Name: De In Ovo Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer hoe je een betrouwbaar CAM-xenotransplantaatmodel ontwikkelt voor hepatocellulair carcinoom met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt groei van 3D-gevasculariseerde tumoren mogelijk met embryonale overlevingspercentages tot 93%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) en het National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1). 
Het Howard Hughes Medical Institute heeft financiering verstrekt voor M.L. via het HHMI Medical Research Fellows Program.

1. broeden <ol><li> Verkrijgen 8 dagen oude specifieke pathogenen vrije bevruchte eieren. </li><li> Plaats de eieren in roterende ei-lade, gestempeld uiteinden naar boven en plaats de draaiende bak binnen een ei incubator. Incubeer eieren voor 48 uur bij 36 ° C en 50% vochtigheid. </li></ol> 2. Het laten vallen van de CAM en openen van de eieren <ol><li> Verzamelen eieren van incubator. Plaats eieren in ei-rek, gestempelde kant naar boven, en breng aan de laminaire stroming kap. </li><li> Schakel de kamer en kap lichten. </li><li> Houd de gestempelde eind licht ei om het ei candler de vasculatuur van de CAM en de luchtzak bloot. LET OP: Het ei candler is een lichtbron wordt gebruikt om de ontwikkeling van het embryo en de bijbehorende luchtzak en vaatstelsel te visualiseren. </li><li> Plaats een potlood merk in tussen twee grote bloedvaten. </li><li> Inschakelen van de verlichting en een steriele punaise een gat aan het uiteinde van het ei boven de luchtzak (gestempeld einde) en een gat aan de pencil merk. Druk niet op de punaise helemaal door; een gat ongeveer 3 mm diep gewoonlijk voldoende. </li><li> Doe de lichten uit. Knijp veiligheid bol, stevig indrukken van de open einde tegen het gat boven de luchtzak. Afzuigen om lucht te trekken in het gat aan het potlood merk, waardoor de CAM om weg te komen uit de schelp te laten vallen op het potlood merk. </li><li> Controleer of de luchtzak is verhuisd van de gestempelde einde van het ei tot het potlood gemarkeerd gat met de Candler. Als het niet, gebruik dan de punaise om beide gaten iets dieper te maken en dan opnieuw afzuigen met de veiligheid lamp. </li><li> De lichten aandoen. Houdt het ei in de ene hand, zet de dremel roterende gereedschap met een 15/16-inch cut-off wiel bevestigd en maak twee dwarse sneden net diep genoeg door de shell te snijden, maar niet diep genoeg om helemaal naar beneden te snijden om de depressieve CAM. Maak de insnijdingen ongeveer 2 cm lang en 1 cm van elkaar. Maak de sneden breed genoeg zodat een siliconering 1 cm in diameter kan passerenmaar dunner dan de breedte van de standaard plakband. </li><li> Vervolgens maak 1 langsuitstraling tussen en aan de uiteinden van de twee dwarse sneden door licht de cut-off wiel om de shell te raken. </li><li> Schuif steriel pincet onder de shell stuk en parallel aan de schelp. Pak de schelp stuk met de tang en verwijder het hele stuk netjes. </li><li> Plaats plakband over de onlangs geopende raam, en zorg ervoor om te vouwen de ene kant op zichzelf voor het gemak van de verwijdering. </li><li> Plaats eieren terug in de incubator eiertray (niet in de roterende ei racks) op het moment van inoculatie. </li></ol> 3. Inoculatie <ol><li> Houd kelder membraaneiwit mengsel, zoals matrigel, op ijs in kap (om polymerisatie te voorkomen) en plaats. </li><li> Gebruik 2 mM EDTA om cellen los (4 - 5 ml per T75 fles) en plaats kolven weefselkweek incubator gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de vrijstaande cellen in de media en te tellen met behulp van een hemocytometer en trypaanblauw. Gebruik tussen de 500.000 to 2.000.000 cellen voor het enten op de CAM, afhankelijk van de cellijn. Optimaliseer het juiste aantal in voorlopige experimenten. </li><li> Meet volume vereist voor juiste celaantal en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min. </li><li> Gooi supernatant en resuspendeer de cel pellet in 40 μ l PBS ++ en 20 μ l van basaal membraan mengsel. Opmerking: Op dit punt worden cellen behandeld met geneesmiddelen of andere testmiddelen zoals nodig voor experimenten van resuspenderen in de cel / basaalmembraan mengsel suspensie. Als alternatief, kunnen