Name: -Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer een groei-gebaseerde assay om genetische eisen voor eiwitafbraak in Saccharomyces cerevisiae vast te stellen. Deze methode combineert gistkweek met Western blot-analyse voor biochemische bevestiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de huidige en voormalige leden van de Rubenstein lab voor het verstrekken van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. Wij danken Ryan T. Gibson voor hulp bij het protocol optimalisatie. Wij danken Mark Hochstrasser (Yale University) en Dieter Wolf (Universität Stuttgart) voor giststammen en plasmiden. Wij danken onze anonieme reviewers voor hun hulp bij het verbeteren van de duidelijkheid en het nut van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek award van het hoofdstuk Ball State University van Sigma Xi naar SGW, een National Institutes of Health subsidie ​​(R15 GM111713) aan EMR, een Ball State University ASPiRE onderzoek award voor EMR, en fondsen van de Ball State University Provost&#39;s Office en het Departement Biologie.

1. Gist Groei Assay om Kandidaat Mutants Defecte in eiwitafbraak Identificeer <ol><li> Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor een instabiel eiwit gefuseerd in frame aan een reporter metabole enzym. </li><li> Inoculeer transformanten in 5 ml synthetische gedefinieerd (SD) minimaal medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren. </li><li> Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke overnacht kweek. OPMERKING: Na overnacht incubatie, kunnen cellen in kweek in logaritmisch of stationaire groeifase maar moeten tot een minimum OD600 van 0,2. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch. </li><li> Neem zes-voudige seriële verdunningen van de getransformeerde gistcellen in een steriele 96-well plaat, beginnend met cellen verdund tot eenn OD600 van 0,2. Plaats elke gist transformant wordt geanalyseerd in een andere rij in de 96-well plaat. <ol><li> Voor elke transformant Bereken het volume overnachtkweek nodig om cellen te verdunnen tot een OD600 van 0,2 in een eindvolume van 200 ul. Voeg dit volume van overnachtcultuur de overeenkomstige put in kolom 1. Voeg de juiste hoeveelheid steriel water om het volume op 200 ui te brengen. </li><li> Voor elke rij van gist, voeg 125 ul steriel water aan de putjes in kolommen 2, 3 en 4. OPMERKING: Individueel verpakte steriele 96-putjesplaten worden verpakt met steriele deksels. Het deksel kan worden gebruikt als reservoirs voor het steriele water wordt via deze stap. Dit maakt gelijktijdige overdracht steriel water aan alle putjes in een bepaalde kolom een ​​multichannel pipet. </li><li> Meng de inhoud van de eerste kolom (gist verdund tot een OD600 van 0,2) door op en neer pipetteren met een multichannel pipet. </li><li> Transfer 25 pl gist van kolom 1 tot kolom 2, met een multichannel pipet. Meng door en neer te pipetteren. Breng 25 ul van kolom 2 naar kolom 3 en 25 ul van kolom 3 kolom 4 (goed mengen bij elke stap). </li></ol></li><li> Meng elk monster met een multichannel pipet. Vanuit meeste verdund tot minst kolommen gist, pipet 4 pl van elk monster verdund op twee platen met het geschikte selectieve medium. Gebruik een plaat met medium dat plasmide selectie (deze plaat dient als een gist spotten en groei controle) onderhoudt. Gebruik een tweede plaat met medium dat selecteert voor plasmide onderhoud en expressie van het instabiele eiwit gefuseerd aan het reporterenzym. Omdat gist vestigen zich snel, meng cellen door en neer te pipetteren op regelmatige tijdstippen. OPMERKING: Droger platen zullen gemakkelijker absorberen vloeistof dan vers bereide schotels en worden daarom aanbevolen voor deze experimenten. Damp plaatjes worden gedroogd door incubatie bij kamertemperatuur in low vochtigheid gedurende 1-2 dagen of korter incubaties in een laminaire stroming kap. Platen kunnen ongelijkmatig drogen wanneer de laminaire luchtstroom parallel aan de bank. Toepassing van een sjabloon vergemakkelijkt gistcellen plek op regelmatige afstanden. Twee voorbeeldsjablonen worden verschaft in Figuur 1. Deze kunnen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel. </li><li> Laat platen te drogen op de bank top. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-6 dagen. </li><li> Fotografeer elke plaat na incubatie. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figuur 1. Templates voor het spotten gistcellen op 100 mm agarplaten. Deze sjablonen kunnen worden gebruikt voor het vergemakkelijken spotten gist op regelmatige afstanden een multichannel pipet. Sjablonen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel. Plaats petrischaal met groeimedium binnenkant deksel met sjabloon aangebracht. Sjablonen worden gemarkeerd met een inkeping oriëntatie volgen. Aanbevolen wordt platen in groei assays eveneens worden voorzien van een inkeping oriëntatie volgen. Sjablonen voor het spotten van vier (A) of vijf (B) seriële verdunningen van gistcellen zijn aanwezig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Klik hier om een printbare versie van deze figuur met 100-mm templates te bekijken.