Name: Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer hoe u cel-substraat impedantie en live cell imaging gebruikt om real-time veranderingen in endotheelceladhesie te meten na matrixmodificatie met myelo peroxidase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door een National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) en, gedeeltelijk, door een UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Algemene endotheelcellen Culture <ol><li> Cultuur runder aorta endotheelcellen (passages 4-9) op gelatine gecoate weefselkweek kolven (laag weefselkweek oppervlak met 0,1% w / v gelatine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min) in EGM-2 medium (met EGM-2 bullet kit met 5% foetaal runderserum, groeifactoren en alle supplementen van de fabrikant, behalve hydrocortison). </li><li> Wanneer cellen bijna samenvloeiende (ca. 3 dagen na enten na een 1: 4 frames), oogsten cellen door behandeling met 0,05% w / v trypsine / 0,02% w / v EDTA in PBS bij 37 ° C. Na de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt, voeg volledige EGM-2-media om de trypsine en vervolgens centrifuge (100 xg, 5 min) te lessen. </li><li> Bereid cellen voor studies van de de novo adhesie van endotheliale cellen aan fibronectine (Experiment 1: Deel 2) en daarmee de adhesie van endotheelcellen met gevestigde hechting op het substraat (Experiment 2: Hoofdstuk 3). <ol><li> Was geoogstcellen eenmaal met serumvrij medium 199 dat 1% w / v runderserumalbumine (BSA) en opnieuw gecentrifugeerd (100 xg, 5 min). </li><li> Resuspendeer cellen in serumvrij medium 199 dat 1% m / v BSA in 2,5 x 10 5 cellen / ml (cel-substraat impedantiemetingen) of 5 x 10 5 cellen / ml (live cell imaging analyse) en 37 handhaven ° C vóór gebruik. OPMERKING: De hechting responsen van cellen zijn zeer gevoelig voor temperatuurverschillen (bijvoorbeeld door convectie effect), zodat alle apparatuur en oplossingen die te hanteren en behandelen cellen tijdens de volgende protocollen bij een constante temperatuur van 37 ° C worden bewaard. </li></ol></li></ol> 2. Experiment 1: Het kwantificeren De Novo endotheelcellen Hechting op inheemse en MPO-geoxideerde fibronectine (Cell-substraat Impedantie) OPMERKING: Experiment 1 onderzoekt de mate waarin MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine schaadt het vermogen ondersteunen de novo </em&gt; Hechting van zwevende endotheelcellen. <ol><li> Jas fibronectine op 96-well goud cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays. Voeg 80 ul / putje van gezuiverd bovine fibronectine bij 5 ug / ml in PBS, incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en verwijdert de oplossing. </li><li> Incubeer met fibronectine gecoate oppervlakken MPO tot het binden van MPO aan het oppervlak gebonden fibronectine. Voeg 80 ul / putje van gezuiverd humaan neutrofiel MPO bij 20 nM in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en incubeer gedurende 0,5 uur bij 37 ° C. </li><li> Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS om eventuele ongebonden MPO verwijderen. </li><li> Voeg H 2 O 2 (0-10 uM eindconcentratie) aan putjes van de micro-elektrode matrix plaat met 80 ul / putje HBSS tot inleiding MPO-gekatalyseerde HOCl-afhankelijke fibronectine oxidatie en incubeer gedurende nog 0,5 uur bij 37 ° C. </li><li> Om het effect van relevante remmers of modulators van MPO-gekatalyseerde reacties (bijvoorbeeld alternatieve MPO enzym onderzochtsubstraten, remmers of antioxidantia; Zie 9 voor details), moeten deze aan de HBSS onmiddellijk voor H 2 O 2 optelling. </li><li> Na 0,5 uur, te behandelen oppervlakken met methionine om de resterende oppervlakte-gebonden oxiderende soorten lessen, dat wil zeggen, reactief eiwit-gebonden chloramines, die verstorende cellulaire activiteiten kunnen uitoefenen. Voeg 10 mM methionine in 80 ul HBSS per putje en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Blok oppervlakken met BSA. Voeg 80 ul / putje BSA 0,2% w / v in PBS, incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en verwijdert de oplossing. OPMERKING: Residuele ongestreken oppervlaktegebieden zullen celadhesie ondersteunen verhinderde deze met een niet-klevende eiwit (dwz BSA) waarborgt dat cellulaire adhesie reacties strikt afhankelijk van het gezuiverde cel-klevende matrix toegepast, in dit geval fibronectine. </li><li> Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS. NB: Geen van de voorgaande