Name: Teelt van Heligmosomoides Polygyrus: Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Leer de teelt van Heligmosomoides polygyrus en de isolatie van immunomodulerende uitgescheiden moleculen uit weefselkweek. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van immuunsuppressie en potentiële therapieën voor allergieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs worden gefinancierd door de Wellcome Trust via de Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) en Programme Grant (Y.H. en R.M.M.) en Fellowship (J.R.G) financiering, de BBSRC (G.C.), de American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. en R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) en de Rainin Foundation (D.J.S. en R.M.M.).

OPMERKING: Alle procedures in dit protocol worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken en de Universiteit van Edinburgh Veterinary Services instellen. 1. Infectie van Muizen door Gavage <ol><li> Store Heligmosomoides polygyrus L3 larven in gedestilleerd water voor maximaal zes maanden bij 4 ° C. </li><li> Voor het gebruik, wassen L3 larven drie keer in gedestilleerd water: centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min (met rem), verwijder alle maar 500 ul van water (om storende gepilleerd L3 larven te voorkomen) en resuspendeer de pellet elke keer. </li><li> Voor de derde maal, voeg water toe tot een exacte volume (gewoonlijk 40 ml) en zuig 20 gl met 200 ul tip gesneden zijn opening verbreden. Plaats twee 20 ul monsters op het oppervlak van een 60 mm kweekschaal en tel de L3 larven (meestal mobiel en best bekeken onder 50x vergroting met een dissectie microscoop). Resuspendeer de laatste pellet in gedistilleerd water om een ​​concentration van 2.000 L3 larven per ml. </li><li> Voor levenscyclus productie, infecteren 8 weken oude F1 (C57BL / 6xCBA) muizen met 400 H. polygyrus L3 larven in 200 ul van gedestilleerd water door orale sondevoeding (bedwingen muizen in de verticale positie door de nekvel en voorzichtig langs de botte maagsonde naald door de mond en de slokdarm naar de maag). Schud grondig vóór elke infectie (larven vestigen snel in water) en zuig 200 ui in een spuit van 1 ml; gebruik maken van een speciale sondenaald met een afgerond uiteinde. Voor experimentele infectie van jongere muizen (6-8 weken oud), of andere ingeteelde stammen (bijvoorbeeld C57BL / 6 of BALBc), infecteren muizen met 200 L3 larven. </li></ol> 2. Voortplanting en onderhoud van H. polygyrus <ol><li> Plaats houtskool in het centrum van een grote plastic kuip en laat koud leidingwater te lopen over het voor een minimum van 30 min (ongewassen actieve kool is giftig voor L3 larven). Tap het water uit het bad en plaats de houtskool op two lagen van absorberend papier, waardoor het blootgesteld aan lucht in de ruimte tot het volledig droog. </li><li> Als eieren vereist, schraap uitwerpselen eerst uit het colon met een tang (en schaar indien nodig). Als een groot aantal L3 larven nodig, plaatst muizen op een draadrooster en laat fecale pellets gedurende enkele dagen. </li><li> Meng de ontlasting met gekorrelde houtskool in een verhouding van ten minste 1: 1, tot een consistentie net vochtig genoeg te houden aan filtreerpapier. Smeer een dunne laag op het midden van een aantal vochtige filtreerpapier in een petrischaal en plaats deze in een vochtige doos (voeg wat vochtige papieren handdoek en een schotel van water) in het donker voor de 12-14 dagen. </li><li> Verwijder L3 larven van dag 7 verder, en verzamel ze op ten minste twee keer voordat het papier wordt weggegooid. De larven een ring rond de rand van het filtreerpapier; Til het filter papier uit de petrischaal en spoel de larven die nog over zijn van de plaat (met behulp van een pipet en 5 ml steriel water per plaat) in een 50 ml buis. </li><li> Liftuit het filter met het oogsten van de resterende larven links op de plaat met gedestilleerd water in een 50 ml buis. Centrifugeer het effluent oplossing bij 300 xg gedurende 10 min. Was de larven driemaal met gedestilleerd water en bewaar bij 4 ° C bij 50 ml gedestilleerd water tot nodig. OPMERKING: Larven levensvatbaar blijven en besmettingen ten minste 6 maanden. </li></ol> 3. Het verzamelen van Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereid de gemodificeerde Baermann Inrichting tevoren figuur 1. </li><li> Ruiming muizen veertien dagen na infectie. </li><li> Was de buik met 70% ethanol. Snijd de huid over de buik en trek terug naar de voorste buikwand onthullen. Maak middellijn incisie aan de peritoneale holte voeren. </li><li> Verwijder de gehele dunne en dikke darm (van proximale twaalfvingerige darm tot distale rectum). Leg in een droge petrischaal. </li><li> Strek de darm over de volledige lengte; uitsnijden de ontlasting bevattende colon; plaats deze in een apart schaaltje voor ei voorbereidingen later. </li><li> Accijnzen de proximale 20 cm van de dunne darm dat de volwassen wormen -identified door de relatief dikke wand van het duodenum en vaak een rode uitstraling door de intra-luminale wormen bevat. Plaats in een (100 mm diameter) petrischaal met 5 ml Hanks &#39;oplossing, verwarmd tot 37 ° C (twee monsters per schaal). </li><li> Open de-worm gevuld proximale darm deel in de lengte met een schaar (round-ended schaar zijn het beste voor deze), en schraap beneden binnenkant van de darm voering met