</a> 2. Biochemische Bevestiging van Gist Groei Assay <ol><li> De groei van gistcellen en na Alkaline Eiwitextractie (gewijzigd van 31) <ol><li> Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor het eiwit instabiel. </li><li> Inoculeer transformanten in 5 ml SD medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren. </li><li> Meet de OD 600 van elke overnachting culture. OPMERKING: Na incubatie overnacht, kunnen cellen worden in ofwel logaritmische of stationaire groeifase, maar moet een OD 600 dat verwatering zal toelaten om een OD 600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium (stap 2.1.4) hebben bereikt. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch. </li><li> Verdun gistcellen tot een OD600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium. </li><li> Blijf cellen geïncubeerd bij 30 ° C, het roteren of schudden totdat kweken bereiken een OD600 van 0,8 en 1,2 (oftewel in mid-logaritmische groei). Opmerking: Als het instabiele eiwit van belang onder controle van een reguleerbare promotor, kan de optimale tijdstip van inductie van eiwitexpressie en celoogst afhankelijk eerdere studies of empirische observaties. </li><li> Verzamel 2,5 OD 600 eenheden van cultuur in een 15-ml conischeal buis door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie. OPMERKING: Een OD600 eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij OD600 van 1,0. Het volume van de kweek (in ml) nodig om oogsten 2,5 OD 600 eenheden (V) kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = 2,5 OD 600 eenheden / Gemeten OD600 </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml gedestilleerd water. Overdracht gesuspendeerde cellen een microcentrifugebuis. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 6500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 pl gedestilleerd water door en neer te pipetteren of vortexen, en voeg 100 ul 0,2 M NaOH. Meng door en neer te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Pellet cellen (waarvan de meeste zijn nog niet vrijgegeven eiwitten en zijn nog steeds levensvatbaar) door centrifugeren bij 18.000 xg gedurende 5 min. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie. </li><li> Resuspendeer pellet in 50 - 100 gl 1 x Laemmli-monsterbuffer, die lyseren cellen, door op en neer pipetteren of vortexen. OPMERKING: Verwijdering van de alkalische supernatant na centrifugeren en vervolgens opnieuw suspenderen van cellen in Laemmli monsterbuffer onttrekt eiwitten bij een pH compatibel met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) met een Tris-glycine-loopbuffer systeem en western blotting. </li><li> Om volledig denatureren eiwitten, incubeer lysaten bij 95 ° C gedurende 5 min. OPMERKING: Aggregation-gevoelig eiwitten (bijvoorbeeld eiwitten met meerdere transmembraansegmenten) kan onoplosbaar worden wanneer geïncubeerd bij 95 ° C. Daarom moet lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 minuten, zoals empirisch bepaald voor de analyse van dergelijke eiwitten. </li><li> Cool lysaten door het op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Centrifugeer lysaten bij 18.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Scheid de supernatant (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) door SDS-PAGE vóór verder western blot analyse (paragraaf 2.2). Alternatief opslag lysaten bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Representatieve Western Blotting Protocol <ol><li> Laad empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten in een SDS-PAGE gel. </li><li> Run gel bij 200 V tot kleurstoffront heeft de onderkant van de gel bereikte. </li><li> Transfer eiwitten van gel tot polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C. </li><li> Blok membraan door incuberen in 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), schommelen, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Decanteren blokkeren oplossing. </li><li> Incubeer membraan met primair antilichaam specifiek voor eiwit van belang (of epitoop tag daarvan) in 1% afgeroomde melk in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperature, schommelen. </li><li> Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen. OPMERKING: Omdat fluoroforen zijn lichtgevoelig, moet verdunningen van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen worden voorbereid in het donker. Bovendien moet incubatie van membranen in aanwezigheid van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voorkomen in lichtdichte verpakking. Dit kan worden bewerkstelligd door het wikkelen incubatie trays aluminiumfolie. </li><li> Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Na beeldvorming membraan, incubeer de membraan met een primair antilichaam specifiek voor een lasting controle-eiwit in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen. </li><li> Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde methode laat een snelle bepaling en biochemische bevestiging van genetische eisen eiwitafbraak in gistcellen. Deze experimenten benadrukken het nut en de kracht van gist als model eukaryoot organisme (meerdere uitstekende recensies van gist biologie en compilaties van protocollen voor de behandeling, de opslag en het manipuleren van gistcellen (bijvoorbeeld 41-44) zijn beschikbaar voor nieuwe onderzoekers het organisme). De technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast voor de...