agenten worden gepipetteerd op de cel / basaal membraan mengsel schorsing na enten. </li><li> Ophalen ei rek met eieren van de incubator en plaats in de laminaire stroming kap. </li><li> Schil tape off van het raam, op te halen een 1 mm siliconen ring van de dop van een cryogene flacon met behulp van gesteriliseerde pincet, en laat de ring door het raam. </li><li> Pipet de 60 μ l mobiele oplossing van PBS ++ en basaal membraan Mixture direct in het midden van de silicone ring rust op de CAM. </li><li> Re-tape het raam en beweeg ei rek terug naar incubator. Op dit punt, wees voorzichtig bij het verplaatsen van de eieren als de ring en de celsuspensie kan gemakkelijk raken ontheemd. </li><li> Laat tumoren groeien 5 tot 7 dagen. </li></ol> 4. Oogsten Tumoren <ol><li> Plaats onder-pad in capuchon. Bereid 35 x 10 mm platen en paraformaldehyde containers nodig voor histologie. Zet 1 ml PBS ++ in elk 35 x 10 mm plaat. </li><li> Plaats biohazard zak in kap. Neem steriele dissectie schaar en steek de punt in het ei bij het gat in de buurt van de gestempelde einde. </li><li> Snijd rond het hele ei lengterichting. OPMERKING: de CAM en de tumor met de ring moet vasthouden aan de bovenste helft van de shell met het raam. </li><li> Gebruik dissectie scharen en pincetten, ontleden de tumor van het CAM en plaats tumor in de 35 x 10 mm plaat. Meten en te wegen tumoren. Vaste tumoren in paraformaldehyen dan de paraffine-inbedding ze voor gebruik in de histologie en immunohistochemie experimenten. </li></ol> 5. (Optioneel): Tumor Cell Dissociatie <ol><li> Gebruik dissectie schaar om de tumor in de 35 x 10 mm plaat blad voor de mond. Giet gehakt tumor in een 15 ml centrifugebuis en verwijder zo veel PBS ++ mogelijk door middel van pipetteren. </li><li> Voeg 2 ml collagenase (1 mg / ml in PBS ++), draai buis over meerdere malen en incubeer buis bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten (tot enkele uren). </li><li> Voeg 5 ml medium aan elke buis en resuspendeer grondig op en neer te pipetteren 20 - 40x. Grondige pipetteren is van cruciaal belang voor een volledige cel dissociatie. </li><li> Sta neerslag bezinken, en breng de supernatant naar een nieuwe buis. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min. Verwijder supernatant, met achterlating van gedissocieerde celpellet. Opmerking: Op dit punt kan celpellets worden gebruikt voor verschillende experimenten (flow cytometrie, lysis gebruikt in Western blotting, RNA-isolatie, etc). Totaal aantal tumorcel kan ook worden verkregen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw kleuring. Merk op dat kleinere ovale cellen kippen cellen van de CAM en mag niet als tumorcellen. Er moet een minimum aantal contaminerende niet-tumor (CAM) cellen of de tumor weg zorgvuldig ontleed uit de CAM zijn. </li></ol>

<ol><li>Sangiovanni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+of+cirrhotic+patients+with+a+hepatocellular+carcinoma+detected+during+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.</a> Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).</li>
<li>Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review%3A+evidence-based+management+of+hepatocellular+carcinoma--an+updated+analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials.</a> Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%28MAPK%29+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3B+regulation+by+p38%28SAPK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK).</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+do+not+arise+from+tumor-initiating+cells+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma.</a> BMC Cancer. 13, 485(2013).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+novel+immunomodulating+agent%2C+FTY720%2C+on+tumor+growth+and+angiogenesis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+coordinates+interaction+of+pericytes+and+endothelial+cells+during+vasculogenesis+and+experimental+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis.</a> Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).</li>
</ol>

A.S. ontvangt financiering van het farmaceutische bedrijf Advaxis om een door onderzoekers geïnitieerde klinische proef te ondersteunen.