oppervlaktebehandelingen aanmerkelijk beïnvloedt cel-substraat readings. </li><li> Zaad gesuspendeerde endotheelcellen (voeg 200 ul / putje bij ongeveer 2,5 x 10 5 cellen / ml, bereid in serumvrij medium 199 dat 1% BSA, zie 1.3) op het natieve of MPO-geoxideerde fibronectine gecoate oppervlakken. </li><li> Onmiddellijk na het zaaien cellen (dwz vóór iedere celhechting en spreiding), zet de micro-elektrode reeks voorwerpen tegen de incubator poort (ondergebracht in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2). <ol><li> De instrumentsoftware onmiddellijk een &quot;lege&quot; lezing normaliseren volgende cel-substraat impedantie (&quot;cell index&quot;) waarden van de oorspronkelijke achtergrondwaarden verkregen in afwezigheid van intercellulaire adhesie. </li><li> Initiëren verwerving continue cel indexgegevens (minimaal één cel indexcijfer / min). </li></ol></li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur, een periode waarin maximale celhechting en spreiding wordt bereikt; Dit wordt weerspiegeld dooreen plateauing van de cel-index waarden (zie figuur 3A). OPMERKING: De voorgaande experiment (experiment 1) onderzoekt hoe de initiële MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine beperkt de mogelijkheid van endotheelcellen naar cel adhesie te vestigen op deze ondergrond. Het volgende experiment (experiment 2) onderzoekt hoe MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bevordert de afname in cel-matrix adhesie (dat wil zeggen, de-adhesie) in endotheelcellen met gevestigde hechting op dit substraat. De behandelingen in deze twee experimenten zijn in wezen identiek, behalve de timing van MPO-gemedieerde oxidatie fibronectine (dwz voor celadhesie - Experiment 1; na celadhesie - Experiment 2). </li></ol> 3. Experiment 2: Het kwantificeren van endotheelcellen De-hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde Fibronectine Oxidatie (Cell-substraat Impedantie en live cell imaging) <ol><li> Jas fibronectine op 96-well gouden micro-elektrode eenrrays voor cel-substraat impedantiemetingen (voeg 80 ul / putje van fibronectine bij 5 ug / ml in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C) of 35 mm glazen bodem celcultuurschalen voor live cell imaging analyses (2 ml / schaal van fibronectine bij 5 ug / ml in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C). </li><li> Blok oppervlakken met BSA. Voeg BSA 0,2% w / v in PBS bij de in 3.1 volumes en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Incubeer oppervlakken MPO om de binding van MPO fibronectine. Voeg 20 nM gezuiverd humaan MPO in HBSS bij de in 3.1 volumes en incubeer gedurende 0,5 uur bij 37 ° C. </li><li> Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS om eventuele ongebonden MPO verwijderen. </li><li> Zaad gesuspendeerde endotheelcellen (bereid in serumvrij medium 199 dat 1% m / v BSA, zie 1.3) op het natieve of MPO-dragende fibronectine gecoate oppervlakken. <ol><li> Voeg 200 ul / putje van 2,5 x 10 5 cellen / ml tot 96 en cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays. </li> &lt;li&gt; Voeg 2 ml / schotel bij 5 x 10 5 cellen / ml tot 35 mm glazen bodem celkweek gerechten. </li></ol></li><li> Onmiddellijk na het zaaien cellen (dwz vóór iedere celhechting en spreiding): <ol><li> Mount 96 putjes micro-elektrode-array platen op de cel-substraat impedantie incubator poort (ondergebracht in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2) en neem &#39;blanco&#39; afgelezen waarden voortdurend eigen cel indexgegevens (zie paragraaf 2.10 initiëren ). </li><li> Overdracht 35 mm glazen bodem celcultuurschalen een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2. </li></ol></li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur tot maximale celhechting en spreiding (zie paragraaf 2.11) toe. </li><li> Kort verwijder de 96 goed micro-elektrode-array plaat (pauze cel index metingen op dit punt) of 35 mm glazen bodem celkweek gerecht uit de 37 ° C incubator, verwijder celsupernatant en voeg verwarmde (37 ° C) HBSS (volumes als pre stap 3.1). OPMERKING: HBSS in dienst is bij het bestuderen van MPO-gekatalyseerde oxidatieve reacties in plaats van complete cultuur media als de laatste bevat oxideerbare soorten die interfereren met de oxidatiereacties. </li><li> Om het effect van remmers onderzocht / modulatoren van MPO-gekatalyseerde reacties (alternatieve enzym substraten, remmers of antioxidantia) of signaaltransductie