Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Het algemene doel van het volgende experiment is om differentiatie micro RNA, profilering en doelwit Mr.NA validatie van een menselijke neurale stamcel lijn te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst menselijke neurale stamcellen te kweken op een driedimensionale kweeksysteem om celdifferentiatie te induceren. De tweede stap is om differentiatie te kwantificeren door het meten van axon proces uitgroei.

Vervolgens worden veranderingen in micro RNA expressie geëvalueerd door micro R-N-A-P-C-R array. Computationele analyse van geselecteerde differentieel uitgedrukte micro RNA's wordt vervolgens uitgevoerd om een set van vermoedelijke doelwit mRNA's te identificeren. Uiteindelijk worden de doelwit mRNA's gevalideerd door reporter plasmid, transfectie, en een dubbele luciferase assay.

Dus de methode die hier wordt gepresenteerd kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke kwesties in het neurale stamcelveld, zoals de karakterisering van uitgedrukte micro RNA's, en hun doelwit boodschapper RNA's in menselijke neurale stamcellen wanneer ze differentiatie ondergaan. Hoewel deze methode inzicht kan geven in neurale stamcelbiologie. Het kan ook worden toegepast op andere stamcelsystemen zoals mesenchymale stamcellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen, of andere systemen die inductie van differentiatie en moleculaire karakterisering vereisen.

Visuele demonstratie van deze methode breekt de cruciale stappen in de differentiatie van een menselijke neuros stamcel lijn en onderzoek naar micro RNA profilering en de validatie van doelwit mRNA neer. Een deel van de procedure zal worden uitgevoerd door lavania, een wetenschapper uit mijn laboratorium. Deze hele procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidscabinet met behulp van aseptische technieken. Rehydrateer de scaffolds door aan elk putje van de AL VX 12 toe te voegen.

Plaats twee milliliter van 70%ethanol, bereid met water voor irrigatie, in het putje. Vermijd het aanraken van de scaffolds door het 70%ethanol langs de wand van elk putje te laten lopen. Zorgvuldig aspireer het 70%ethanol en was onmiddellijk de scaffolds met twee milliliter per putje van D-M-E-M-F 12 gedurende één minuut.

Herhaal de wasprocedure twee keer. Zorgvuldig aspireer de D-M-E-M-F 12 na de laatste wasbeurt. Coat de scaffolds door twee milliliter laminine in D-M-E-M-F 12 aan elk toe te voegen. Well incubeer de plaat gedurende minimaal twee uur bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide bevochtigde incubator.

Was vervolgens de plaat met warm D-M-E-M-F 12. Zaai elk scaffold met ongeveer 500.000 menselijke neurale stamcellen of H nscs in een volume van 150 microliter RMM medium met groeifactoren. Incubeer de plaat gedurende drie uur om de cellen toe te laten gaan in de scaffolds. Voeg na drie uur 3,5 milliliter RMM toe aan elk putje. Zorg ervoor dat cellen niet losraken van de scaffolds.

Incubeer de plaat gedurende zeven of 21 dagen. Vervang het RMM medium na één dag, wat de eerste voeding is, en vervang het medium opnieuw twee tot drie dagen na de eerste voeding. Zeven en 21 dagen na de 3D-kweek van H nscs.

Verwijder het RMM medium en fixeer de gedifferentieerde cellen met 4%paraform aldehyde. De gefixeerde cellen worden vervolgens gekleurd met behulp van een bèta drie tubuline primaire antilichaam, gedetecteerd met een geconjugeerd fluorochroom. Cellenkernen worden tegengekleurd met hooks.

Leg representatieve beelden van de bèta drie tubuline gekleurde cellen vast. Gebruik een fluorescentiemicroscoop, sla de afbeeldingen op in TIFF of JPEG formaat. De meting van axon proces uitgroei wordt uitgevoerd met behulp van de image PRO plus zeven software meettool.

Om te beginnen opent u het beeld, selecteert u de meetoptie in de werkbalk en selecteert u de traceerfunctie. Om te beginnen, selecteert u het startpunt op de axon uitgroei door op de muisknop te klikken, traceer langs de hele lengte van de axon uitgroei, klik met de rechtermuisknop om elke trace te voltooien. Meet op deze manier alle axon uitgroei binnen het gezichtsveld, druk de metingen uit als pixels of micrometers.

Exporteer de lengtemetingen naar een spreadsheetprogramma voor monstervergelijking en statistische analyse om veranderingen in micro RNA expressie van de driedimensionaal gekweekte HSC's te evalueren. Voer eerst micro RNA extractie en micro RNA CD NA voorbereiding uit zoals beschreven in het begeleidende protocol. Voer de tekst direct uit nadat de micro RNA CD NA is verkregen.

Bereid de PCR componenten mix voor de real-time PCR in een 15 milliliter buisje. Voeg 1375 microliters van een twee X-S-Y-B-R groen master mix toe. 100 microliters van micro RNA CD NA, 275 microliters van de universele primer en 1000 microliters van RNA's vrije water overbrengen.

Breng de PCR componenten mix over naar een PCR laad reservoir. Verwijder voorzichtig de 96 putjes plaat PCR array uit de verzegelde zak. Gebruik een multikanaals pipeter om 25 microliters van de PCR componenten toe te voegen.

Meng in elk putje van de PCR array. Verwissel de pipet tips na elke pipetteringsstap om kruisbesmetting tussen de putjes te voorkomen. Sluit de 96 putjes plaat af met optische kleeffilm en centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 GS bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen. Inspecteer de plaat visueel om er zeker van te zijn dat er geen bellen in de putjes aanwezig zijn.

Programmeer de 96 putjes plaat PCR array in de realtime cycler. De realtime cycler dienovereenkomstig. Exporteer vervolgens de CT waarden voor alle putjes naar een blanco Excel spreadsheet voor PCR array Data analyse, een algoritme dat online beschikbaar is, wordt gebruikt voor de identificatie van voorspelde micro RNA doelwitten.

Klik op, klik hier voor PIC KTAR voorspelling op vertebraten om een nieuwe pagina in de PIC KTAR web interface te openen. Kies soort in het vervolgkeuzemenu en voer het micro RNA van belang in in het micro RNA ID vakje. Klik op zoeken naar doelwitten van een micro RNA.

Er wordt een lijst met doelwit mRNA's gepresenteerd, gerangschikt op een PIC KTAR score. De verkregen rangschik