twee glaasjes om de wormen te verwijderen. Gooi dan de schone darmwand. </li><li> Tip wormen in kleine mousseline tassen, nieten gesloten en veilig met paperclips rond de rand van de glazen trechter (figuur 1). </li><li> Vul trechter met Hanks &#39;Solution en voeg ongeveer 4 petrischalen van wormen in elke trechter. </li><li> Zet het apparaat op 37 ° C incubator voor 1-2 uur, halverwege voorzichtig schudden door te verjagenpuin van de darm voorbereiding die de mousseline filter kan verstoppen. Zorg ervoor dat het morsen van puin buiten de mousseline zak te vermijden - dit zal vervuiling van de uiteindelijke HES voorbereiding veroorzaken. Volwassen wormen moet langzaam gemigreerd door neteldoek en zich op de bodem van de glazen reageerbuis. Voorzichtig los van de reageerbuis uit het aansluiten van rubberen slang boven de gootsteen (zorg om te voorkomen dat wormen op dit punt). </li><li> Met behulp van een plastic pipet de wormen in een 50 ml buis en was zes keer met Hanks &#39;Solution (laten wormen om media af te wikkelen met de zwaartekracht, verwijderen met een stripette, voeg 40 ml Hanks&#39; oplossing en herhaal vijf keer). OPMERKING: worm cultuur moet steriel gehouden worden vanaf dit punt. <ol><li> Naar een laminaire stroming kap en was nog zes keer in oplossing steriele Hanks &#39;aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, klaar voor in vitro kweek. </li></ol></li><li> Tel devolwassen wormen hersteld door het nemen van twee monsters van 20 ul in beslag genomen met een gele tip gesneden om haar diafragma te verruimen; verwachten dat ongeveer 50% van de hoeveelheid geënte larven. </li></ol> 4. Installatie culturen voor HES: Medium Voorbereiding, wassen volwassen wormen <ol><li> Week de wormen 3.11 ongeveer 10 ml RPMI aangevuld met 10% gentamycine gedurende 20 minuten, waardoor de buis rust in een hoek te waarborgen wormen volledig afgedekt. </li><li> Voer deze in een laminaire stroming kap: Was opnieuw zesmaal Hanks &#39;oplossing (aangevuld met 5 U / ml penicilline en 5 ug / ml streptomycine). </li><li> Bereid H. polygrus media. </li><li> Handhaving steriliteit in een laminaire stroming kap, 500 ml RPMI1640, voeg 11,1 ml 45% glucose (eindconcentratie 1,2% als RPMI 1640 bevat 0,2% glucose), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycine (eindconcentratie 5 U / ml penicilline, 5 ug / ml streptomycine), 5 ml L-glutamine (eindconcentratie 2 mM), en5 ml gentamycine (eindconcentratie 1%). Laat FCS niet toevoegen. </li><li> Portie wormen in ontlucht T25 flessen, ong. 1000 wormen in 15 ml H. polygyrus media per fles, en plaats rechtop in 37 ° C incubator (5% CO 2) gedurende 3 weken. </li></ol> 5. Bereiding van HES <ol><li> Verzamel HES-bevattende kweekmedia uit culturen met tussenpozen van niet meer dan twee keer per week, afgezien van de eerste collectie na 24 uur van de cultuur (vanwege de hoge niveaus van LPS besmetting en gastheereiwitten - kan apart worden verwerkt of verwijderd). Houd elke collectie gescheiden en duidelijk zijn gemarkeerd met de datum en het nummer van de partij. Vervangen door een gelijk volume H. polygyrus media bij elke gelegenheid. </li><li> Centrifuge HES-bevattende media bij 400 x g gedurende 5 min. Vervolgens filteren steriliseren door 0,2 micrometer eiwitarme-bindend filters in 50 ml buizen. Bewaren in de -20 ° C vriezer duidelijk gelabeld met datum van worm oogst en datum van HES collectie. </li><li> Na 21 dagen van HES collectie van cultuur, gooi wormen. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES supernatant (meestal van bevroren voorraad, en niet met inbegrip van de eerste 24 uur verzamelen) en concentreer je dan een 3000 MWCO filter in de ultrafiltratie apparaat onder stikstofdruk. LET OP: Wees zeer voorzichtig het filter drooglopen niet te laten. <ol><li> Voor het instellen van het filter apparaat, eerst was de 3 kDa membraan glimmende kant naar beneden in een 1 liter beker met gedestilleerd water gedurende 3 x 20 min roeren. Monteer de ultrafiltratie inrichting volgens instructies van de fabrikant met filtermembraan glanzende zijde. Plaats in de kast bij 4 ° C en laat 50 ml gedestilleerd water door voordat u begint met gepoolde HES concentreren. </li><li> Naar elke buis van HES in de filtratie-inrichting vereist (100-140 ml per dag), totdat het volume geconcentreerd tot 2-5 ml. </li></ol></li><li> Om verontreinigingen uit de HES-bevattende kweekmedia verwijderen, 50 ml pyr voegenOgen-vrij PBS om de filterinrichting en vervolgens ingedampt tot ongeveer 2 ml. Herhaal deze stap tweemaal (150 ml PBS in totaal). Breng HES in een 15 ml buis, filter steriliseren (met een 0,2 urn filter) in een laminaire stroming kap en eiwitconcentratie te meten met een spectrofotometer (E 280 = 10) of door Bradford assay. </li><li> Portie, label met batchnummer en datum, en bevriezen bij -80 ° C. </li><li> Voer een chromogene LAL assay volgens de protocollen van de fabrikant op elke partij HES vóór gebruik. Als LPS niveaus groter dan 1 U LPS per 1 ug eiwit overwegen niet deze batch in vivo of in vitro culturen. </li><li> Verwerk de gegevens over 24 uur apart op dezelfde wijze HES; zal LPS en enige gastheer eiwitten en, hoewel niet geschikt voor functionele experimenten, is een nuttige bron van individuele moleculen die door monoklonaal antilichaam affiniteit zuivering kan worden geïsoleerd. </li></ol&gt;

