Name: Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer microRNA-analyse en doelwitvalidatie bij differentiatie van menselijke neurale stamcellen in 3D-culturen met behulp van PCR-arrays, computationele voorspelling en dual luciferase-assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Julie Heward voor het helpen bij de voorbereiding van hNSCs en Lavaniya Thanabalasundaram voor haar technische ondersteuning met HeLa kweken en transfectie.

1. HNSC differentiatie op Driedimensionale (3D) Cultuur OPMERKING: Isoleer en ontlenen hNSCs, vanuit een ethisch goedgekeurd weefsel, in een eerdere publicatie 2 beschreven. Volg de ethische en institutionele richtlijnen tijdens het volgen van deze procedure. 1.1) 3D Cultuur Met behulp van 12-well plaat <ol><li> Gebruik aseptische techniek tijdens de gehele procedure. In een biologisch veiligheidskabinet, opnieuw te hydrateren steigers door toevoeging van 2 ml / putje van 70% ethanol bereid met water voor irrigatie (WFIr). Raak de steigers door het afgeven van de 70% ethanol aan den muur van elk putje. </li><li> Aspireren zorgvuldig de 70% ethanol en de steigers onmiddellijk wassen met 2 ml / putje DMEM: F12 voor 1 min. Herhaal het wassen procedure tweemaal. Zuig voorzichtig de DMEM: F12 na de laatste wasbeurt. </li><li> Coat steigers door toevoeging van 2 ml / putje van laminine (10 ug / ml) in DMEM: F12. Incubeer plaat bij 37 ° C in een 5% CO 2 humidified incubator gedurende minimaal 2 uur. Was de plaat met warm DMEM: F12. </li><li> Zaad elke steiger met ongeveer 500.000 hNSCs in een volume van 150 ul van RMM + GF. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 3 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator om cellen te vestigen in de steigers. </li><li> Voeg 3,5 ml van RMM aan elk putje zorg niet te cellen los van steigers. </li><li> Incubeer de plaat voor 7 dagen; Vervang RMM medium na 1 dag (eerste voeding) (3,5 ml / putje) en opnieuw na 2-3 dagen na de eerste voeding. </li><li> Na 7 dagen Verwijder medium en vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) voor immunocytochemie (ICC) en voeg 500 ul / putje van lysis reagens voor totale RNA-extractie (opslag plaat bij ≤ -80 ° C of naar het totale RNA-extractie) . </li></ol> 1.2) Meting van Axon Process uitgroei <ol><li> Vlekken op 4% PFA vaste gedifferentieerde hNSCs volgens een standaard ICC-protocol 20 met behulp van β3-tubuline (TUBB3) primair antilichaam gedetecteerd met een fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam. Tegenkleuring celkernen met Hoechst (1 uM). </li><li> Leg representatieve beelden van β3-tubuline gekleurde cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop; afbeeldingen opslaan als tiff of jpeg. Maatregel van axon proces uitgroei met behulp van een software-meetinstrument (bv Image-Pro Plus). </li><li> Open de afbeelding, selecteer metingen optie in de werkbalk en selecteer trace functie. </li><li> Om het spoor te beginnen, selecteert u het beginpunt van de axon uitgroei door te klikken op de muisknop. Trace langs de gehele lengte van het axon uitgroei; klik met de rechtermuisknop op elk spoor af te maken. Herhaal dit tot alle axon outgrowthswith in het gezichtsveld te meten. </li><li> Versneld metingen als pixels of micrometer (in afwachting van de kalibratie ingesteld). Lengte export metingen naar een spreadsheet programma voor monster vergelijkende en statistische analyse. </li></ol> 2. miRNA expressie met behulp van een stamcellen enOntwikkelingspaden Focused miRNA PCR Array 2.1) miRNA totaal RNA-extractie <ol><li> Voeren miRNA extractie op steigers en 2D gegroeid monsters (gedifferentieerde en ongedifferentieerde, hNSC controle). </li><li> Ontdooi steigers, ingebracht in een 12 well plaat, indien nodig. Combineer lysis inhoud reagens (500 pl) van 2 putten in dezelfde 1,5 ml Eppendorf buis eindvolume 1 ml lysis reagens. Zorg ervoor dat de steiger in de put te verlaten. </li><li> Voor eerder verzamelde als droge cel afgedraaid 2D gegroeid monsters (gedifferentieerde hNSC 2D culturen en ongedifferentieerde controle) voeg 1 ml lysis reagens en overdragen inhoud in 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Homogeniseren elk monster met behulp van een 1 ml spuit en een korte 20 tot 25 gauge naald. Haal het lysaat door de naald met een 1 ml spuit tot 5 keer totdat een homogene lysaat wordt bereikt. </li><li> Voeg 200 