Een aantal belangrijke stappen in dit protocol waarschijnlijk goed voor de verbeterde embryo overleving evenals verhoogde betrouwbaarheid van tumorgroei. Laten vallen van de CAM uit de buurt van de schaal door te zuigen aan de luchtzak is minder invasief dan andere bestaande methoden (met behulp van een naald aan albumine uit het ei, stompe dissectie, enz. Te verwijderen). Met behulp van een steriele punaise op de twee kleine gaten vereist voor deze methode te maken is de meest uitdagende deel van het protocol. Het gebr...

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de 3 belangrijkste oorzaak van kankersterfte ter wereld 1. Nog slechts 30% van de HCC patiënten komen in aanmerking voor curatieve chirurgische behandelingen 2 en systemische chemotherapie niet effectief 3. Daarom is er dringend onvervulde medische behoefte aan nieuwe therapieën HCC en de ontwikkeling van modelsystemen geschikt voor het efficiënt testen van nieuwe middelen. De chick chorion-membraan (CAM) assay levert een reproduceerbare, rendabele en snelle middellange-throughput werkwijze voor het testen van potentiële anti-tumor drugs in vivo. De CAM-assay is uitgebreid toegepast om angiogenese te bestuderen 4. Het is ook met succes ontwikkeld tot een tumor xenograft model van kanker, zoals glioblastoom 5, 6 pancreaskanker, melanoom 09/07, 11/10 en osteosarcoom. Zowel in ovo 12 en ex ovo13 technieken zijn toegepast in de literatuur met gegevens variërend van protocol protocol. Een belangrijke uitdaging voor de CAM xenotransplantaatmodel is de relatief hoge incidentie van embryonale sterfte na manipulatie van het ei, met gepubliceerde kippenembryo sterftecijfers variërend 25-50 procent 11-14. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een in ovo xenotransplantaatmodel van HCC die betrouwbaar produceert groei van drie-dimensionale, gevasculariseerde tumoren die histologisch lijken ongedifferentieerde HCC. We hebben een protocol voor het eerst beschreven door Ossowski et al. 14 aangepast en chick embryonale overleving tot 93% met een extreem hoge tumor implantatie hebben bereikt.

<table><tbody><tr><td>Premium incubated eggs</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>Egg incubators</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>Rotating egg trays</td><td>GQF</td><td>1611 Automatic Egg Turner</td><td></td></tr><tr><td>Egg candler</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials, external thread with silicone washer</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

de<em&gt; in ovo</em&gt; chick chorioallantoïsmembraan (cam) assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van hepatocellular carcinoom

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

De chick chorion-membraan (CAM) begint te ontwikkelen op dag 7 na de bevruchting en rijpt op dag 12. De cam is natuurlijk immunodeficiënte en sterk doorbloed, waardoor het een ideaal systeem voor tumor implantatie. Voorts bevat de CAM extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, laminine, collageen, integrine alfa (v) beta3 en MMP-2, waardoor het een aantrekkelijk model voor tumor invasie en metastase te onderzoeken. Wetenschappers hebben lang gebruik gemaakt van de fysiologie van de CAM door het te gebruiken als een model van angiogenese. Meer recent heeft de CAM-assay aangepast om te werken als een in vivo xenograft model voor verschillende kankers die de kloof tussen basic in vitro werk en complexere dierlijke modellen van kanker overbrugt. De CAM-assay maakt de studie van tumorgroei, antitumor therapieën en pro-tumor moleculaire pathways in een biologisch systeem waarin zowel kosten- en tijd-effectief. We beschrijven hier de ontwikkeling van de CAM xenograft model van hepatocellulair carcinoom (HCC) embryonale overleving tot 93% en betrouwbare tumor nemen leidt tot groei van driedimensionale, gevasculariseerde tumoren.