remmers (bijvoorbeeld 40 uM blebbistatin te actomyosine contractiliteit remmen), voeg deze nu. </li><li> Plaats onmiddellijk de micro-elektrode-array plaat terug in de 37 ° C incubator poort (opnieuw te beginnen cel index metingen op dit punt) of de 35 mm glazen bodem celkweekschaaltje terug in de 37 ° C incubator, en laat de cellen in evenwicht in de HBSS 0,5 uur. OPMERKING: Na 0,5 uur verevening in HBSS, cel-index waarden stabiliseren op iets lagere waarden; wanneer vooraf incuberen van cellen met enzymsubstraten, enzym en celsignalerende remmers of antioxidantia, vergewissen teze niet wezenlijk aantasten verkregen bij evenwicht waarden. </li><li> Initiëren MPO-gekatalyseerde, HOCl-afhankelijke fibronectine oxidatie en de-hechting. <ol><li> Voor celimpedantie studies met 96 goed micro-elektrode-array platen: <ol><li> Verwijder de micro-elektrode-array plaat uit de incubator en pauze cel index metingen. </li><li> Voeg H 2 O 2 (eindconcentratie van 0-10 uM) aan de HBSS en meng door herhaald pipetteren. </li><li> Onmiddellijk, opnieuw monteren van de micro-elektrode-array terug op de 37 ° C incubator-poort en opnieuw te beginnen de overname van de mobiele index lezingen. </li></ol></li><li> Voor live cell imaging studies met behulp van 35 mm glazen bodem celkweekschaaltje: <ol><li> Verwijder de cultuur schotel uit de incubator en monteren op een 37 ° C verwarmd fase van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 63x water objectief met geschikte DIC optiek voor het opnemen van live cell films. </li><li> Focus op cellen enoptimaliseren DIC optiek (Köhler verlichting, bias retardatie en camera Offset / gain, voor meer informatie, zie 13). </li><li> Initiëren DIC film en registreren basislijn metingen van onbehandelde cellen gedurende 1 min. </li><li> Voeg H 2 O 2 (uiteindelijke concentratie van 0-10 uM) en meng voorzichtig door herhaalde pipetteren. Opnieuw richten van de microscoop (indien nodig) en voortgezet wordt DIC films van de behandelde cellen voor de vereiste tijd. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Data-analyse en presentatie <ol><li> Cel-substraat impedantiedata <ol><li> Export ruwe data (cel index versus tijd) in een spreadsheet. </li><li> Voor cel de-adhesie studies (Experiment 2: Hoofdstuk 3), normaliseren van gegevens door het instellen van waarden die direct voorafgaand aan de inleiding van MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bij een waarde van 1 (ie, onmiddellijk vóór de toevoeging van H 2 O 2 in 3.11 .1.1). LET OP: Dit zorgt ervoor dat de relatieveveranderingen in cel index waarden uitgelokt door MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie worden niet gemaskeerd door kleine initiële verschillen in absolute cel indexwaarden tussen putten. <ol><li> Bestaande gegevens plots van genormaliseerde cel index (y-as) versus tijd (x-as). </li></ol></li></ol></li><li> Live cell imaging data (cel de-adhesie studies in Experiment 2: deel 3) <ol><li> Open DIC live cell imaging films opgenomen direct voorafgaand aan en na de opening van de MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie in een standaard beeldanalyse-programma (bijvoorbeeld ImageJ software). </li><li> In ten minste twee afzonderlijke DIC films selecteren willekeurig meerdere cellen en meten hun geprojecteerde oppervlak in opeenvolgende frames (bijvoorbeeld 1 min interval) handmatig traceren van baanrand en kwantificering van het aantal ingesloten pixels. </li><li> Export ruwe data (geprojecteerde celgebied versus tijd) naar een Excel spreadsheet en normaliseren celgebied gegevens door het instellen van waarden die direct voorafgaand aande inleiding van MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bij een waarde van 1 (dat wil zeggen onmiddellijk vóór de toevoeging van H 2 O 2 in 3.11.2.3). </li><li> Aanwezig gegevens als een grafiek van genormaliseerde celoppervlak (y-as) versus tijd (x-as). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li>
<li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li>
<li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li>
<li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+%28RT-CES%29+technology+to+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li>
<li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li>
<li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li>
<li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen te maken.