ul chloroform aan elk Eppendorf buisje en dop vast. Omkeren en vortex buizenMeng de inhoud. </li><li> Centrifugeer elk 1,5 ml microcentrifugebuis met homogenaat gedurende 15 min bij ≥12,000 x g. </li><li> Breng de bovenste waterige fase van elk monster (vermijden dat eventuele tussenfase roze gekleurde vloeistof) naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis met 750 pi 100% ethanol. Meng goed door omkeren. </li><li> Pipetteer tot 700 gl van elk monster, inclusief de neerslag, in een kleine kolom in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij ≥8,000 xg gedurende ongeveer 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom. Herhaal deze stap met de rest van het monster. </li><li> Voer een DNA digest gedurende 15 min. </li><li> Voeg 700 ul buffer RWT aan de mini-kolom en centrifugeer gedurende ongeveer 30 sec bij ≥8,000 x g. Gooi de doorstroom. </li><li> Was mini column door het toevoegen van 500 ul buffer RPE en centrifugeren gedurende ongeveer 30 sec bij ≥8,000 x g. Gooi de doorstroom. Herhaal wash.Centrifuge bij ≥12,000 xg gedurende 1 minuut om het membraan verder te drogen. </li><li> Elueer totaal RNA in een 1,5 ml Eppendorf buisje door toevoeging van 40 gl RNase-vrij water aan de mini-kolom en centrifugeren gedurende 1 minuut bij ≥8,000 x g. Meet totaal RNA-concentratie met behulp van een geschikte spectrofotometer. </li></ol> 2.2) miRNA cDNA Voorbereiding <ol><li> Bereid de reverse-transcriptie master mix. Elk monster 4 pi 5x miScript HiSpec buffer, 2 pl 10x nucleics mix vereist, miScript 2 pi reverse transcriptase mix. </li><li> Aliquot 8 pi Master Mix in een PCR-buis, voeg benodigde hoeveelheid totaal RNA (250 ng), en voeg RNase-free water tot een eindvolume van 20 pl. </li><li> Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C.Incubate gedurende 5 min bij 95 ° C geïnactiveerd miScript Reverse Transcriptase Mix. </li><li> Voeg 200 ul RNase-vrij water aan elk 20 ui reverse transcriptie reactie, bewaar bij -20 ° C, of ​​verder met real-time meteen PCR. </li></ol> 2.3) Stem Cells en de ontwikkelingspaden Gericht miRNA PCR Array <ol><li> Bereid de PCR-componenten mix in een buis van 15 ml door het toevoegen van 1375 pi 2x SYBR groene master mix, 100 ul miRNA cDNA voorbereiding, 275 ul van 10x miScript Universal Primer, en 1000 pl RNase-vrij water (totaal volume 2750 pi). </li><li> Transfer PCR componenten mix op een PCR laden reservoir. Verwijder de 96-well plaat PCR-array uit de verzegelde tas zorgvuldig. </li><li> Voeg 25 ul PCR-componenten mengsel aan elk putje van de PCR array met een 8-kanaals pipet, of een 12-kanaals pipet met slechts 8 tips. Veranderen pipet tips na elke pipetteren stap om kruisbesmetting tussen de putten te vermijden. </li><li> Seal plaat met optische kleeffolie en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 xg bij kamertemperatuur (15-25 ° C) om luchtbellen te verwijderen. Inspecteer de plaat van onderaf om ervoor te zorgen geen luchtbellen aanwezig in de putten zijn. </li><li> Plaats de plaat met 96 putjes PCR array in de real-time cycler. </li><li> Programmeer de real-time cycler bijgevolg: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 minuten en 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 min bij 60 ° C een eenvormig (fluorescentie gegevensverzameling). </li><li> De Ct-waarden te exporteren voor alle putjes naar een leeg Excel-spreadsheet voor gebruik met PCR Array Data Analyse Template Excel en web-based software. OPMERKING: Bij software is beschikbaar op <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Computational Analyse voor miRNA Target Voorspelling en Validatie van Target mRNA door reporterplasmide Transfection en Ddual luciferasetest. 3.1) Computational Analyse voor miRNA Target Voorspelling <ol><li> Bladeren PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, online beschikbaar algoritme voor de identificatie van miRNA richten voorspelling mRNA. </li><li> Klik op &quot;klik hier voor PicTar voorspelling op gewervelde dieren&quot;. Een nieuwe pagina wordt geopend. </li><li> In de nieuwe pagina, PicTar webinterface, kiest soorten in het drop down menu en steek miRNA van belang in het vak miRNA-ID. Klik op zoeken voor doelwitten van een miRNA. </li><li> Observeer een lijst van doelwit mRNA volgorde van aPicTar score. OPMERKING: PicTar berekent een score die de waarschijnlijkheid dat een bepaalde