Representatieve foto belangrijkste stappen in het protocol worden hier getoond. Figuur 1A toont het gebruik van de candler het ontwikkelende embryo, de luchtzak en het vaatstelsel van de CAM visualiseren. Figuur 1B-1C tonen het proces van het vervallen van de CAM door de twee gaten en het vervolgens toepassen onderdruk via de veiligheids- lamp en figuur 1D toont een succesvol liet CAM met een grote luchtbel onder potlood gemerkt hole. Figuur 1E en figuu...

Het dooierzakmembraan van het kuiken (CAM) is immuundeficiënt en sterk gevasculariseerd, waardoor het een natuurlijke in vivo model van tumorgroei en angiogenesis is. In dit protocol beschrijven we een betrouwbare methode om driedimensionale, gevasculariseerde hepatocellulair carcinoom (HCC) tumoren te laten groeien met behulp van de CAM-assay.

De<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Het algemene doel van dit experiment is het ontwikkelen van een betrouwbaar cam-xenograftmodel van hepatocellulair carcinoom. Dit wordt bereikt door de eieren eerst te incuberen ter voorbereiding op de inoculatie. Als tweede stap wordt het choriaal- en allantoïs-membraan of de cam van het ei verlaagd en wordt er een venster in de eierschaal gesneden.Vervolgens wordt het ei geïnoculeerd met humane hepatocellulaire carcinoomcellen via het venster in de eierschaal om tumorgroei te bewerkstelligen. De resultaten tonen aan dat driedimensionale gevasculariseerde tumoren succesvol zijn gekweekt met behulp van humane hepatocellulaire carcinoomcellijnen. Met dit protocol werden embryonale overlevingspercentages tot 93% bereikt.De belangrijkste voordelen van de CAM-assay ten opzichte van andere in vivo-technieken, zoals muistumormodellen, zijn de korte experimentele doorlooptijd, de lage totale kosten van het experiment en de goede reproduceerbaarheid. CAM-assays kunnen worden gebruikt om angiogenese, tumorcelinvasie en metastase te bestuderen. Ze kunnen daarnaast worden ingezet om het effect van kleine moleculen en geneesmiddelen op de groei en ontwikkeling van tumoren te bepalen.Een visuele demonstratie van deze procedure is belangrijk vanwege de verschillende stappen die komen kijken bij het voorbereiden van het ei, waaronder het lichtonderzoek, het identificeren van de vasculatuur en het maken van kleine gaatjes nabij de luchtzak en bovenop het ei zonder dit leeg te laten lopen. Het opensnijden van de vensters zonder de eierschaal te breken en het waarborgen dat de embryo-as intact blijft tijdens alle processen kan uitdagend zijn voor nieuwe gebruikers. Begin met het plaatsen van.Acht dagen oude, specifieke-pathogeen-vrije embr native kippeneieren in een draaibare eierlade met de gestempelde zijde naar boven. Plaats de draaibare lade in een eierincubator bij 36 °C met een luchtvochtigheid van 50% en incubeer de eieren gedurende 48 uur. Plaats de eieren na incubatie in een eierrek met de gestempelde zijde naar boven en zet deze in een laminaire flowkast.Schakel de kamer- en zuurkastverlichting uit. Houd het gestempelde uiteinde van het ei lichtjes tegen de eierkijker om de vascularisatie van het chorio-allantoïsche membraan van het kuiken, bekend als de CAM, en de luchtkamer zichtbaar te maken. Zet met een potlood een markering tussen de twee belangrijkste bloedvaten. Maak vervolgens één gaatje in de punt van het ei boven de luchtkamer aan het gestempelde uiteinde en een tweede gaatje op de potloodmarkering.Gebruik een steriele punaise om een gat van ongeveer drie millimeter diep te maken. Knijp de lucht uit een zuigballon en druk het open uiteinde stevig tegen het gat boven de luchtzak. Laat de ballon langzaam los om zuigkracht uit te oefenen, waardoor lucht door het gat bij het potloodmerk wordt getrokken en de cam van de schaal loslaat.Bevestig met de eierkijker dat de luchtkamer is verschoven van de gestempelde zijde van het ei naar het met potlood gemarkeerde gat. Is dit niet het geval, maak dan beide gaten iets dieper en breng opnieuw zuigkracht aan met de rubberen zuigballon. Houd vervolgens het ei in één hand en gebruik een rotary tool met een doorslijpschijf van 1/16 inch.Maak twee transversale sneden door de schedel zonder de cam aan te raken. De sneden moeten twee centimeter lang