Name: Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer hoe cholesterol de opname van Cryptococcus neoformans door macrofagen beïnvloedt via methyl beta cyclodextrin-depletie en microscopische analyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van fungale pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies AI56168, AI71142, AI87541 en AI100631 te MDP. Maurizio Del Poeta is Burroughs Wellcome Investigator in Infectieziekten.

1. Cholesterol Uitputting van J774A.1 Cellen met MβCD <ol><li> In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 pl Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N. </li><li> Verwijder media uit de celmonolaag en was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die is gefilterd en geautoclaveerd. </li><li> Voeg 200 ul van MβCD oplossing in de gewenste concentratie (10 mM of 30 mM in PBS) of 1x PBS als controle en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder schudden. Verwijder supernatant en reserve bij RT voor de kwantitatieve analyse met in de handel verkrijgbare kit onmiddellijk na de procedure. </li><li> Was de cellen twee tot drie keer met 1x PBS en serumvrije DMEM en verder met infectie of lyseren cellen door pipetting 2-3 maal met gedeïoniseerd H2O voor analyse met dunne laag chromatografie of met een kit. OPMERKING: Na cholesterol uitputting een in de handel verkrijgbaar cholesterol kwantificering kit kan worden gebruikt. Zie materialen sectie voor details. Volg de instructies van de fabrikant als geschreven. </li></ol> 2. Observatie van cholesterolgehalte met dunnelaagchromatografie (TLC) <ol><li> Was een TLC-tank tweemaal met aceton en eenmaal met een oplossing van petroleumether: diethylether: azijnzuur (65: 30: 1 in volume). Verzadig de bak met petroleumether: diethylether: azijnzuur (65: 30: 1 in volume) oplossing en laat O / N. OPMERKING: Organische oplosmiddelen moeten altijd onder een afzuigkap gebruikt worden om inademing van dampen te vermijden. Handschoenen en een laboratoriumjas te worden gedragen ten alle tijden. Azijnzuur is een sterk zuur en moet met voorzichtigheid worden gebruikt. </li><li> In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 6 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 6-well cell kweekplaat in een volume van 5 ml warme DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Afbrekende macrofagen van cholesterol door de stappen 1,2-1,4, het vervangen van 1 ml voor 200 ul indien van toepassing rekening te houden met het grotere goed formaat. </li><li> Voeg 500 pi van trypsine-EDTA aan elk putje, incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en voorzichtig schrapen cellen met een cel schraper. </li><li> Breng in een microcentrifugebuis en voeg nog eens 500 pl warm DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. </li><li> Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 300 g en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg een extra 500 pl warm DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S de celpellet en resuspenderen door en neer te pipetteren. </li><li> Breng 10 pl van cellen en cellen tellen op een hemocytometer. Normaliseren van de cel concentratie van elk monster en een gelijk aantal cellen glazen buizen. LET OP: Bij deze stap, één meikiezen cellen combineren van dezelfde behandelingsgroepen een meer geconcentreerde uiteindelijke lipide extract te verkrijgen. </li><li> Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijdert media. </li><li> Voeg 2 ml methanol en vortex. Dan, voeg 1 ml chloroform en vortex. Controleer de fase-status te zorgen dat de oplossing in monofasische maken. OPMERKING: buizen kunnen bij 4 ° CO / N opgeslagen. </li><li> Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en breng de supernatant naar een nieuwe buis </li><li> Voeg een extra 1 ml chloroform gevolgd door 1 ml dH 2 O. Vortex tweemaal gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Weeg een glazen buis op een gevoelige balans en gebruik een glazen Pasteur pipet om de onderste fase over in de glazen buis van bekend gewicht. </li><li> Drogen neer lipiden in een centrifugale verdamper tot het droog is (ongeveer 2 uur). Weeg buis met gedroogde lipiden en bereken de droge lipide gewicht. OPMERKING: Droog lipiden kunnen worden opgeslagen in -20 ° C tot klaar om TLC voeren. </li><li> Verdun gedroogde lipiden in chloroform voldoende om de concentratie van lipiden normaliseren (meestal 20-50 pi) en de belasting 20 ul van de verdunde lipide op een silica TLC-plaat. Load 20 ug cholesterol verdund in 20 pi chloroform als een standaard. </li><li> Voeg gedroogd TLC plaat om de verzadigde TLC tank en laat oplosmiddel migreren tot 1 cm voor plaatrand. Verwijder TLC-plaat uit de tank en laat ze drogen ongeveer 5 min. </li><li> Visualiseer lipiden door het plaatsen in een