UTR zal worden gericht op de geselecteerde miRNA, en op basis van zaad complementariteit, thermodynamica en een combinatorische voorspelling voor gemeenschappelijke doelen in sets van co-uitgedrukt miRNAs 22. </li><li> Op dezelfde manier halen de lijst van doelwit mRNA met behulp van DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, en TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternatieve on-line beschikbaar algoritmen. </li><li> Stel een vergelijkende tabel van miRNAs gebaseerd op ranglijst verkregen met behulp van verschillende software tools. PicTar gelederen op score, DianaLab door precisie (gebaseerd op de signaal-ruisverhouding en een precisie-score voor de evaluatie van de betekenis van de voorspelde resultaten), en TargetScan door geaggregeerde PCT (op basis van zaad complementariteit, thermodynamische vrije energie van binding, behoud dan verschillende soorten), zie tabel 1. </li></ol> 3.2) Validatie van Target mRNA door reporterplasmide Transfection en Dual luciferasetest. OPMERKING: 3 &#39;UTR luciferase reporters voor de validatie van target mRNA is eerder beschreven 25. <ol><li> Transfectie <ol><li> Zaad HeLa-cellen bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in 24-well plaat. </li><li> Na 24 uur co-transfecteren HeLa cellen met 1,5 ui transfectie reagens en hetzij 100 ng NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR plasmide en 20 nM miRNA bootst (HSA-miR-96-5p voor SOX5 3217; UTR, en HSA-miR-7-5p, en HSA-miR-17-5p voor NR4A3 3 &#39;UTR respectievelijk) per well. </li><li> Co-transfecteren controle putten met NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid en fluorochroom gelabelde negatieve controle siRNA. De transfectie van controle putten met fluorchroom gelabelde negatieve controle siRNA maakt evaluatie van de transfectie-efficiëntie en is goed voor mimic miRNA 3&#39;UTR binden specificiteit. </li></ol></li><li> Meting van Dual Luciferase activiteiten <ol><li> Meet Firefly en Renilla luciferaseactiviteiten 24 uur na transfectie. Verwijder celkweekmedium. </li><li> Bereid werkoplossing I door toevoeging van 50 pl substraat I in 10 ml Oplossing I; meng goed. Voeg 300 ul van werkende oplossing die ik in elkaar 24 ook. </li><li> Breng de inhoud van elke 24 tot in 3 wells van een 96 witte plaat, 100 pl elk. Wacht 10 minuten en meet vuurvliegluciferase in lichtmeter set voor luminescentie overname. </li><li> Bereid te werken solution II door toevoeging van 50 pl substraat II in 10 ml oplossing II; meng goed. Voeg 100 ui werkoplossing I in elk 96 putjes al bevattende 100 ui werkoplossing I. </li><li> Wacht 10 minuten en meet Renilla luciferase in lichtmeter set voor luminescentie overname. Bereken de verhouding van luminescentie uit de Firefly luciferase het Renilla luciferase. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li>
<li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li>
<li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li>
<li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li>
<li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li>
<li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+repair%3A+cell+therapy+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li>
<li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+feel+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li>
<li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70(2010).</li>
<li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li>
<li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alvetex%28R%29%3A+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture%3A+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li>
<li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49(2014).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295(2009).</li>
<li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+seed+pairing%2C+often+flanked+by+adenosines%2C+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li>
<li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3%27UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance%2C+pyramidal+cell+survival%2C+and+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li>
<li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn medewerkers, voorraad en / of voorraad optiehouders in ReNeuron Ltd of haar moedermaatschappij. Deze studie werd ondersteund door ReNeuron (RENE.L).