Cel-matrix adhesie en de-adhesieprocessen nauwkeurig kan worden gekwantificeerd in real time met een hoge temporele resolutie met behulp van cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze real-time benaderingen bieden een groot voordeel ten opzichte van end-point analyses van cel adhesie, die arme temporele resolutie bieden. Door het nauwkeurig kwantificeren snelle de-hechting reacties met een hoge temporele resolutie, kunnen deze analyses kritisch inzicht in verschaffen hoe morfologische reacties op matri...

Stabiele lijm contacten tussen cellen en de omringende extracellulaire matrix vereist onderhoud weefsel homeostase. Bijvoorbeeld endotheelcel adhesie aan de subendotheliale matrix bloedvaten speelt een cruciale rol bij het ​​handhaven van de integriteit van de endotheliale laag en de homeostatische functie als regulerende, halfdoorlaatbare barrière vasculaire 1. Het actine cytoskelet is mechanisch gekoppeld met matrix moleculen op plaatsen van cel-matrix adhesie en hechtende contacten op de cel-matrix-interface lijm spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de positie van het celmembraan door weerstand centraal gerichte actomyosine trekkrachten. Extracellulaire stimuli die cel-matrix adhesie veranderen nood- evenwicht van krachten de cel-matrix-interface, een gebeurtenis die snel veranderen &quot;gevoeld&quot; door mechanisch-gevoelige signaaleiwitten, waardoor de transductie van &quot;outside-in signalering&quot;. Deze cross-talk betsen cellen en de omringende extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol in de controle celvorm, beweeglijkheid, functionaliteit, proliferatie en overleving 2. Diverse pathofysiologische processen (embryonale ontwikkeling, ontsteking, wondheling en kanker metastase) worden gekenmerkt door dynamische remodelleringvan klevende matrix substraten matrix- afbrekende oxidanten en / of enzymen 3,4. Bijvoorbeeld, zelfklevend subendotheliale matrixeiwitten bloedvaten (bijvoorbeeld fibronectine) zijn geïmpliceerd als belangrijke doelwitten voor modificatie of afbraak in het inflammatoire ziekten als gevolg van de lokale productie van reactieve oxidanten (bijvoorbeeld, hypochloorzuur, HOCl) van de leukocyt afgeleide enzym myeloperoxidase (MPO), die in inflammatoire vaatziekten (figuur 1) 5-9 accumuleert in het subendotheel. Veranderingen in cel-matrix adhesie geïnduceerd door MPO-afgeleide oxidanten en andere matrix modificerende stimuli likEly belangrijke rol spelen bij veranderende vasculaire homeostase bij verschillende pathologische processen, bijvoorbeeld door verandering van endotheelcellen signalering, morfologie en levensvatbaarheid, waardoor verstoort endotheelfunctie en integriteit. Echter, de morfologische en celsignalen reacties van hechtende cellen aan de extracellulaire matrix wijzigingen alleen begint te worden begrepen. Om te begrijpen hoe matrix wijzigingen rijden veranderingen in cel adhesie dynamiek en adhesie-afhankelijke cel signaalwegen, zijn technieken die nodig zijn dat veranderingen in de cel-matrix adhesie in real time nauwkeurig te kwantificeren, met een hoge temporele resolutie. We beschrijven hier complementair cel-substraat impedantie en live cell imaging technieken die aan deze criteria voldoen en een platform celadhesie en de adhesie processen kwantificeren op niet-invasieve wijze. We laten zien hoe deze cel-substraat impedantie en live cell imaging voorkomendpijn kan gemakkelijk worden toegepast om (i) controleren de dynamiek van celhechting en spreiding (dwz de novo celadhesie) op natieve en gemodificeerde matrix substraten en (ii) de dynamica van cel-matrix onthechting meten (dwz de wrijvingscoëfficiënt ) van hechtende cellen blootgesteld aan matrix modificerende stimuli. De xCELLigence