Selectieve eiwitafbraak essentieel voor eukaryotische leven en veranderde eiwitafbraak bij tot een aantal medische aandoeningen, waaronder verschillende vormen van kanker, neurodegeneratieve ziekte, cardiovasculaire ziekte, en cystische fibrose 1-5. De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) die selectieve afbraak van eiwitten katalyseert, is een opkomende therapeutisch doelwit voor deze omstandigheden 6-10. Ubiquitine ligasen covalent polymeren van de 76-aminozuur ubiquitine eiwitten 11. Eiwitten die zijn gemarkeerd met polyubiquitine ketens worden erkend en geproteolyseerd door de ~ 2,5 megadalton 26S-proteasoom 12. Studies gestart in het model eukaryoot organisme Saccharomyces cerevisiae (gist) zijn fundamenteel in de ontrafeling van de mechanismen afbraak van eiwitten in eukaryote cellen geweest. De eerste toonde fysiologische substraat van de UPS is de gist transcriptionele repressor MATα2 1314, en vele sterk geconserveerde delen van de UPS werden eerst geïdentificeerd of gekenmerkt in gist (bijvoorbeeld 15-26). Ontdekkingen gedaan in deze veelzijdige en genetisch handelbaar modelorganisme zijn waarschijnlijk blijven belangrijke inzichten verschaffen in geconserveerde mechanismen van ubiquitine gemedieerde afbraak. Erkenning en degradatie van de meeste UPS ondergronden vereisen een gecoördineerde actie van meerdere eiwitten. Daarom is een belangrijk doel bij het karakteriseren van de geregelde afbraak van een bepaalde instabiele eiwit de genetische vereisten voor proteolyse bepalen. Klassieke benaderingen (bijv pulse-chase en cycloheximide-chase experimenten 27) voor het controleren eiwitafbraak bij zoogdier- of gistcellen zijn omslachtig en tijdrovend. Hoewel deze soorten methodologie gevoelige middelen voor het detecteren van eiwitafbraak, ze zijn niet geschikt voor snelle analyse van eiwitafbraak of grootschalige screening voor mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei-gebaseerde assay voor de snelle identificatie van genetische eisen voor de afbraak van instabiele eiwitten gepresenteerd. In de gistgroei-methode voor het analyseren van eiwitafbraak, een instabiel eiwit van belang (of afbraak signaal) gefuseerd in frame, een eiwit dat nodig is voor groei van gist onder bepaalde omstandigheden. Het resultaat is een kunstmatig substraat dat als een krachtig instrument voor de genetische eisen van eiwitafbraak van het instabiele eiwit van belang te bepalen kan dienen. Gunstig, meest gebruikte laboratorium giststammen bevatten een paneel van mutaties in genen die coderen voor metabole enzymen betrokken bij de biosynthese van bepaalde aminozuren of stikstofhoudende basen (bv 20,28-30). Deze enzymen zijn essentieel voor cellulaire proliferatie in afwezigheid van exogeen geleverd metabolieten in de synthese waarvan de enzymen deelnemen. Zodanigmetabolische enzymen kunnen derhalve fungeren als groei gebaseerde reporters voor de afbraak van onstabiele eiwitten waaraan zij gefuseerd. De genetische eisen voor eiwitafbraak kunnen gemakkelijk worden toegelicht, aangezien mutaties die proteolyse voorkomen zal cellen die de afbraak reporter groeien onder selectieve omstandigheden. Een groei voordeel is een indirecte indicatie dat een bepaalde mutatie verhoogt de overvloed van het eiwit van interesse. Echter, wordt direct biochemische analyse vereist om te bevestigen dat een mutatie maakt groei door verhoogde eiwitgehaltes in plaats van via indirecte of artefactuele oorzaken. Het effect van een mutatie op proteïne overvloed kan worden bevestigd door western blot analyse van steady-state eiwit niveaus in cellen die wel en niet haven de specifieke mutatie. Een werkwijze voor snelle en efficiënte extractie van gisteiwitten (sequentiële incubatie van gistcellen met natriumhydroxide en monsterbuffer) in een vorm geschiktvoor analyse door western blotting wordt ook gepresenteerd 31. Samen vormen deze experimenten te vergemakkelijken de snelle identificatie van kandidaat-regulatoren van eiwitafbraak.

