Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Het algemene doel van het volgende experiment is om in real-time snelle veranderingen in de celmatrix-adhesie in endotheelcellen te kwantificeren die zijn blootgesteld aan matrix-modificerende agentia, gebruikmakend van cel-substraatimpedantie en live-cell imaging. In dit experiment wordt het heemenzym myeloperoxidase gebruikt als een pathofysiologisch relevant matrix-modificerend agens. Dit wordt bereikt door oppervlakken eerst te coaten met fibronectine om een adhesief matrixsubstraat te verkrijgen.

Myeloperoxidase of MPO krijgt vervolgens de gelegenheid om aan het fibronectine te binden. Daarna worden gesuspendeerde endotheelcellen op de oppervlakken geplaatst en geïncubeerd om maximale celhechting en spreiding op het fibronectine te bereiken. Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan waterstofperoxide om de MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine te initiëren.

De daaropvolgende snelle veranderingen in de adhesie tussen cel en matrix worden vervolgens in real time gekwantificeerd met behulp van cel-substraatimpedantie en live-cell imaging-analyse. De resultaten tonen aan dat snelle verliezen in de adhesie van endotheelcellen aan de matrix, getriggerd door NPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine, in real time met een hoge temporele resolutie en op labelvrije wijze kunnen worden gekwantificeerd via cel-substraatimpedantie en live-cell imaging. Het voordeel van deze technieken is dat zij veranderingen in de cel-matrixadhesie continu en met een hoge temporele resolutie kunnen kwantificeren, wat betekent dat zij belangrijke nieuwe inzichten kunnen verschaffen in hoe matrixmodificaties downstream veranderingen in celmorfologie en adhesie-afhankelijke signaleringsprocessen aansturen.

De protocollen zijn van bredere betekenis aangezien ze gemakkelijk kunnen worden aangepast door MPO te vervangen door andere matrix-modificerende agentia, zoals matrix-metalloproteïnasen of proteasen, of door het gebruik van andere adherente celtypen dan endotheelcellen, zoals epitheelcellen. Voeg voor het begin 80 µL fibronectine per put toe om 96-well gouden micro-elektrodearrays te coaten voor cel-substraatimpedantiemetingen, of voeg twee milliliter fibronectine toe aan glazen celkweekschalen voor live-cell imaging-analyse. Incubeer de arrays en/of de kweekschalen gedurende twee uur bij 37 °C.

Voeg vervolgens 0,2% BSA toe om de oppervlakken te blokkeren en incubeer dit gedurende nog eens twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg daarna gezuiverd humaan myeloperoxidase in HBSS toe en incubeer gedurende 30 minuten. Was de oppervlakken vervolgens twee keer met HBSS om al ongebonden MPO te verwijderen.

Zaai vervolgens 250.000 cellen per milliliter gesuspendeerde endotheliale cellen, geprepareerd volgens het tekstprotocol, uit op 96-well cell substrate impedance micro-elektrodearrays met oppervlakken gecoat met native of MPO-dragend fibronectine. Voeg voor de 35 millimeter glazen kweekschalen twee milliliter van 500.000 cellen per milliliter toe. Plaats de micro-elektrodearray-platen onmiddellijk na het uitzaaien van de cellen in de cell substrate impedance-incubatiepoort bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.

Neem vervolgens blanco metingen om de continue acquisitie van celindexgegevens te initiëren. Plaats de 35 millimeter glazen bodem celkweekschalen in een incubator van 35 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Incubeer gedurende twee uur om maximale celhechting en uitspreiding mogelijk te maken.

Pauzeer na de incubatie de metingen van de celindex en verwijder kortstondig de micro-elektrodenmatrixplaat of de schaal met glazen bodem uit de incubator, aspireer het supernatant en voeg verwarmde HBSS toe om de effecten van remmers, modulatoren van MPO, gekatalyseerde reacties of remmers van cel-signalering te onderzoeken. Voeg deze toe aan de culturen. Plaats op dit moment de matrixplaat onmiddellijk terug in de poort van de incubator of de schaal met glazen bodem terug in de incubator en laat de cellen 30 minuten equilibreren.