De ontwikkeling van nieuwe in vitro testen om te beoordelen en verbeteren van de differentiatie van stamcellen is altijd een uitdaging voor het onderzoek van hun functies en therapeutische mogelijkheden. Lange termijn en stabiele bevestiging van hNSCs, die voor de ontwikkeling van een robuuste 3D in vitro differentiatie assay werd aangepakt door testen van verschillende 3D ​​substraten met verschillende eigenschappen in termen van materialen en structuren. Als onderdeel van de ontwikkeling van testen onderzochten we ook optimaal zaaien van cellen en concentratie die de eis dat de steigers laminine te bekleden. Hoewel onze hNSCs spontaan kunnen onderscheiden van 4-OHT en groeifactor verwijdering, de uitvoering van een 3D teeltsysteem vertoonden een significante verbetering in hun differentiatie vermogen gemeten door axon werkwijze uitgroei vergelijking met standaard 2D gedifferentieerde hNSCs. Om het effect van 3D-geïnduceerde differe onderzoekenntiation op hNSC miRNA expressie gebruikten we een PCR-array. Vergeleken met standaard chip microarray PCR-array biedt de voordelen van een directe kwantificering en validatie van miRNA van belang. Hoewel de PCR matrix beperkt in termen van totaal aantal miRNA per array, bijvoorbeeld hier minder dan 96, kan worden aangepast om specifiek omvatten miRNAs plaats, in ons geval voorheen in stamcellen ontwikkeling. De expressie van pathway gericht miRNAs werd geprofileerd in 3D en 2D gedifferentieerd hNSCs vergelijking met ongedifferentieerde hNSCs. De meest significante down-gereguleerd miRNAs werden geselecteerd en geanalyseerd om hun vermeende doelwit mRNA beoordelen met de bedoeling van het bepalen van hun functionaliteit en biologische interpretatie met behulp van online beschikbaar algoritmen (DIANA Lab, PicTar en TargetScans). Een enkele miRNA kan honderden doelwitten te herkennen en om deze reden hebben gevalideerd miRNA interacties met 3 &#39;UTR mRNAsthat kunnen geschikte kandidaten in een te zijnxonal regelgeving. NR4A3, een doel van de HSA-miR-7 en miR-17-familie, is een lid van de familie NR4A nucleaire receptoren die afhankelijk van het niveau van expressie, zijn betrokken bij de differentiatie, overleving, apoptose en regulering van hippocampale axon leiding 26. Evenzo SOX5, een doelstelling van HSA-miR-96, is naar verluidt de celcyclus in neurale voorlopercellen 27 axon lengte 28, migratie, post-trekkende differentiatie, en projecties van neuronen 29 regelen. Zowel SOX5 en NR4A3 werden geïdentificeerd als een direct doelwit mRNA van HSA-miR-96, en HSA-miR-7 en 17 respectievelijk door dual luciferase reporter assays. Dual luciferase (Firefly en Renilla) berust op twee reporter genen in hetzelfde plasmide en biedt een verbeterd systeem dat normalisatie om effecten van suboptimale transfectie en cytotoxische effecten in vergelijking met één luciferase plasmide systeem. Als onderdeel van onze test ontwikkeling die we ook geoptimaliseerd onze transfectie conditions om hoge rendement te bereiken. De protocolsdescribed uitvinding kunnen worden benut verder te optimaliseren en te karakteriseren in vitro differentiatie hNSC eventueel beimplemented intransplantation protocollen voor preklinische studies en toekomstige klinische toepassingen.

Stamcelonderzoek speelt een centrale rol in de regeneratieve geneeskunde, die ook overspant de disciplines van tissue engineering, ontwikkelingsstoornissen celbiologie, cellulaire therapieën, gentherapie, en biomaterialen (steigers en matrices). Stamcellen zijn belangrijk in zowel orgel ontwikkeling zijnde weefselherstel; begrijpen hoe stamcellen werken is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe stamcel gebaseerde behandelingen 1. CTX0E03 is een klonale, voorwaardelijk vereeuwigd menselijke neurale stamcellen (hNSC) lijn 2 geïsoleerd van eerste trimester humane foetale cortex. CTX0E03 heeft kwaliteitskenmerken die essentieel zijn voor de klinische cel banking onder goede fabricagemethoden (GMP) 3 zijn gedefinieerd. HNSCs kunnen spontaan differentiëren in neuronen, glia, en oligodendrocyten en is bewezen dat neurologische afwijkingen te verbeteren wanneer getransplanteerd in een knaagdier Model van focale ischemie 2,4,5. De CTX0E03 hNSCs zijn momenteel in klinische studies voor een beroerte disabilteit (NCT01151124 6 en NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs hebben een gemiddelde 22 nucleotiden lang en zijn bewezen regulerende moleculen 7, hebben ze geen eiwitten coderen, maar eerder te binden 3 prime onvertaalde regio (3&#39;UTR) van mRNA&#39;s, het reguleren van hun stabiliteit en de vertaling in eiwitten. MiRNAs worden gerapporteerd deelnemen aan de regulatie van verschillende cellulaire processen, waaronder ontwikkeling, proliferatie en differentiatie 8. Verscheidene miRNAs zijn betrokken bij het ​​reguleren van het lot en de specificatie van neurale stamcellen 9. In