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

De levenscyclus van H. polygyrus verloopt in een betrouwbaar consistente wijze. Na natuurlijke inslikken of orale gavage van L3 larven op dag 0, cysten beginnen te vormen onder de twaalfvingerige serosa op dag 5, overgaand in larvale vervellingen en opkomende als volwassen wormen in het darmlumen van dag 10 kunnen de eieren worden gezien in feces van dag 14 en granulomen zijn zichtbaar op de duodenale serosale oppervlak van dag 21. De hierboven beschreven (en samengevat in figuur 6) protocol maakt high-throughput productie van H. polygyrus excretory-uitscheidingsproducten (HES), naast betrouwbaar herstel van levensvatbare L3 larven toekomstige experimentele en levenscyclus infecties. H. polygyrus infectie aangetoond beschermend in modellen van astma afhankelijk OVA of Der p 1 (huisstofmijtallergeen) 14 zijn. Bovendien kon onderdrukking van luchtwegontsteking worden overgedragen met CD4 + CD25 + </sup&gt; regulerende T-cellen 14 of CD19 + CD23 hi regulerende B-cellen 24 van niet-gesensibiliseerde, H. polygyrus geïnfecteerde muizen. In modellen van auto-immuniteit, H. polygyrus infectie is aangetoond suppressieve in experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) model voor multiple sclerose 9 zijn, en onderdrukking kunnen worden overgedragen met ofwel CD4 + T cellen of CD19 + B-cellen van geïnfecteerde muizen 24. Heligmosomoides polygyrus excretory-uitscheidingsproducten (HES) moduleren de immuunrespons en onderdrukken Th2 gemedieerde inflammatie door verschillende mechanismen (aangegeven in figuur 7), inclusief: a) Remming van dendritische cel respons op stimulatie 25, b) inductie van CD4 + Foxp3 + regulerende T-cellen 18. en c) blokkade van IL-33 productie 20. HES is aangetoond beschermend te zijn wanneer toegediendt overgevoeligheid of uitdaging in de OVA-aluin model van astma 19 en ook wanneer intranasaal toegediend met Alternaria extract allergeen 20, door middel van onderdrukking van de vroege IL-33 release. Vermijden van LPS besmetting van HES is vaak cruciaal voor het succes van toekomstige immunologische experimenten. In het protocol hier geschetst, de kritische stappen in het bereiken van deze zijn om dat puin opgenomen in de neteldoek zakken van de Baermann apparaat overschrijdt niet de laatste HES voorbereiding voer te waarborgen (zie 2.10) en opzij te zetten ES oplossing uit de eerste 24 uur van de cultuur (zie 5.1). In de afgelopen jaren heeft HES grondig gekarakteriseerd aan de proteomics-niveau met meer dan 370 verschillende eiwitten geïdentificeerd 26,27. Bovendien heeft ES van de 4e graad larven ondergaan proteoomanalyse 28. Lopende werk omvat het karakteriseren van de belangrijkste glycaan- componenten van HES, bekende sterk immunogeen 3 te zijn, en uitgescheiden micro-RNAls die zijn ingekapseld in 50-100 nm blaasjes of exosomen (Buck et al., Ingediend voor publicatie). Met de oprichting van reproduceerbare protocollen voor het verzamelen van ES van deze zeer immunomodulerende parasiet, en met uitgebreide proteomics identificatiegegevens van de moleculaire componenten van HES, is het podium nu voor de identificatie en therapeutische testen van individuele moleculen van H. polygyrus die belangrijke effecten op de gastheer immuunsysteem mediëren.