zijn en één centimeter uit elkaar liggen. Maak vervolgens aan de uiteinden van de twee transversale sneden longitudinale sneden door het afsnijwieltje lichtjes tegen de schedel te plaatsen.Plaats een steriele pincet onder en parallel aan het stukje schaal om dit te verwijderen. Pak het stukje met de pincet vast en verwijder het zorgvuldig. Houd één uiteinde van een stuk plakband over zichzelf gevouwen en plaats het plakband vervolgens over de opening in het ei.Plaats het ei in een eierhouder en zet de houder zonder rotatie gedurende maximaal twee tot drie uur in de incubator vóór de inoculatie. Ter voorbereiding op de inoculatie wordt een mengsel van basaalmembraaneiwitten, zoals matrigel, op ijs geplaatst om polymerisatie te voorkomen. Gebruik vervolgens vier tot vijf milliliter van een 2 mM EDTA-oplossing per kolf om de tumorcellen los te maken en plaats de kolf gedurende vijf minuten in de weefselkweekincubator.Resuspendeer de losgekoppelde cellen in het medium en tel het aantal cellen. Gebruik, afhankelijk van de cellijn, tussen 500.000 en 2 miljoen cellen voor enting op de cam. Breng vervolgens het volume dat nodig is om het juiste aantal cellen te verkrijgen over naar een nieuwe buis en centrifugeer gedurende vijf minuten.Centrifugeer bij 500 ×g, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 40 µL PBS met calcium en magnesium (bekend als PBS++) en 20 µL basementmembraanmengsel. Op dit punt kunnen geneesmiddelen of andere testagentia aan de celsuspensie worden toegevoegd.Plaats vervolgens het eierrek in de laminaire flowkast. Verwijder de tape van het ei en laat een steriele siliconen ring van 1 mm uit een cryovial door de opening op de cam-pijp vallen. Breng de 60 µL oplossing van cellen, PBS++ en basement membraanmengsel aan in het midden van de siliconen ring, plak het venster opnieuw dicht en verplaats het eierrek voorzichtig terug naar de incubator.Laat de tumoren vijf tot zeven dagen groeien. Voor het oogsten van de tumoren: plaats een onderlegger en een biohazard-zak in de zuurkast.Bereid platen van 35 millimeter bij 10 millimeter voor die één milliliter PBS++ bevatten, en bereid paraformaldehyde-containers voor zoals nodig voor histologie. Steek het scherpe uiteinde van een steriele dissectieschaar in het ei via het gat nabij het gestempelde uiteinde en knip langs de gehele lengte van het ei. De cam en de tumor met de ring moeten aan de bovenste helft van de schaal met de opening blijven kleven.Verwijder de tumor uit de cam middels dissectie met behulp van een schaar en pincet, en plaats de tumor in een plaat van 35 millimeter bij 10 millimeter. Meet en weeg de tumor. Fixeer de tumor in paraformaldehyde en bed het in paraffine voor gebruik in histologische en immunohistochemische experimenten.Nadat de tumor is geoogst, wordt deze op het plaatje fijngehakt met dissectiescharen. Giet het fijngehakte tumorgeweefsel vervolgens in een centrifugebuis van 15 milliliter en verwijder de PBS plus plus door middel van pipetteren. Voeg twee milliliters van een oplossing van collagenase in PBS plus plus van één milligram per milliliter toe en meng dit door de buis enkele keren om te keren.Incubeer de buis bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten en tot meerdere uren. Voeg vervolgens vijf milliliter medium toe aan de buis en meng grondig door 20 tot 40 keer te pipetteren. Dit is essentieel voor het volledig dissociëren van de cellen.Nadat het sediment is bezonken, wordt de suspensie overgebracht naar een nieuwe buis, wordt de buis vijf minuten gecentrifugeerd bij 500 ×g en wordt het supernatant weggegooid, waarbij het pellet van gedissocieerde cellen achterblijft. Wanneer de CAM was geplaatst met HUH-7 tumorcellen, was er een gevasculariseerde tumor zichtbaar binnen de ring. Na vijf dagen groei toonde histologie van de HUH-7 tumor uit de CAM-assay aan dat de tumorcellen lijken op ongedifferentieerde hepatocellulaire carcinoomcellen.Bij het werken met deze methode is het belangrijk om te onthouden dat bepaalde optimalisaties mogelijk nodig zijn wat betreft verschillende cellen of verschillende geneesmiddelen. Zo kunnen sommige cellijnen een hogere of lagere dichtheid vereisen om driedimensionale tumoren te vormen.