tweedimensionale (2D) standaard kweekomgeving de complexiteit van de in vivo omgeving niet wordt gecompenseerd, en daarmee de inductie en regulatie van hNSC differentiatie niet optimaal. In vivo cellen zijn omgeven door een driedimensionale (3D) micro samengesteld door andere cellen en extracellulaire liganden, waaronder veletypes collagenen, laminine en andere matrixeiwitten (extracellulaire matrix, ECM). Eerdere studies hebben gemeld dat de architectonische topografie van de materialen nabootsen ECM&#39;s en hun geometrie invloed cel fenotype en het lot 10-15. Een aantal commercieel verkrijgbare 3D draagstructuren beschikbaar; We gebruikten een zeer poreuze polystyreen steiger ontworpen met een goed gedefinieerde en uniforme architectuur in een 200 um dikke membraan dat een 3D ruimte waarin cellen kunnen binnendringen en differentiëren 16-18 verschaft. Hierin 2D en 3D differentiatie assays worden gebruikt om axonprocess uitgroei beoordelen. Verder beschrijven we een werkwijze voor het miRNA expressie van een klinische kwaliteit hNSC lijn profiel te miRNA effecten op de differentiatie verder te onderzoeken. De werkwijzen hierin geïllustreerd zijn gebaseerd op die welke oorspronkelijk beschreven in 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>Voor RMM medium voorbereiding</td></tr><tr><td>Human Albumin Solution&nbsp;</td><td>Baxter health care limited&nbsp;</td><td>1501052</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 0,03%</td></tr><tr><td>Transferrin, Human recombinant</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 5 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Putrescine DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 16,2 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Insulin, Human recombinant&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 5 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Progesterone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>Sodium Selenite&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>Voor RMM medium gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 40 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Te worden toegevoegd aan RMM medium, gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>Te worden toegevoegd aan RMM medium, gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 20 ng/ml</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Te worden toegevoegd aan RMM medium, gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 100 nM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>Water for irrigation</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&deg;C)</td><td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12 well plate&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;III tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>RNase free DNase&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green PCR kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>Cell Development &amp; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 white 96 plate</td><td>Roche</td><td>&nbsp;4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; sealing foil</td><td>Roche</td><td>&nbsp;4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>MiRNA transfectie controle</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Assay</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 microplate luminometer&nbsp;</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie van een menselijke neurale stamcellen line op three dimensional culturen, analyse van microrna en vermeende doelwit-genen

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neurale stamcellen (NSC) in staat zijn zelf-vernieuwing en differentiatie in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten onder specifieke lokale micro-omgevingen. In hier, presenteren we een set van methoden die worden gebruikt voor het driedimensionaal (3D) differentiatie en miRNA analyse van een klonale menselijke neurale stamcellen (hNSC) lijn, die momenteel in klinische studies voor een beroerte handicap (NCT01151124 en NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs werden afgeleid van een ethisch goedgekeurd eerste trimester foetale cortex en voorwaardelijk onsterfelijk gemaakt met behulp van retrovirale integratie van een enkele kopie van de c-mycER TAM construeren. We beschrijven hoe axon proces uitgroei van hNSCs gedifferentieerd 3D steigers en hoe daarmee samenhangende veranderingen in miRNA expressie met behulp van PCR-array kwantificeren meten. Verder illustreren wij computeranalyse teneinde miRNA selecteren vermeende doelen. SOX5 en NR4A3 werden aangeduid als geschikt miRNA vermeende doelwit van aanzienlijk geselecteerde downregulerend miRNAs in gedifferentieerde hNSC. Mirna targetvalidatie werd uitgevoerd op SOX5 en NR4A3 3&#39;UTRs door dual reporter plasmide transfectie en dual luciferasetest.