Heligmosomoides polygyrus is een natuurlijke muizen gastro-intestinale worminfecties, dat nauw verwant is aan zeer voorkomende menselijke nematode parasieten 1. In tegenstelling tot andere nematode modellen zoals Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus stelt consequent chronische infectie bij muizen als een direct gevolg van meerdere krachtige immunomodulerende mechanismen die zij in dienst bij de gastheer immuunrespons 2 onderdrukken. H. polygyrus heeft een directe levenscyclus: infectieuze L3 larven worden ingenomen door FECO-orale transmissie (of door orale maagsonde in het laboratorium setting toegediend), waarna ze migreren naar de subserosal laag van de twaalfvingerige darm en encyst alvorens terug te keren naar het darmlumen als volwassen wormen ongeveer acht dagen na de eerste infectie. Paring en de productie van eieren gebeurt op dag 10 en het is mogelijk om volwassen wormen voor cultuur en verzamelen van excretie-secretoire producten van da oogsteny 14 vanaf 3. H. polygyrus interageert ook met de commensale microflora, met verhoogde Lactobacilli aanwezig in geïnfecteerde vatbare muizen 4-6 en verhoogde H. polygyrus infectie na blootstelling van muizen om Lactobacillen 6. Actieve infectie met H. polygyrus is aangetoond tegen immunopathologie vele diermodellen van autoimmuniteit 7-10, colitis 11,12 en allergie 13-16. Er werd dan ook grote interesse in het potentieel van uitscheidingsmechanisme-Secretory moleculen van deze parasiet (&quot;HES&quot;) naar beneden-moduleren pathologie in vivo 17,18. Inderdaad, zijn beschermende effecten waargenomen na behandeling van muizen met HES producten 19 tot en paden die nu worden geïdentificeerd 18,20. Hier beschrijven we een protocol voor de betrouwbare productie van Heligmosomoides polygyrus en invordering van haar afgescheiden productendat verder kan worden gebruikt voor verschillende functionele biochemische en immunologische onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639 </td><td>25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

teelt van<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; een immunomodulatory nematode parasite en haar uitgescheiden producten

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (voorheen bekend als Nematospiroides dubius, en ook genoemd door sommigen als H. bakeri) is een gastro-intestinale worminfecties die meerdere immunomodulerende mechanismen hanteert om chronische infectie te vestigen in muizen en lijkt voorkomende menselijke worminfecties. H. polygyrus is uitgebreid onderzocht op het gebied van helminthen afgeleide immuunregulatie en is gebleken krachtig onderdrukken experimentele modellen van allergie en auto-immuniteit (zowel actieve infectie en geïsoleerd uitgescheiden producten). De in dit document beschreven protocol schetst het beheer van de H. polygyrus levenscyclus voor een consistente productie van L3 larven, het herstel van de volwassen parasieten, en het verzamelen van hun excretie-secretoire producten (HES).