Om de NPO-gekatalyseerde, hypochlorigezuur-afhankelijke fibronectine-oxidatie en de-adhesie voor celimpedantiestudies te initiëren, dient de micro-elektrode-arrayplaat uit de incubator te worden gehaald en moeten de metingen van de celindex worden gepauzeerd. Voeg waterstofperoxide toe aan de HBSS en meng dit voorzichtig door herhaaldelijk te pipetteren; plaats de micro-elektrode-array vervolgens onmiddellijk terug in de incubatorpoort en herstart de celindex-uitlezingen voor live-cell imaging studies met gebruik van 35 millimeter glazen bodemschalen. Nadat de schaal uit de incubator is gehaald, wordt deze gemonteerd op een verwarmde tafel van 37 °C van een inverted confocale microscoop, uitgerust met een 63 x waterobjectief.

En DIC-optiek. Voor het opnemen van live-cell movies moet u focussen op de cellen en de DIC-optiek optimaliseren volgens de hier vermelde richtlijnen. Start de DIC-movie en registreer gedurende één minuut de baselinewaarden van onbehandelde cellen, voeg vervolgens waterstofperoxide toe en meng dit voorzichtig door herhaaldelijk te pipetteren; stel de microscoop opnieuw scherp en ga door met het opnemen van DIC-movies van de behandelde cellen voor de vereiste periode. Om de gegevens van de cel-substraatimpedantie te analyseren, begint u met het exporteren van de gegevens naar een spreadsheet voor celadhesie.

Studies normaliseren de gegevens door de waarden die direct vóór de start van MPO-gemedieerde fibronectine-oxidatie zijn geregistreerd op één te stellen; presenteer de gegevens als plots van de genormaliseerde celindex tegenover de tijd om de live-cell imaging-gegevens te analyseren. Open DIC live-cell imaging-films die direct vóór en na de start van MPO-gemedieerde fibronectine-oxidatie zijn opgenomen in een beeldanalyseprogramma zoals Image J; selecteer in ten minste twee afzonderlijke DIC-films willekeurig meerdere cellen en meet hun geprojecteerde oppervlakte in opeenvolgende frames door handmatig de rand van het membraan te omtrekken en het aantal omsloten pixels te kwantificeren. Presenteer de gegevens tot slot als een plot van het genormaliseerde celoppervlak tegenover de tijd; het plaatsen van endotheelcel-suspensies op fibronectine of MPO-bevattend fibronectine resulteert in maximale celadhesie en spreiding binnen twee uur, beoordeeld aan de hand van een plateau van de celindexwaarden in het celsubstraat.

Impedantie-metingen: zodra maximale celadhesie is gevestigd op native of NPO-dragend fibronectine, veroorzaakt gerichte fibronectine-oxidatie, gemedieerd door NPO-gekatalyseerd hypochloorzuur en geïnitieerd door de toevoeging van het cos-substraat waterstofperoxide van NPO's, een snelle afname van het contactoppervlak tussen cel en matrix. Dit wordt gemeten via cel-substraatimpedantie en live-cell imaging, zoals hier getoond; de snelle cellulaire de-adhesie die zichtbaar is in endotheliale cellen gebonden aan NPO-dragend fibronectine als reactie op behandeling met waterstofperoxide, is afwezig in cellen die enkel met waterstofperoxide zijn behandeld. Remming van de motorfunctie van myosinine 2 met BLES-statine remt de snelheid van de-adhesie van endotheliale cellen, gemeten via cel-substratimpedantie en live-cell imaging, wat aantoont dat cellulaire de-adhesie en contractie als reactie op MPO-gekatalyseerde subcellulaire matrixoxidatie worden aangedreven door actomyosine-trekkrachten. Aangezien deze methoden zeer snelle veranderingen in celadhesie nauwkeurig kunnen meten, kunnen ze cruciaal inzicht bieden in de causale relaties tussen adhesieveranderingen en downstream-veranderingen in adhesie-afhankelijke signaleringsprocessen, zoals SARK-fosforylering of focale adhesiesignalering, die in parallelle experimenten over tijd gemakkelijk kunnen worden gemeten met Western blotting.