In figuur 1 wordt gevisualiseerd onderzoek en kwantificering van hNSC differentiatie 3D draagstructuren vergelijking met traditionele vlakke kweken (2D) en expressedas axon proces uitgroei metingen. In figuur 2 is representedthe workflow en de resultaten voor de miRNA kwantificering met behulp van stamcellen en ontwikkelingstrajecten gericht miRNA PCR array om differentiële expressie van miRNAs in 2D en 3D gedifferentieerde hNSCs vergelijking met ongedifferentieerde controle te onderzoeken. Volgende miRNA vergelijkende analyse tussen gedifferentieerde en ongedifferentieerde hNSCs, en computationele analyse voor doel voorspelling, SOX5 en NR4A3 (NOR1) werden geïdentificeerd als vermoedelijke doelwit mRNA. Om de directe interactie tussen de miRNAs en hun vermeende site op het 3&#39;UTR mRNA gebruikten we 2 in de handel verkrijgbare plasmiden die ofwel SOX5 of NR4A3 3&#39;UTR volgorde geplaatst stroomafwaarts van de vuurvlieg luciferasereportergen, bestuderen een<html> nd die in hetzelfde plasmide Renilla luciferase gen voor normalisatie. De representatieve resultaten van 3 &#39;UTR luciferaseactiviteit neerwaartse regulatie is weergegeven in figuur 3. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figuur 1:. Differentiatie van hNSCs op 3D steigers, en meting van axon proces es uitgroei (A) Naar aanleiding van de ICC-kleuring voor β3-tubuline (groen) en kernen tegengekleurd met Hoechst (blauw) vertegenwoordiger microfoto&#39;s werden verworven en meting van axon processen waren uitgevoerd met behulp van beeldanalyse software. (B) Schema melden het meten van axon uitgroei werkwijze uitgevoerd in 2D en 3D gedifferentieerde hNSCs 1 (1W) of 3 weken (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figuur 2:. Schematische workflow van miRNA profilering in gedifferentieerde hNSCs Totaal RNA, zoals miRNAs, geëxtraheerd uit hetzij gedifferentieerde hNSCs op 3D draagstructuren en standaard 2D culturen of ongedifferentieerde controle. 250 ng totaal RNA waren retro-getranscribeerd met een methode die de selectieve omzetting van volwassen miRNAs in cDNA geschikt voor miRNA kwantificering met menselijke cel differentiatie en ontwikkeling miScript miRNA PCR-array vergemakkelijkt. De geo-gemiddelde van SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A en RNU6-2 werd gebruikt voor data-analyse op basis van de 2 -ΔΔct methode. Significante veranderingen werden gedefinieerd als +/- 1.5 klappen op en neer regelgeving naar een statistically belangrijke mate. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van web-based software verkrijgbaar bij De resultaten worden uitgedrukt als een clustergram. Gewijzigd ten opzichte van figuur 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figuur 3: Validatie van miRNA doelwit voorspeld mRNA met een dual luciferase rapport test. (A) representatief diagram van een duale luciferase reporter plasmide gebruikt als een instrument om 3&#39;UTR sequentie valideren als direct doelwit van een miRNA. (B) Vertegenwoordiger vergroting toont transfectie-efficiëntie. (C) &#160; Signalen, uitgedrukt als relatieve luciferase-activiteit van humane 3 en #39; UTR verslaggevers ofSOX5 en NR4A3 genen werden aanzienlijk neergehaald in de aanwezigheid van HSA-miR-96, en miR-7 HSA-en 17 miRNA bootst respectievelijk. Gewijzigd ten opzichte van Figuur 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Doelgen </td><td> Doelplaatsen / genen gevonden </td><td> Precisie </td><td> Partituur </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Lijst van miRNA doelwit voorspelling mRNA. Representatieve tafel van miRNAs, richten voorspellende genen, en algoritmen analyse (voorspellenion / score / aggregaat geleverd met behulp van Diana Lab, PicTar en TargetScan respectievelijk). Gemodificeerde tabel 3 19.