the-ovo-chick-chorioallantoic-membrane-cam-assay-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het kuiken chorion-membraan (CAM) is een uniek, natuurlijk immunodeficiënte ondersteunende cultuur omgeving om angiogenese en tumorigenese studie. Deze video artikel demonstreert de verschillende stappen in het...

Kuiken Ex ovo Cultuur en Ex ovo CAM test: Hoe het echt werkt

In this video, we describe the implantation of cancer cells onto a chicken chorioallantoic membrane to generate an in ovo model. The model successfully engrafts the ovarian cancer cells to study the progression of gynecological cancer.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis

In this video, we describe the method to co-culture dorsal root ganglia and cancer cells on chick chorioallantoic membrane or CAM to study perineural invasion.

Chick Chorioallantoic Membrane or CAM Tumor Model: An In Ovo Method to Simulate Perineural Invasion of Tumor Cells

This video demonstrates the isolation of tumor-bearing chorioallantoic membrane from the chicken embryo. The harvested CAM can be used for further downstream applications.

Chick Chorioallantoic Membrane Harvest: A Method to Isolate Tumor Graft-bearing Chorioallantoic Membrane from Chicken Egg

De<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-assay als Xenograftmodel voor sarcoom

Perineural invasie is een agressief fenotype voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere tumoren. Het kuiken chorioallantoic membraan model is gebruikt voor het bestuderen van bloedvat, kanker invasie, en metastase. Hier laten we zien hoe dit model kan worden gebruikt om perineural invasie in vivo te beoordelen.

Het kuiken Chorioallantoic membraan in vivo model om Perineural invasie in hoofd en hals kanker te beoordelen

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) als een in vivo model om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen.

De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies

Hier beschrijven we een protocol voor het ontwikkelen van een xenotransplantatiemodel voor kuikenchorioallantoïsch membraan (CAM) voor menselijk eierstokweefsel en demonstreren we de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek voor revascularisatie van het transplantaat en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen.

Het Chick Chorioallantoic Membrane (CAM)-model als hulpmiddel om ovariële weefseltransplantatie te bestuderen

Leer hoe je een betrouwbaar CAM-xenotransplantaatmodel ontwikkelt voor hepatocellulair carcinoom met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt groei van 3D-gevasculariseerde tumoren mogelijk met embryonale overlevingspercentages tot 93%.

De

Meer video's verkennen