Vatbaarheid voor infecties met H. polygyrus wordt geregeld in hoge mate door de genetische achtergrond van de muizenstam (tabel 1); C57BL / 6 en CBA muizen zeer gevoelig 21,22. Voor onderhoud van de parasiet levenscyclus is de F1 hybride tussen deze twee stammen gekozen vanwege zijn vermogen om veel hogere worm lasten weerstaan ​​zonder morbiditeit (overmatige intestinale epitheliale schade) vergeleken met elk ouderstam. Orale gavage 400 L3 larven wordt gebruikt om de levenscyclus F1 muizen houden (om volwassen worm lasten getoond in figuur 2), terwijl een dosis van 200 L3 larven wordt algemeen gebruikt voor experimenten bij homozygote ingeteelde stammen (bijvoorbeeld C57BL / 6 of BALBc). Echter, kan het nodig zijn deze dosering te worden verlaagd, afhankelijk van het milieu co-factoren die kunnen verschillen tussen dierlijke faciliteiten, zoals variaties in de darmflora. Batches van HES hebben reproduceerbaar effi bewezenwerkzaamheid in functionele assays en in eiwitsamenstelling; Bovendien, wanneer supernatanten van elke volgende week kweek geanalyseerd, tot een totaal van 4 weken werden de eiwitprofielen gevonden vergelijkbaar te zijn (figuur 3). Wanneer HES concentratie wordt gemeten door Bradford assay (zie 5.5), de totale eiwit is meestal ongeveer 1 mg / ml (Figuur 4). Een alternatieve werkwijze voor het concentreren HES is een centrifugale concentrator (bijv Vivaspin 3-kDa cut-off membraan), waarin monsters worden gecentrifugeerd bij maximaal 4,000 g een swing-out rotor centrifuge verwijderen bufferzouten en laagmolecuulgewichtcomponenten. Centrifugale concentratie is het meest geschikt om kleine verwerken volumes (1-10 ml) en zijn beperkt tot een maximale concentratie factor van circa 30x. Bij het verzamelen van HES, het vermijden van contaminatie is van cruciaal belang. Om besmetting met gastheer moleculen voorkomen, HES-cont gooi weaining cultuur media uit de eerste 24 uur na de volwassen worm oogst van de muis darm. We het niveau van de LPS besmetting kwantificeren ook in elke partij van HES met een Chromogene LAL-test (zie 5.7). 1 U van LPS komt neer op ~ 100 pg LPS en niveaus onder deze zijn verwaarloosbaar 23 beschouwd. In onze handen meeste partijen HES aanzienlijk onder deze grens, de gemiddelde concentratie van LPS HES zijnde 0,23 U / mg (figuur 5). De effecten van LPS in in vivo modellen van pathologie (bijvoorbeeld de onderdrukking van astmatische reacties) vereist ten minste 10 ng LPS 23. Vandaar dat in vivo toediening van 5 ug HES uit een hoeveelheid van 100 pg LPS / ug HES omvatten 500 pg LPS, ruim onder de effectieve concentratie waarbij LPS een probleem. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figuur 1: Baermann Apparatus Baermann Apparatuur setup voor het verzamelen van volwassen H. polygyrus (zoals beschreven in paragraaf 2). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figuur 2: Gemiddelde Worm Burden 14 dagen na infectie met 400 L3 larven Mean worm lasten 14 dagen na infectie met 400 L3 larven. Datapunten zijn afkomstig uit 19 afzonderlijke rondes van infectie van C57BL / 6xCBA muizen. Gemiddelde ± SEM getoond. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figuur 3: Eiwit Profielen van HES Van Opeenvolgende Weken in Cultuur SDS-PAGE profiel van HES eiwitten in opeenvolgende weken van de cultuur verzameld. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figuur 4: </strong&gt; Definitieve Hoeveelheid HES van 500 ml ES-bevattende media Opbrengst van HES eiwit uit 11 verschillende batches afgeleid van ongeveer 500 ml kweeksupernatans. Gemiddelde ± SEM getoond. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figuur 5: LPS besmetting van HES Niveaus van LPS besmetting 41 batches van HES gemeten met de Limulus ameobocyte assay. Mediane LPS concentratie = 86 U per mg van HES. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figuur 6: Geanimeerde Schematische van H. polygyrus Life Cycle Samenvatting van de belangrijkste fasen in de levenscyclus van orale sondevoeding van L3 larven, door herstel van de larven en volwassen wormen tot isolatie van HES. Figuur 7: Animated Schematische van HES en haar functies Toets immunomodulerende effecten van oplosbare mediatoren en exosomen bevat binnen HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (en achtergrond stam) </td><td> Primaire Infectie Fenotype </td><td> Verwijzing </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inteeltstammen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H- </td><td> Zeer vatbaar </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 en C57BL / 10 </td><td> Vatbaar </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Tussen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Lage gevoeligheid </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene voor cytokinen en cytokine-receptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Vatbaarder </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Minder gevoelig (a); geen verandering in gevoeligheid maar verhoogde granulomen (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rp Transgene (C57BL / 6) </td><td> Bestendig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Hogere vruchtbaarheid </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 of BALB / c) </td><td> Zeer vatbaar </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c of C57BL / 6) </td><td> Zeer goed bestand </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgene(FVB) </td><td> Bestendig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiënt Th2, verminderde granuloom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Vatbaarder </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Geen verandering in gevoeligheid </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hoge Th1, verhoogde gevoeligheid </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene voor T-cel markers </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginaal hoger vruchtbaarheid </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Hogere vruchtbaarheid </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Hogere vruchtbaarheid &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgeen voor aangeboren immuunsysteem loci </td><td></td></tr><tr><td> Type 1 interferon receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Hogere vruchtbaarheid, meer granulomen </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Meer resistent, meer granulomen </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Vatbaarder </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Primaire infecties met H. polygyrus in genetisch verschillende en gen-Gerichte muis stammen.