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de differentiatie van micro-RNA te beoordelen, profiling uit te voeren en target mRNA-validatie te doen van een humane neurale stamcellijn. Dit wordt bereikt door eerst humane neurale stamcellen te kweken op een driedimensionaal culturesysteem om celdifferentiatie te induceren. De tweede stap is om de differentiatie te kwantificeren door de uitgroei van axonprocessen te meten.Vervolgens worden veranderingen in de micro-RNA-expressie geëvalueerd met een micro RNA-PCR-array. Daarna wordt een computationele analyse van geselecteerde differentieel tot expressie gekomen microRNA's uitgevoerd om een set van vermeende doelwit-mRNA's te identificeren. Uiteindelijk worden de doelwit-mRNA's gevalideerd met behulp van een reporterplasmide, transfectie en een duale luciferase-assay.De methode die hier wordt gepresenteerd, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van neurale stamcellen, zoals de karakterisering van tot expressie gekomen microRNA's en hun doelwit-messenger RNA's in menselijke neurale stamcellen tijdens differentiatie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de biologie van neurale stamcellen, kan deze ook worden toegepast op andere stamcelsystemen, zoals mesenchymale stamcellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen of andere systemen die inductie van differentiatie en moleculaire karakterisering vereisen.De visuele demonstratie van deze methode zet de kritieke stappen uiteen in de differentiatie van een menselijke neurale stamcellijn en het onderzoek naar microRNA-profilering en de validatie van doel-mRNA; een deel van de procedure zal worden gedemonstreerd door Lavania, een wetenschapper uit mijn laboratorium. Deze volledige procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet met behulp van aseptische technieken. Hydrateer de scaffolds opnieuw door aan elke put van de AL VX 12 toe te voegen.Vul de putjes van de plaat met twee milliliters 70% ethanol, bereid met irrigatiewater. Voorkom dat de scaffolds worden geraakt door de 70% ethanol langs de wand van elk putje te dispenseren. Aspireer de 70% ethanol zorgvuldig en was de scaffolds onmiddellijk gedurende één minuut met twee milliliters D-M-E-M-F 12 per putje.Herhaal de wasprocedure twee keer en aspireer na de laatste wasbeurt voorzichtig het D-M-E-M-F 12. Coat de scaffolds door twee milliliters laminine in D-M-E-M-F 12 aan elke well toe te voegen. Incubeer de plaat gedurende minimaal twee uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.Was vervolgens de plaat met warm D-M-E-M-F 12 en zaai elk scaffold met ongeveer 500 000 menselijke neurale stamcellen of H nscs in een volume van 150 µL RMM-medium met groeifactoren. Incubeer de plaat drie uur om de cellen de kans te geven zich in de scaffolds te vestigen. Voeg na drie uur 3,5 mL RMM toe aan elke well, waarbij u er zorg voor draagt dat de cellen niet uit de scaffolds worden losgemaakt.Incubeer de plaat gedurende zeven of 21 dagen. Vervang het RMM-medium na één dag, wat de eerste voeding is, en vervang het medium opnieuw twee tot drie dagen na de eerste voeding. Zeven en 21 dagen na de 3D-kweek van H nscs.Verwijder het RMM-medium en fixeer de gedifferentieerde cellen met 4% paraformaldehyde. De gefixeerde cellen worden vervolgens gekleurd met een primair antilichaam tegen bèta III-tubuline, gedetecteerd met een fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam. De celkernen worden tegengekleurd met Hoechst.Leg representatieve beelden vast van de met bèta drie tubuline gekleurde cellen. Sla de beelden met een fluorescentiemicroscoop op in TIFF- of JPEG-formaat. De meting van de uitgroei van axonale processen wordt uitgevoerd met de meettool van de Image Pro Plus 7-software.Open eerst de afbeelding, selecteer de meetoptie in de werkbalk en kies de functie 'trace'. Om de trace te starten, selecteert u het startpunt op de axonale uitgroei door op de muisknop te klikken; traceer langs de gehele lengte van de axonale uitgroei en klik met de rechtermuisknop om elke trace te beëindigen. Meet op deze manier alle axonale uitgroeiën binnen het gezichtsveld en druk de metingen uit in pixels of micrometer.Exporteer lengtemetingen naar een spreadsheetprogramma voor vergelijkende monster- en statistische analyse om veranderingen in de micro RNA-expressie van de driedimensionaal gekweekte HSC's te evalueren. Voer eerst micro RNA-extractie en micro RNA-cDNA-preparatie uit zoals beschreven in het bijbehorende protocol. De tekst volgt direct nadat het micro RNA-cDNA is verkregen.Bereid het mengsel van PCR-componenten voor de real-time PCR voor in een buis van 15 milliliter. Voeg 1375 microliters van een twee X-S-Y-B-R green master mix toe. Voeg 100 microliters micro RNA CD NA, 275 microliters van de universele primer en 1000 microliters RNAse-vrij water toe.Meng de PCR-componenten in een PCR-laadreservoir. Verwijder voorzichtig de 96-well plaat PCR-array uit de verzegelde zak. Voeg met een multikanalenpipette 25 µL van de PCR-componenten toe.Meng in elke put van de PCR-array. Vervang