-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de genetische vereisten voor de afbraak van een onstabiel eiwit in Croce Visier te bepalen. Dit wordt bereikt door een reporter-enzym dat vereist is voor groei onder specifieke selectieve omstandigheden te fusioneren met een onstabiel eiwit van belang. Vervolgens worden wildtype- of mutante cellen die het fusie-eiwit tot expressie brengen gekweekt op selectieve mediumagarplaten.

De plateringstest biedt een handige indicator van eiwitstabilisatie op basis van de groei van gistcellen om biochemische verschillen in eiwitovervloed te bevestigen, terwijl type in mutante cellen die het fusie-eiwit bevatten, via een snelle inefficiënte eiwitextractiemethode voor Western blot-analyse worden gelyseerd. De resultaten tonen aan dat de abundantie van een onstabiel eiwit wordt verhoogd in cellen met een mutatie in een gen dat vereist is voor afbraak. Het omgekeerde is waar voor afbraakbekwame wildtype-stammen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals pulse chase en Cycl heide chase analyses is dat het minder arbeidsintensief en tijdrovend is, waardoor de snelle en hoogdoorvoerige bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak mogelijk wordt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de afbraakvereisten voor een reeks onstabiele eiwitten. Het kan ook worden gebruikt om regulatoren van andere aspecten van genexpressie zoals transcriptie en translatie te identificeren.

De procedures worden gedemonstreerd door Sheldon Watts en Justin Crowder. Studenten in mijn laboratorium. Voorafgaand aan de test transformeren ze een plasmide dat een fusie-eiwit codeert, bestaande uit een onstabiel eiwit en een metabolisch reporter-enzym, in een mutante giststam. Vermoed wordt dat genetische defecten heeft met betrekking tot de regulering van eiwitafbraak als controle, transformeren ze ook hetzelfde plasmide in een wildtype giststam.

Inoculate de transformanten in vijf milliliter minimale medium dat selecteert voor cellen, die de plasmidemoleculen bevatten. Plaats de testbuis in een schuine rotator en incubeer overnacht bij 30 graden Celsius op de volgende dag. Meet de optische dichtheid van de overnachtelijke culturen, egaliseer vervolgens de celconcentratie voor alle cellen door elke cultuur te verdunnen tot een OD 600 van 0,2 met vers medium en steriele individuele 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes.

Om de hoofdassay te beginnen, stelt u een zesvoudige verdunningsreeksmatrix in door eerst 200 microliter van elke voorverdunde stam, beginnend bij een OD 600 van 0,2, over te brengen in aangewezen putjes in de eerste kolom van een steriele 96-wellsplaat ter voorbereiding op volgende verdunningen, gebruik een multikanaals pipette om 125 microliter sterieel water toe te voegen in de lege putjes in kolom twee, drie en vier. Breng vervolgens 25 microliter gist van kolom een over in kolom twee, pipet omhoog en omlaag een paar keer om de cellen gelijkmatig te mengen en ga verder met het overbrengen van 25 microliter cellen van kolom twee in kolom drie. Herhaal de seriële verdunningsstappen totdat de putjes in kolom vier goed gemengd zijn als visuele hulp bij celspotting.

Print een rastersjabloon uit en plak het aan de binnenkant van een petrischaaldeksel, beginnend met de minst geconcentreerde kolom in de seriële verdunningsmatrix. Breng vier microliter cellen over van elke kolom. Op de 96-wellsplaat naar een controle minimaal medium agarplaat die selecteert voor intracellulair plasmidebehoud. Plaats nog eens vier microliter cellen van elke kolom op een afzonderlijke, minimale medium agarplaat die selecteert voor zowel intracellulair plasmide.

Onderhoud en expressie van het onstabiele fusie-eiwit. Laat beide platen vijf tot 10 minuten op de werkbank drogen. Sluit de deksels af met param om uitdroging te voorkomen en incubeer de cellen bij 30 graden Celsius gedurende twee tot zes dagen.

Wanneer kolonies van de snelst groeiende cultuur voor het eerst zichtbaar worden op de meest verdunde plek op een bepaalde plaat, verwijdert u de plaat uit de incubator en documenteert u de omvang van de groei. Door foto's te nemen, kan het nodig zijn om foto's te maken van verschillende platen op verschillende dagen of van dezelfde plaat op meerdere dagen. In het geval van verschillende giststammen die een breed scala aan groeisnelheden vertonen, is biochemisch bevestigd dat een gen dat in de groeitest is geïdentificeerd, de eiwitovervloed reguleert. Begin met het transformeren van wildtype- en mutante giststammen met een plasmide dat het eerder genoemde fusie-eiwit codeert, inoculeer de transformanten in vijf milliliter minimaal medium dat selecteert voor intracellulair plasmidebehoud en incubeer de buisjes overnacht in een schuine rotator bij 30 graden Celsius.

De volgende dag meet u de optische dichtheid bij 600 van elke overnachtelijke cultuur. Zodra alle stammen een OD 600 van 0,4 of hoger hebben bereikt, verdunt u alle culturen terug naar 0,2 met vers medium, zodat het uiteindelijke volume voor elke stam 10 milliliter is. Incubeer de cellen op een 30 graden Celsius platform shaker totdat alle culturen een midden log fase groei OD 600, tussen 0,8 en 1,2, bereiken.

Verzamel a-cellen door 2,5 totale OD-eenheden cellen over te brengen in een verse 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het S-supernatant. Voeg vervolgens een milliliter gedestilleerd water toe, vortex of pipet omhoog en omlaag om de palats te hersuspenderen en breng de celsuspensie over in een verse 1,5 milliliter buis.

Isoleer de cellen met de tweede centrifugatie gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, verwijder de snat en hersuspendeer de cellen in 100 microliter gedestilleerd water. Voeg 100 microliter 0,2 molair natriumhydroxide toe aan de celsuspensie, pipet omhoog en omlaag een paar keer om te mengen en incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om voortijdige cellulaire lysis te voorkomen. Vortex de cellen niet.

Isoleer de cellen opnieuw met een derde centrifugatie gedurende 30 seconden. Verwijder bij kamertemperatuur de supernatants van de cellen en lys de cellen door de pellet opnieuw op te schorsen in 50 tot 100 microliter