Heligmosomoides polygyrus is een muizen nematode met krachtige immunomodulerende mogelijkheden die sterk lijken op die van zeer voorkomende menselijke worminfecties. Hier beschrijven we een protocol voor het onderhoud van de H. langdurige polygyrus levenscyclus.

Teelt van<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Het algemene doel van deze procedure is het verzamelen en analyseren van de moleculen die worden uitgescheiden door langlevende helminthenparasieten, die de immuunrespons van de gastheer downreguleren en zo het overleven van de parasieten mogelijk maken. Dit wordt bereikt door de parasieten eerst te kweken in hun natuurlijke habitat, het darmstelsel van muizen. De tweede stap bestaat uit het isoleren van de volwassen parasieten uit de muizen na euthanasie.Vervolgens worden de helminthenparasieten gekweekt in weefselkweekmedium gedurende drie weken, waarbij zij grote hoeveelheden excretie- en secretiemoleculen, oftewel ES-moleculen, afscheiden. De laatste stap is het terugwinnen en concentreren van de vrijgekomen moleculen uit de kweeksupernatanten in batches ES voor biologische en biochemische testen. Uiteindelijk kunnen de geconcentreerde supernatanten in vitro direct worden getest op specifieke celtypen om veranderingen in de functie van immuuncellen te bestuderen, of worden toegediend aan muizen om hun vermogen om allergieën en andere aandoeningen te onderdrukken te testen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we opmerkten dat immunosuppressie gekoppeld was aan een infectie met levende parasieten, wat wijst op een actieve en voortdurende afgifte van immunosuppressieve moleculen door levende parasieten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in parasitaire infecties, ontdekken we dat de moleculen die immuniteit onderdrukken waarschijnlijk zeer effectief zijn bij de behandeling van belangrijke ziekten in de westerse wereld, zoals allergieën, auto-immuniteit en inflammatoire darmziekten. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het terugwinnen en verwerken van helminthen-parasieten zeer gespecialiseerd zijn en bijzondere aandacht vereisen voor aseptische kweektechnieken.Acht weken oude F1-muizen worden via orale gavage geïnfecteerd met H polyus-larven voor de productie van de levenscyclus van H polyus. Bereid H polyus L3-larven voor in gedestilleerd water met een concentratie van 2000 per milliliter, zoals beschreven in het bijbehorende protocol. Dien vóór elke infectie 400 L3 per muis toe in 200 microliters.Homogeniseer de larvensuspensie door deze vijf keer te keren met een syringe van 1 milliliter met een speciale gavage-naald met een afgerond uiteinde; aspireer 200 µL van de larvensuspensie. Om de orale gavage uit te voeren, wordt de muis in een rechtopstaande positie vastgehouden bij de nekvel en wordt de stompe gavage-naald voorzichtig via de mond en de slokdarm in de maag gebracht. Volwassen wormen en parasitaire eieren zullen vervolgens uit de muis worden teruggewonnen.14 dagen na infectie, 14 dagen na infectie. Volwassen h polyus wormen worden verzameld uit de muizen met behulp van een gemodificeerd bayamon-apparaat, geprepareerd zoals hier wordt getoond. Was ter voorbereiding van deze procedure de buik van het geëuthanaseerde dier met 70% ethanol.Snijd de huid over de buik open en trek deze terug om de voorste buikwand bloot te leggen. Maak een midlijnincisie om de peritoneale holte te betreden. Verwijder de gehele dunne en dikke darm, van het proximale duodenum tot het distale rectum.Plaats het in een droge petrischaal. Strek de darm over de gehele lengte uit en snijd het deel van het colon dat feces bevat weg; plaats dit in een aparte schaal om later eieren te kunnen terugwinnen. Identificeer vervolgens de proximale 20 centimeters van de dunne darm waarin de volwassen wormen zich bevinden.Het wordt gekenmerkt door de relatief dikke wand van het duodenum en heeft vaak een rode kleur door de intraluminale wormen. Exciteer dit deel van de dunne darm en plaats het in een petrischaal met 5 mL Hank's oplossing. Verwarm tot 37 °C met behulp van een rondkop-schaar.Open het met wormen gevulde proximale darmgedeelte in de lengterichting en schraap de binnenkant van de darmwand schoon met twee glazen objectglaasjes. Verwijder de wormen door de schone darmwand weg te gooien. Vul de trechter met Hank's oplossing.Niet een klein muslin zakje dicht en giet de wormen uit twee Petrischalen hierin. Bevestig twee muslin zakjes aan elk glazen trechter en zet de zakjes met paperclips vast rond de rand van de trechter. Plaats de opstelling gedurende één tot twee uur in een incubator van 37 degrees Celsius.Halverwege de incubatie wordt de apparatus voorzichtig geschud om debris uit het darmpreparaat los te maken dat het mousselinefilter zou kunnen verstoppen. Let erop dat er geen debris buiten de mousselinezak terechtkomt, aangezien dit zal leiden tot contaminatie bij de uiteindelijke HES-bereiding. Aan het einde van de incubatie wordt de opvangbuis voorzichtig met een plastic pipet boven een gootsteen losgekoppeld van de verbindende rubberen slang; breng de wormen vervolgens over in een buis van 50 milliliter en laat de wormen door zwaartekracht bezinken.Verwijder het medium met een stripette. Voeg 40 milliliters Hank's-oplossing toe en laat de wormen bezinken. Herhaal dit vijf keer voor een totaal van zes wasbeurten. Het voorkomen van contaminatie van de haze-cultuur is cruciaal voor het succes van dit protocol.De wormcultuur moet vanaf dit punt steriel worden gehouden. Verplaats de cultuur naar een laminaire flowkast en was de wormcultuur nogmaals zes keer in steriele Hank's-oplossing, aangevuld met antibiotica, met behulp van een pipet; neem