<table><tbody><tr><td>Gewensen schimmelstammen, plasmiden, standaard medium en buffercomponenten</td><td></td><td></td><td>Schimmelstammen met gewenste mutaties kunnen worden gegenereerd in het laboratorium van de onderzoeker. Wild-type schimmel en een verscheidenheid aan mutanten zijn ook commercieel verkrijgbaar (bijv. van GE Healthcare). Plasmiden die fusie-eiwitten coderen kunnen worden gegenereerd in het laboratorium van de onderzoeker.</td></tr><tr><td>3-amino-1H-1,2,4-triazool</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor van His3 enzym. Kan worden opgenomen in medium om de strengheid van groeionderzoek met His3 reporter constructen te verhogen.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinante vorm van Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>Kan worden gebruikt om N-glycosylering van eiwitten te beoordelen; compatibel met SDS en beta-mercaptoethanol concentraties gevonden in 1x Laemmli monster buffer.</td></tr><tr><td>Weggeef borosilicaat glazen buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>Temperatuurgeregelde incubator (bijv. Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum voor 18 mm buizen (buis roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Buis roller wordt aanbevolen om overnachting starter culturen van schimmelcellen in suspensie te houden. Een platform shaker of buis roller kan worden gebruikt om grotere culturen in suspensie te houden.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Voor gebruik met buis roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrofotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>Steriele 96-well platte bodem microtest platen met individueel verpakt deksel</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel en multi-channel pipettors worden gebruikt in verschillende stadia van het protocol. Terwijl multi-channel pipettors de pipettasklast op verschillende stappen verminderen, kunnen single-channel pipettors door het hele protocol heen worden gebruikt. Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor die met eenheid wordt verkocht houdt 1,5 en 2,0 ml microcentrifuge buizen. Rotor kan worden verwisseld voor een die 15 ml en 50 ml kegelbuizen houdt.</td></tr><tr><td>Plate beeldvorming systeem (bijv. Gel Doc XR+ Systeem)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Een verscheidenheid aan systemen kan worden gebruikt om platen te beeldvormen, inclusief geavanceerde beeldvormingssystemen, computerscanners en camera telefoons.</td></tr><tr><td>Vaste-hoek Rotor F-35-6-30 met deksel en adapters voor Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml kegelbuizen, 6-plaats</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen geprinte schroefdopbuis 17 x 20 mm kegel, polypropyleen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>1,5 ml flex-buis, PCR schoon, Natuurlijke microcentrifugebuizen</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten</td></tr><tr><td>Analoge Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Kookwater bad met hot plate kan ook worden gebruikt om eiwitten te denatureren</td></tr><tr><td>SDS-PAGE loop- en overdrachtapparaten, voedingen en beeldvormingsapparatuur of donkere kamers voor SDS-PAGE en overdracht naar membraan</td><td></td><td></td><td>Zal variëren per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Western blot beeldvorming systeem (bijv. Li-Cor Odyssey CLx scanner en Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Zal variëren per lab en toepassing</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Zal variëren per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen (bijv. Fosfoglyceraat Kinase (Pgk1) Monoklonaal antilichaam, muis (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Zal variëren per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen (bijv. Alexa-Fluor 680 Konijn Anti-Muis IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Zal variëren per lab en toepassing</td></tr></tbody></table>