de pipetpunten na elke pipetteerstap om kruiscontaminatie tussen de putten te voorkomen. Sluit de 96-wells plaat af met een optische kleefilm en centrifugeer één minuut bij 1000 GS bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen; inspecteer de plaat visueel om er zeker van te zijn dat er geen bellen in de putten aanwezig zijn.De 96-wells plaat PCR-array in het programma van de realtime cycler. De realtime cycler dienovereenkomstig. Exporteer vervolgens de CT-waarden van alle wells naar een leeg Excel-werkblad voor de analyse van de PCR-array-gegevens; voor de identificatie van voorspelde microRNA-targets wordt een online beschikbaar algoritme, PICktar, gebruikt.Klik op, klik hier voor pic ktar predictie bij gewervelden om een nieuwe pagina in de PIC KTAR webinterface te openen. Kies de soort in het vervolgkeuzemenu en voer het micro RNA van belang in het vak voor micro RNA-ID in. Klik op search om doelen van een micro RNA te zoeken.Er wordt een lijst met doel-mRNA's gepresenteerd, gerangschikt op basis van een PIC KTAR-score. De verkregen rangschikking wordt vervolgens gebruikt om een vergelijkende tabel van microRNA's samen te stellen. Een dubbel luciferase-reporterplasmid wordt gebruikt als instrument om de doel-mRNA's te valideren; de vuurvlieg- en renale luciferase-activiteiten worden gemeten 24 uur na de transfectie van HeLa-cellen.Bereid werkoplossing één voor door 50 µL substraat één toe te voegen aan 10 mL van oplossing één en grondig te mengen. Verwijder het celgroeimedium uit elke put van de 24-wells plaat en voeg 300 µL werkoplossing één toe aan elke put. Draag 100 µL van de inhoud van elke put van de 24-wells plaat over naar drie putten van een 96-wells plaat. Wacht 10 minuten en meet vervolgens de vuurvlieg-luciferase-activiteit in een luminometer die is ingesteld voor luminescentie-acquisitie.Bereid werkoplossing twee voor door 50 µL substraat toe te voegen aan 2 tot 10 mL van oplossing twee en dit grondig te mengen. Voeg 100 µL werkoplossing twee toe aan elke put van de 96-wellsplaat die al 100 µL werkoplossing één bevat. Wacht 10 minuten en meet vervolgens de renale el-luciferase-activiteit.Vervolgens wordt de ratio van luminescentie van de vuurvlieg-luciferase ten opzichte van de renale luciferase berekend. Representatieve microfoto's van H NSCS op 3D-steigers werden verkregen na immunochemische kleuring voor bèta-drie tubuline, weergegeven in het groen, en een tegenkleuring van de kernen met HOECHST, weergegeven in het blauw; de meting van axonale uitlopers werd uitgevoerd met behulp van beeldanalyse-software. Een vergelijking van de groei van axonale uitlopers tussen H nscs gekweekt op 3D-steigers en op traditionele vlakke oppervlakken of 2D-culturen laat zien dat de gedifferentieerde HSC's op de 3D-steigers na één of drie weken een grotere groei van axonale uitlopers vertoonden.Computationele analyse voor doelwitvoorspelling resulteerde in de hier gepresenteerde informatie: een lijst met voorspelde doelwitgenen van microRNA's, inclusief de precisiescore en geaggregeerde waarden. SOX5 en NR4A3 werden geïdentificeerd als putatieve doelwitgenen. Een duale luciferase-reporterassay werd gebruikt om de doelwitten van de microRNA's te valideren, zoals hier wordt getoond.De relatieve luciferase-activiteit van menselijke 3'-UTR-reporters van de genen SOX5 en NR4A3 werd significant verlaagd in aanwezigheid van de aangegeven microRNA's. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze in neurale stamcellen kunt differentiëren en hoe u de microRNA-expressie en de validatie van het doel-mRNA kunt onderzoeken.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video showcases the development and differentiation of human neural stem cells within a three-dimensional scaffold. A laminin coating on the scaffold promotes cell attachment, while a growth factor-free neural medium induces cell differentiation into neural progenitor cells, which extend their processes within a porous architecture in multiple directions, forming a three-dimensional...

Differentiating Human Neuronal Stem Cells into 3D Culture Using a Porous Scaffold

This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-β, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

In this video, a stepwise protocol for Human embryonic stem cells into neural organoids is demonstrated. The method involves inducing neuronal rosette formation, followed by controlled maturation and final culturing on a hydrophobic membrane to achieve fully developed neural organoids.

Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells into Neural Organoids

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.

Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Leer microRNA-analyse en doelwitvalidatie bij differentiatie van menselijke neurale stamcellen in 3D-culturen met behulp van PCR-arrays, computationele voorspelling en dual luciferase-assays.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen (Video) | JoVE Journal

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Meer video's verkennen