twee monsters van 20 µL af om het aantal teruggewonnen volwassen wormen te tellen. Er wordt verwacht dat ongeveer 50% van de hoeveelheid geïnoculeerde larven op dag 14 van de infectie eieren verzamelt, waarna met een pincet feces uit de eerder weggesneden colon wordt geschraapt.Meng vervolgens de feces met korrelkool bij een verhouding van ten minste één op één. Streef naar een consistentie die net voldoende is om aan het papier te hechten. Smeer een dunne laag op het midden van een stuk bevochtigd filterpapier in een Petrischaal en plaats dit in een vochtige, lichtdichte doos om het gedurende 12 tot 14 dagen donker te houden.Vanaf dag zeven begint u met het verzamelen van L3-larven. Vorm een ring rond de rand van het filterpapier. Til het filterpapier uit de Petrischaal en gebruik een pipet met 5 mL steriel water per plaat om de resterende larven van de plaat te spoelen.Breng de larven over naar een buis van 50 milliliter. Plaats het filterpapier terug in de schaal en zet deze terug in het donker; herhaal de collectie van larven wekelijks gedurende maximaal één maand. De verzamelde larven worden vervolgens gewassen zoals beschreven in de protocoltekst en bewaard bij vier graden Celsius in gedestilleerd water.Om deze procedure te starten, week de wormen gedurende 20 minuten in ongeveer 10 milliliter Hank's balanced salt solution, aangevuld met 10% gentamicin, waarbij de buis schuin wordt geplaatst om te garanderen dat de wormen na 20 minuten volledig bedekt zijn. Was de wormen zes keer met Hank's balanced salt solution, aangevuld met antibiotica, en breng de wormen over in geventileerde T25-kolfjes. Plaats de kolfjes rechtop in een incubator op 37 °C gedurende drie weken voor de preparatie van excretie-secretieproducten (ESP) van de wormen.HES-bevattende cultuur. Het medium wordt met intervallen van maximaal tweemaal per week verzameld uit de culturen en bij elke gelegenheid vervangen door een gelijk volume h polyus Media. Houd elke collectie apart en duidelijk gelabeld met de datum en het batchnummer vanwege het grotere potentieel voor contaminatie met LPS en gastheerproteïnen.De eerste collectie na 24 uur kweek dient apart te worden gezet en ofwel afzonderlijk te worden verwerkt of weggegooid te worden; centrifugeer het HES-bevattende medium bij 400 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer vervolgens het medium met een spuit van 50 milliliter en filter dit door een 0,2 micron filter met lage eiwitbinding in buizen van 50 milliliter. Daarna wordt het gepoolde HES-supernatans geconcentreerd over een filter met een molecular weight cutoff van 3000 in een ultrafiltratieapparaat onder stikstofdruk; om het filterapparaat voor te bereiden, wordt het 3 kilo Dalton membraan met de glanzende zijde naar beneden gewassen in een bekerglas van één liter met gedestilleerd water onder roering.Assembleer het ultrafiltratieapparaat volgens de instructies van de fabrikant met de filtermembraan met de glanzende zijde naar boven, plaats dit in een koelkast van 4 °C en laat 50 milliliters gedestilleerd water doorstromen voordat u begint met het concentreren van de gegoten HES. Let er goed op dat het filter niet droog komt te staan. Voeg elke buis HES toe aan het filtratieapparaat zoals vereist, totdat het volume is geconcentreerd tot 2 tot 5 milliliters om aminozuren en andere componenten van het weefselkweekmedium te verwijderen.Voeg aan de HES-preparatie 50 milliliter pyrovrij PBS toe in het filtratieapparaat en concentreer dit vervolgens tot ongeveer twee milliliter. Herhaal deze stap twee keer. Gebruik in totaal 150 milliliter PBS om de ES over te brengen naar een spuit en steriliseer deze door filtratie met een 0,2 micron filter.Label na het meten van de proteïneconcentratie de aliquot met het batchnummer en de datum en vries deze in bij -80 °C. Orale gavage van 400 L drie larven wordt gebruikt om de levenscyclus van H poly gyus in F1-muizen te handhaven. De resulterende wormlast bij volwassenen wordt hier getoond.Batches van HES hebben een reproduceerbare effectiviteit aangetoond in functionele assays en in eiwitsamenstelling. Bovendien bleken de eiwitprofielen zeer vergelijkbaar gedurende een totale periode van vier weken, wanneer de supernatanten van elke opeenvolgende cultuurweek werden geanalyseerd. Wanneer een TS-concentratie wordt gemeten met de Bradford-assay, bedraagt het totale eiwitgehalte gewoonlijk ongeveer 1 mg/mL.De opbrengst van HES-eiwit uit 11 verschillende batches, afgeleid van ongeveer 500 milliliter cultuursupernatant, wordt weergegeven. Het vermijden van contaminatie is cruciaal bij het verzamelen van HES, waarbij de niveaus van LPS-contaminatie in 41 batches HES werden gemeten met de limbus AAMI CYTE-assay. De meeste batches HES bleken significant onder de aanbevolen contaminatiedrempel te liggen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een zorgvuldige steriele techniek moet worden gehanteerd bij het opzetten van de culturen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd volgens deze procedure. Andere methoden, zoals proteomica, eiwitfractionering en analyse van glycanen, lipiden en microRNA's, kunnen worden uitgevoerd om het spectrum van moleculaire producten die door deze parasieten worden afgegeven, volledig te begrijpen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u poly limus kunt voortplanten. Moid is polyus en verzamel DS-producten van de gekweekte volwassen wormen om hun effecten op het immuunsysteem te testen. Hoewel deze parasiet niet schadelijk is voor mensen, is het belangrijk om de veiligheidsvoorschriften te volgen en het gespecificeerde protocol na te leven om de reproduceerbaarheid tussen batches van Hess te waarborgen.

