minuten het povidonjodium af en was het oog met een 0,9% steriele zoutoplossing.Houd het oog tijdens de anesthesie vochtig door regelmatig steriele zoutoplossing aan te brengen. Plaats nu een steriele magneet rond het oog om het risico op iristrauma en het verlies van beads te minimaliseren. Richt de naald tangentieel aan het hoornvliesoppervlak en zo parallel mogelijk aan de iris.Inject vervolgens 25 µL magnetische microsferen (30 mg/mL, gamma-bestraald) in de voorste oogkamer. Laat de naald na injectie één minuut op zijn plaats zitten om ervoor te zorgen dat de kralen in de hoek van de voorste oogkamer bezinken, zodat de afvoer van kamerwater via het trabeculair netwerk wordt belemmerd. Kantel de naald een paar seconden nadat de kralen initieel zijn bezonken om een kleine lekkage van kamerwater toe te staan en tijdelijke stijgingen van de intraoculaire druk te minimaliseren.Om hergebruik van de naald in afzonderlijke procedures te garanderen, spoelt u de naald eerst met PBS. Spoel vervolgens met 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water. Verwijder indien nodig de magneet en gebruik deze om kralen naar gebieden met onvolledige dekking te trekken.Laat de magneet na de injectie nog 10 minuten rond het oog geplaatst. Dit is om ervoor te zorgen dat de beads goed bezinken in de iridocorneale hoek. Keer de anesthesie om met 0,25 milligrams per kilogram ESOL-hydrochloride.Dien 0.5 propaanhydrochloride toe voor analgesie en breng topisch chloramfenicolzalf aan om infectie te voorkomen. Laat de dieren herstellen op een warmtemat totdat ze weer kunnen bewegen. Plaats ze vervolgens in een warme box.Gebruik het contralaterale oog als niet-beoordeelde controle. Herhaal de IOP-metingen elke twee tot drie dagen na toediening van de beads en daarna elke twee tot drie dagen; bepaal de criteria voor het includeren van ogen in de studies, waaronder dat de IOP met vijf millimeter kwik is gestegen ten opzichte van de druk in het contralaterale controle-oog, en dat de IOP de 60 millimeter kwik niet overschrijdt. Ogen waarbij de druk één week na injectie terugkeert naar de basislijn, mogen niet in de studies worden opgenomen. Indien gewenst is het echter mogelijk om opnieuw beads te injecteren in ogen waarin geen hoge IOP is ontwikkeld.Fixeer de gedissecteerde ogen en de oogzenuw in 4%paraldehyde en beoordeel de schade aan de retinale neuronen via tunnel-kleuring en de schade aan de oogzenuw via toine blue-kleuring. In dit experiment induceerde de injectie van magnetische kralen in de iridocorneale hoek consistent een langdurige en robuuste stijging van de druk. Bovendien werd de drukverhoging gedurende de gehele duur van het experiment gehandhaafd.De gemiddelde IOP over de volledige duur van het experiment was 19,7 plus minus 0,3 millimeter kwik voor de controle-ogen zonder bead-injectie en 40,5 plus minus 2,8 millimeter kwik voor de ogen met bead-injectie. Daarnaast steeg de piek-IOP van 22,8 plus minus 0,3 millimeter kwik naar 49,9 plus minus 2,3 millimeter kwik om vast te stellen of een verhoging van de IOP leidt tot de dood van retinale ganglioncellen. Tunnel-kleuring werd uitgevoerd op retina's en histologie op transversale doorsneden van de nervus opticus in de retina.We observeerden een toename van tunnelkleuring in ogen met verhoogde IOP waarin kralen waren geïnjecteerd. Het aantal apoptotische kernen steeg ongeveer 15-voudig ten opzichte van contralaterale controle-hypertensieve retina's; zoals verwacht was het aantal tunnel-positieve cellen in ogen waarin magnetische kralen zonder druk waren geïnjecteerd niet significant verschillend van die van niet-geïnjecteerde controles. Verdere onderzoek naar de pathologie van de oogzenuw in het glaucoommodel toonde de accumulatie van odine blue in veel van de axonen aan, wat duidt op degeneratie van deze cellulaire uitlopers.

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm's canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Chronische oculaire hypertensie wordt opgewekt met behulp van laserfotocoagulatie van de trabekelnetwerk in muis ogen. De intraoculaire druk (IOP) wordt verhoogd tot verscheidene maanden na laserbehandeling. De daling van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid proefdieren worden gecontroleerd met behulp van de optomotor-test.

Een laser-induced Mouse Model van chronische oculaire hypertensie aan Visual Gebreken karakteriseren

Deze video illustreert een methode, met behulp van een klinische 3 T scanner, voor contrast-versterkte MRI van de naïeve muis visuele projectie en voor herhaalde en longitudinale in vivo studies van de oogzenuw degeneratie geassocieerd met acute oogzenuw verpletteren letsel en chronische oogzenuw degeneratie in knock-out muizen (p50 KO).

In vivo beeldvorming van Optic Nerve Fiber Integrity by-Contrast Enhanced MRI in Muizen

Hier presenteren we een protocol om intraoculaire drukverhoging te induceren in het muizen oog dat resulteert in het verlies van retinale ganglioncellen zoals waargenomen in glaucoom. Magnetische microkralen worden geïnjecteerd in de voorste kamer en aangetrokken door de iridocorneale hoek met een magneet om de uitstroom van waterige humor te blokkeren.

Een Magnetic Microbead occlusie Model voor het induceren van oculaire hypertensie-Dependent Glaucoom in Muizen

Glaucoom wordt gekenmerkt door schade aan retinale ganglioncellen. Het induceren van glaucoom in diermodellen kan inzicht geven in de studie van deze ziekte. Hier schetsen we een procedure die verlies van RGC's induceert in een in vivo rattenmodel en de voorbereiding van gehele netvliezen voor analyse demonstreert.

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Chronische oculaire hypertensie wordt geïnduceerd door het toepassen van een circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen, wat leidt tot functionele en structurele verslechtering van de retinale peesknoopcellen overeenstemming met glaucoom.

Een Model van glaucoom veroorzaakt door Circumlimbal hechtdraad bij ratten en muizen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken van oculaire hypertensie en glaucomateuze neurodegeneratie in muis ogen door intracamerale injectie van siliconenolie en de procedure voor het verwijderen van siliconenolie uit de voorste kamer om verhoogde intraoculaire druk terug te Normale.

Een omkeerbare silicium olie-geïnduceerde oculaire hypertensie model in muizen

Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van Primed Myco bacteriële Uveïtis (PMU) bij muizen. Deze methode schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking in het muismodelsysteem te helpen produceren. Met behulp van dit protocol genereerden we uveitische ogen en niet-ontstoken medeogen van afzonderlijke dieren voor verdere evaluatie met immunologische, transcriptomische en proteomische assays.

Geprimed mycobacteriële uveïtis (PMU) als model voor post-infectieuze uveïtis

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Leer een experimenteel glaucoommodel bij ratten door injectie van magnetische microsferen in de voorste oogkamer. Deze methode induceert verhoogde intraoculaire druk en retinale ganglionceldood voor onderzoek naar neurodegeneratie.

Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen

Meer video's verkennen