cel-substraat impedantie biosensor systeem zorgt voor een continue meting van de oppervlakte van de cel-matrix contact door het kwantificeren van elektrische impedantie aan het oppervlak van 96-wells gouden micro-elektrode arrays en spreekt deze elektrische impedantie metingen als &#39;cell-index&#39;, een dimensieloze waarde die is grotendeels evenredig met het oppervlak van cel-substraat contact 10 (figuur 2), terwijl ook gevoelig voor veranderingen in de gemiddelde afstand tussen de (isolerende) celmembraan en het elektrodeoppervlak 11. Een verdere toename van de cel-index waarden wordt ook bereikt bij de oprichting van strakke cel-cel contacten that beperken paracellulair stroom, 11 omstandigheden die niet binnen de in deze studie beschreven experimenten doen prevaleren. Meting van het geprojecteerde gebied van individuele cellen in de tijd door beeldanalyse van time-lapse differentieel interferentie contrast (DIC) films biedt een aanvullende maatregel van veranderingen op het gebied van cel-substraat contact en geeft aanvullende informatie over de precieze aard en dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door de cel-substraat impedantie benadering. Met name de toepassing van deze benaderingen volgen hoe MPO-gemedieerde oxidatie kleefmiddel subendotheliale matrix proteïnen (bijvoorbeeld fibronectine) (i) vermindert het de novo hechting van zwevende endotheelcellen op gezuiverde fibronectine en (ii) activeert cel-matrix de We beschrijven -adhesion in endotheelcellen vastgelegde hechting aan fibronectine. Door het uitvoeren van parallelle celsignalering analyseert de tijd met behulp van relevante biochemical assays (bijvoorbeeld Western blotting), de temporele en causale verbanden tussen adhesie / de-adhesie processen en bijbehorende veranderingen in adhesie-afhankelijke signaaltransductie gebeurtenissen kunnen worden bepaald. Deze benaderingen zijn onlangs gebruikt om aan te tonen dat extracellulaire matrix oxidatie gekatalyseerd door subendotheliale afzettingen van MPO veroorzaakt een snelle verlies in cel-matrix adhesie van endotheelcellen die wordt aangedreven door bestaande actomyosine contractiele krachten 9. Belangrijk doordat de tijdsrelatie tussen veranderingen in zowel celadhesie en adhesie-afhankelijke signaaltransductie te bepalen deze benaderingen vastgesteld MPO geïnduceerde matrixmodificatie en de cellulaire adhesie triggers wijziging van belangrijke adhesie-afhankelijke signaaltransductie wegen waaronder Src kinase paxillin afhankelijke fosforylering en myosine lichte keten II fosforylering (figuur 1) 9. Deze wijze van redox-afhankelijke signalering, invOlving de activatie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen extracellulair oxidatieve reacties die cel-matrix adhesie te verstoren, is een nieuwe werkwijze celsignalen genoemd &quot;outside-in redox signalling&quot; (figuur 1) 9. In het algemeen moeten deze complementaire cel-substraat impedantie biosensor en live cell imaging aanpak waardevol in onthullen hoe verschillende matrix modificerende stimuli of agenten rijden veranderingen in celadhesie dynamiek, morfologie en signalering binnen verschillende hechtende celtypen onder uiteenlopende experimentele instellingen. Het volgende protocol beschrijft hoe u de impact van MPO-gemedieerde matrix oxidatie op de novo endotheliale cel adhesie (Experiment 1) en endotheelcellen de-adhesie (Experiment 2) processen te kwantificeren. MPO bindt gretig aan fibronectine en andere lijm subendotheliale extracellulaire matrix eiwitten en onses waterstofperoxide (H 2 O 2) in chloride-ionen (Cl -) omzetten in de zeer reactieve chloreringsmiddel oxidatiemiddel hypochloorzuur (HOCl), die plaatselijk tast deze matrixeiwitten en verstoort de cel hechting (figuur 1) 8,9, 12.