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Het doel van deze presentatie is in vivo en in vitro technieken voor het opfokken van entomopathogene nematoden aan te tonen. In vivo methoden beschouwen het fokken van deze nematoden met een insect host, terwijl de in-vitro-methoden maken gebruik van rich media-agar.

In vivo en in vitro kweken van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae en Heterorhabditidea)

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Strongyloides ratti is een parasitaire nematode die voorbijgaande infecties veroorzaakt bij laboratoriummuizen, die weefselmigrerende en darmlevensstadia vertonen. Hier presenteren we een protocol voor het in stand houden van de parasietcyclus bij ratten en experimentele infectie van muizen, inclusief kwantificering van parasieten in het hoofd, de longen en de darmen.

Experimentele infectie van muizen met de parasitaire nematode Strongyloides ratti

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

We presenteren twee methoden voor boeren om entomopathogene nematoden massaal te vermeerderen als bio-insecticiden. De eerste methode gebruikt polyacrylamidegel als nematode-kweeksubstraat, terwijl de tweede polymeer-gecoate katoenwol als kweeksubstraat gebruikt. Beide methoden zijn gebaseerd op de in vivo voortplanting van nematoden binnen insectenkadavers.

Teler-gebaseerde in vivo voortplanting van entomopathogene nematoden

Leer de teelt van Heligmosomoides polygyrus en de isolatie van immunomodulerende uitgescheiden moleculen uit weefselkweek. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van immuunsuppressie en potentiële therapieën voor allergieën.

Teelt van

Meer video's verkennen