-groei op basis vaststelling en biochemische bevestiging van genetische eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Gereguleerde eiwitafbraak is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire functie. Veel van wat bekend is over de moleculaire mechanismen en genetische eisen voor eukaryotische eiwitafbraak werd aanvankelijk opgericht in Saccharomyces cerevisiae. Klassieke analyses van eiwitafbraak hebben vertrouwd op biochemische pulse-chase en cycloheximide-chase methodieken. Hoewel deze technieken gevoelige middelen voor het observeren van afbraak van eiwitten, ze zijn omslachtig, tijdrovend, en een laag-throughput. Deze benaderingen zijn niet vatbaar voor snelle en grootschalige screening van mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei gebaseerde bepaling voor gemakkelijke identificatie van genetische eisen eiwitafbraak beschreven. In deze bepaling wordt een reporterenzym vereist groei onder bepaalde selectieve omstandigheden gefuseerd aan een instabiele eiwit. Cellen ontbreekt het endogene reporter enzym, maar de uiting van de fusie-eiwit kan groeien onder selective omstandigheden wanneer het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd (bijvoorbeeld bij eiwitafbraak gecompromitteerd). In de groei assay beschreven, worden seriële verdunningen van wildtype en mutante gist cellen die een plasmide dat codeert voor een fusie-eiwit gespot op selectieve en niet-selectieve medium. Groei onder selectieve omstandigheden, verenigbaar is met de afbraak bijzondere waardevermindering door een bepaalde mutatie. Verhoogde eiwit overvloed moet biochemisch worden bevestigd. Een werkwijze voor snelle extractie van gisteiwitten in een vorm geschikt voor elektroforese en Western blotting is eveneens aangetoond. Een groei gebaseerde uitlezing voor eiwitstabiliteit, gecombineerd met een eenvoudig protocol voor eiwitextractie voor biochemische analyse, maakt snelle identificatie van genetische eisen eiwitafbraak. Deze technieken kunnen worden aangepast om afbraak van verschillende kortstondige eiwitten volgen. In de gepresenteerde voorbeeld, het HIS3 enzym dat nodig is voor histidine biosynthese werd gefuseerdnaar ° 1 -Sec62. ° 1 -Sec62 is bedoeld voor degradatie na het afwijkend grijpt het endoplasmatisch reticulum translocon. Cellen die ° 1 -Sec62-his3 konden groeien onder selectieve omstandigheden wanneer het eiwit werd gestabiliseerd.

Om deze methode te illustreren, is het HIS3 enzym werd gefuseerd aan het carboxy-uiteinde van het model endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat ° 1 -Sec62 (Figuur 2A) om ° 1 -Sec62-HIS3 is (Figuur 3) . ° 1 -Sec62 vertegenwoordigt een van de oprichters van een nieuwe klasse van ERAD substraten die zijn gericht volgende persistent, afwijkende associatie met de translocatie, het kanaal primair verantwoordelijk voor het verplaatsen va...

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de genetische vereisten voor de afbraak van een onstabiel eiwit in Croce Visier te bepalen. Dit wordt bereikt door een reporter-enzym dat vereist is voor groei onder specifieke selectieve omstandigheden te fusioneren met een onstabiel eiwit van belang. Vervolgens worden wildtype- of mutante cellen die het fusie-eiwit tot expressie brengen gekweekt op selectieve mediumagarplaten.De plateringstest biedt een handige indicator van eiwitstabilisatie op basis van de groei van gistcellen om biochemische verschillen in eiwitovervloed te bevestigen, terwijl type in mutante cellen die het fusie-eiwit bevatten, via een snelle inefficiënte eiwitextractiemethode voor Western blot-analyse worden gelyseerd. De resultaten tonen aan dat de abundantie van een onstabiel eiwit wordt verhoogd in cellen met een mutatie in een gen dat vereist is voor afbraak. Het omgekeerde is waar voor afbraakbekwame wildtype-stammen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals pulse chase en Cycl heide chase analyses is dat het minder arbeidsintensief en tijdrovend is, waardoor de snelle en hoogdoorvoerige bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak mogelijk wordt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de afbraakvereisten voor een reeks onstabiele eiwitten. Het kan ook worden gebruikt om regulatoren van andere aspecten van genexpressie zoals transcriptie en translatie te identificeren.De procedures worden gedemonstreerd door Sheldon Watts en Justin Crowder. Studenten in mijn laboratorium. Voorafgaand aan de test transformeren ze een plasmide dat een fusie-eiwit codeert, bestaande uit een onstabiel eiwit en een metabolisch reporter-enzym, in een mutante giststam. Vermoed wordt dat genetische defecten heeft met betrekking tot de regulering van eiwitafbraak als controle, transformeren ze ook hetzelfde plasmide in een wildtype giststam.Inoculate de transformanten in vijf milliliter minimale medium dat selecteert voor cellen, die de plasmidemoleculen bevatten. Plaats de testbuis in een schuine rotator en incubeer overnacht bij 30 graden Celsius op de volgende dag. Meet de optische dichtheid van de overnachtelijke culturen, egaliseer vervolgens de celconcentratie voor alle cellen door elke cultuur te verdunnen tot