<table><tbody><tr><td>96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>eenmalig te gebruiken plaat voor het uitvoeren van cel-gebaseerde tests op het xCELLigence systeem</td></tr><tr><td>blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>selectieve remmer van non-muscle myosin-II</td></tr><tr><td>Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>endotheel cel groei media kit</td></tr><tr><td>Fibronectin, lyophilized powder</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>van bovien plasma</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Cel cultuur schaal met optisch kwaliteit glazen bodem voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>celcultuur substraat</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>serum-vrij cel media</td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>blusst chlorinerende oxidanten gegenereerd door myeloperoxidase</td></tr><tr><td>Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td><td>Millipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>Bestaat uit RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station en RTCA Control Unit</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van cell-substraat impedantie en live cell imaging naar real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en de-adhesie geïnduceerd door matrix wijziging meet

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cel-matrix adhesie speelt een belangrijke rol in de controle celmorfologie en signalering. Stimuli die cel-matrix adhesie (bijvoorbeeld myeloperoxidase en andere matrix modificerende oxidanten / enzymen vrijkomen bij ontsteking) verstoren zijn betrokken bij het ​​ontstaan ​​van pathologische veranderingen in cellulaire functie fenotype en levensvatbaarheid in een aantal ziekten. Hier beschrijven we hoe cel-substraat impedantie en live cell imaging aanpak gemakkelijk kan worden gebruikt om nauwkeurig kwantificeren real-time veranderingen in celadhesie en de adhesie geïnduceerd door matrixmodificatie (met endotheelcellen en myeloperoxidase als pathofysiologische matrix modificerende stimulus) met hoge tijdsresolutie en op niet-invasieve wijze. De xCELLigence cel-substraat impedantie systeem kwantificeert continu het gebied van cel-matrix adhesie door meting van de elektrische impedantie in de mobiele substraatgrensvlak in cellen gekweekt op goud micro-elektrode arrays. Beeldanalyse van time-lapse differentiële interferentie contrast films kwantificeert veranderingen in het geprojecteerde gebied van afzonderlijke cellen in de tijd, die veranderingen in het gebied van cel-matrix contact. Beide technieken nauwkeurig te kwantificeren snelle veranderingen om cellulaire hechting en de-adhesieprocessen. Cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays biosensor verschaft een platform voor robuuste, high-throughput metingen. Live cell imaging analyseert zorgen voor extra details met betrekking tot de aard en de dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door cel-substraat impedantie metingen. Deze aanvullende benaderingen leveren waardevolle nieuwe inzichten in hoe-myeloperoxidase- gekatalyseerde oxidatie van subcellulaire extracellulaire matrix componenten triggers snelle veranderingen in de cel adhesie, morfologie en signalering in endotheelcellen. Deze benaderingen zijn ook voor het bestuderen van cellulaire adhesie dynamiek in reactie op andere matrix modificerende stimuli en aanverwante hechtende cellen (bijvoorbeeld epitheelcellen).

Real-time kwantificering van endotheelcellen de-hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie (Experiment 2). Het zaaien van endotheelcellen suspensies op inheemse (MPO gratis) fibronectine of MPO-dragende fibronectine resulteert in maximale celhechting en spreiding binnen 2 uur, zoals beoordeeld door een plateauing cel indexwaarden in de cel substraat impedantiemetingen (Figuur 3A). Deze eerste fase van celhechting en spreiding wordt aanzienlijk verminde...

Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in real-time snelle veranderingen in de celmatrix-adhesie in endotheelcellen te kwantificeren die zijn blootgesteld aan matrix-modificerende agentia, gebruikmakend van cel-substraatimpedantie en live-cell imaging. In dit experiment wordt het heemenzym myeloperoxidase gebruikt als een pathofysiologisch relevant matrix-modificerend agens. Dit wordt bereikt door oppervlakken eerst te coaten met fibronectine om een adhesief matrixsubstraat te verkrijgen.Myeloperoxidase of MPO krijgt vervolgens de gelegenheid om aan het fibronectine te binden. Daarna worden gesuspendeerde endotheelcellen op de oppervlakken geplaatst en geïncubeerd om maximale celhechting en spreiding op het fibronectine te bereiken. Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan waterstofperoxide om de MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine te initiëren.De daaropvolgende snelle veranderingen in de adhesie tussen cel en matrix worden vervolgens in real time gekwantificeerd met behulp van cel-substraatimpedantie en live-cell imaging-analyse. De resultaten tonen aan dat snelle verliezen in de adhesie van endotheelcellen aan de matrix, getriggerd door NPO-gemedieerde oxid

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Leer hoe u cel-substraat impedantie en live cell imaging gebruikt om real-time veranderingen in endotheelceladhesie te meten na matrixmodificatie met myelo peroxidase.

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet (Video) | JoVE Journal

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Meer video's verkennen