een OD 600 van 0,2 met vers medium en steriele individuele 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes.Om de hoofdassay te beginnen, stelt u een zesvoudige verdunningsreeksmatrix in door eerst 200 microliter van elke voorverdunde stam, beginnend bij een OD 600 van 0,2, over te brengen in aangewezen putjes in de eerste kolom van een steriele 96-wellsplaat ter voorbereiding op volgende verdunningen, gebruik een multikanaals pipette om 125 microliter sterieel water toe te voegen in de lege putjes in kolom twee, drie en vier. Breng vervolgens 25 microliter gist van kolom een over in kolom twee, pipet omhoog en omlaag een paar keer om de cellen gelijkmatig te mengen en ga verder met het overbrengen van 25 microliter cellen van kolom twee in kolom drie. Herhaal de seriële verdunningsstappen totdat de putjes in kolom vier goed gemengd zijn als visuele hulp bij celspotting.Print een rastersjabloon uit en plak het aan de binnenkant van een petrischaaldeksel, beginnend met de minst geconcentreerde kolom in de seriële verdunningsmatrix. Breng vier microliter cellen over van elke kolom. Op de 96-wellsplaat naar een controle minimaal medium agarplaat die selecteert voor intracellulair plasmidebehoud. Plaats nog eens vier microliter cellen van elke kolom op een afzonderlijke, minimale medium agarplaat die selecteert voor zowel intracellulair plasmide.Onderhoud en expressie van het onstabiele fusie-eiwit. Laat beide platen vijf tot 10 minuten op de werkbank drogen. Sluit de deksels af met param om uitdroging te voorkomen en incubeer de cellen bij 30 graden Celsius gedurende twee tot zes dagen.Wanneer kolonies van de snelst groeiende cultuur voor het eerst zichtbaar worden op de meest verdunde plek op een bepaalde plaat, verwijdert u de plaat uit de incubator en documenteert u de omvang van de groei. Door foto's te nemen, kan het nodig zijn om foto's te maken van verschillende platen op verschillende dagen of van dezelfde plaat op meerdere dagen. In het geval van verschillende giststammen die een breed scala aan groeisnelheden vertonen, is biochemisch bevestigd dat een gen dat in de groeitest is geïdentificeerd, de eiwitovervloed reguleert. Begin met het transformeren van wildtype- en mutante giststammen met een plasmide dat het eerder genoemde fusie-eiwit codeert, inoculeer de transformanten in vijf milliliter minimaal medium dat selecteert voor intracellulair plasmidebehoud en incubeer de buisjes overnacht in een schuine rotator bij 30 graden Celsius.De volgende dag meet u de optische dichtheid bij 600 van elke overnachtelijke cultuur. Zodra alle stammen een OD 600 van 0,4 of hoger hebben bereikt, verdunt u alle culturen terug naar 0,2 met vers medium, zodat het uiteindelijke volume voor elke stam 10 milliliter is. Incubeer de cellen op een 30 graden Celsius platform shaker totdat alle culturen een midden log fase groei OD 600, tussen 0,8 en 1,2, bereiken.Verzamel a-cellen door 2,5 totale OD-eenheden cellen over te brengen in een verse 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het S-supernatant. Voeg vervolgens een milliliter gedestilleerd water toe, vortex of pipet omhoog en omlaag om de palats te hersuspenderen en breng de celsuspensie over in een verse 1,5 milliliter buis.Isoleer de cellen met de tweede centrifugatie gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, verwijder de snat en hersuspendeer de cellen in 100 microliter gedestilleerd water. Voeg 100 microliter 0,2 molair natriumhydroxide toe aan de celsuspensie, pipet omhoog en omlaag een paar keer om te mengen en incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om voortijdige cellulaire lysis te voorkomen. Vortex de cellen niet.Isoleer de cellen opnieuw met een derde centrifugatie gedurende 30 seconden. Verwijder bij kamertemperatuur de supernatants van de cellen en lys de cellen door de pellet opnieuw op te schorsen in 50 tot 100 microliter

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Het aanbod van eiwitten weerspiegelt de snelheden van zowel eiwitsynthese als eiwitafbraak. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide-chase gevolgd door western blotting om eiwitafbraak te analyseren in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (knopgist).

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Leer een groei-gebaseerde assay om genetische eisen voor eiwitafbraak in Saccharomyces cerevisiae vast te stellen. Deze methode combineert gistkweek met Western blot-analyse voor biochemische bevestiging.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in

Meer video's verkennen