jodiumdampen tank om migratie te controleren. Te verwijderen en vlekken te vervagen voor ongeveer 10-15 min onder de motorkap. OPMERKING: Jodium is geen gevaar voor inademen. Gebruik altijd onder een afzuigkap. </li><li> Bereid een oplossing van neutrale lipiden kleuring door het combineren van 60 ml methanol met 60 ml gedeïoniseerd H2O, 4 ml zwavelzuur en 630 mg mangaan chloride. </li><li> Voorzichtig en langzaam dompel de TLC-plaat in de neutrale lipiden kleuroplossing in een lade en verwijderen zonder afstoot silica layer. OPMERKING: De neutrale lipide kleuroplossing kan meerdere keren worden hergebruikt en zodat het kan worden opgehaald uit de bak en in een fles voor later gebruik teruggeplaatst. </li><li> Laat de plaat drogen onder de motorkap bij KT totdat alle bellen verdwenen. Verwarm de DLC-plaat op een warmte-blok set tot 160 ° C en char om de gewenste kleur. OPMERKING: Een densitometrie programma zoals Vision Works LS kan worden gebruikt om de verkoolde banden te kwantificeren lipide monsters te vergelijken. </li></ol> 3. Infectie van macrofagen met C. neoformans (H99) <ol><li> In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 ui DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 5% CO 2 O / N. OPMERKING: Infectie kan ook worden gedaan in een glazen bodem confocale gerechten voor eenvoudiger beeldvorming; alle bedragen blijven hetzelfde. </li><li> Grow een cultuur van C. neoformans (H99)door inoculeren van 10 ml YNB één kolonie verkregen uit een geslagen plaat en incuberen O / N bij 30 ° C onder schudden. </li><li> Wassen en tel C. neoformans (H99) cellen. <ol><li> Centrifuge C. neoformans O / N kweek bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder media en gooi ze weg. Was de cellen met 5 ml 1x PBS. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder PBS en was met 5 ml gefiltreerd 1x PBS. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap nog 2 keer. </li><li> Verwijder PBS en resuspendeer in 5 ml 1X PBS. </li><li> Voeg een seriële verdunning in PBS tot een 1 verkregen: 500 verdunning van de kweek gewassen. <ol><li> Voeg 100 ul van het oorspronkelijke monster 900 ul van 1 x PBS tot een 1:10 verdunning te verkrijgen. </li><li> Voeg 100 ul van 1:10 verdunde monster tot 900 ul van 1x PBS om een ​​1 te verkrijgen: 100 verdunning. </li><li> Voeg 200 ul van de 1: 100 verdunde monster 800 ul van 1 x PBS om 1 te verkrijgen: 500 dilutiop </li></ol></li><li> Neem 10 pi van 1: 500 verdunning en rekenen hemocytometer om het aantal cellen te berekenen. </li></ol></li><li> Bereid werkoplossing voor het activeren van macrofagen en opsoniserende C. neoformans. <ol><li> Verdunnen LPS en IFNy 100x uit voorraad oplossingen door het toevoegen van 10 pi tot 990 ul. OPMERKING: LPS en IFNy worden gebruikt fagocytische opname vergroten, maar zijn niet vereist voor fagocytose. Als er belangstelling fungicide activiteit van macrofagen, uitvoeren activatie O / N bij 37 ° C onder schudden voor infectie. </li><li> Per monster combineren 7,5 gl verdunde LPS, 1,25 gl verdunde IFNy, 1.25 ui GXM antilichaam en het volume van de C. neoformans cultuur die 1,25 x 10 5 cellen geeft. Breng volume 250 pi maal aantal monsters met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P / S. </li><li> Vortex en incubeer oplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C onder schudden. OPMERKING:Cholesterol uitputting (stappen 1,2-1,4) kan gelijktijdig worden uitgevoerd met de opsonisatie stap. Zorg ervoor dat macrofagen vóór het mengen van de werkoplossing te behandelen, aangezien de geopsoniseerde cellen optimaal niet langer gebruikt worden dan 20 min na stap 3.4.3 incubatie. </li></ol></li><li> Infecteren macrofagen <ol><li> Wassen macrofagen tweemaal met serumvrij DMEM en voeg 200 pl opsonized C. neoformans werkoplossing aan elk putje. </li><li> Incubeer 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix en Stain Cellen <ol><li> Verwijder de media en was cellen 2 keer met DMEM. </li><li> Lucht drogen de celmonolaag gedurende 10 min en voeg 200 pl ijskoude methanol om de cellen te repareren. </li><li> Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en verwijder eventueel overgebleven methanol. </li><li> Voeg 200 ul van 10x Giemsa en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was 2 - 3 keer met gedemineraliseerd water en droog O / N met dop eraf. OPMERKING: Imaging kunnen de volgende dag worden gedaan of tot een week following vlekken. </li></ol></li><li> Visualiseren en Graaf <ol><li> Met behulp van een microscoop, tel 300 cellen per datapunt (als er 2 van dezelfde behandeling rekenen 150 per putje) en noteer het aantal geïnfecteerde macrofagen en het aantal overspoeld Cryptococcus cellen. OPMERKING: Om ervoor te zorgen zelfs bemonstering per datapunt gebruik 2 platen per staat, kiest u 3 niet-overlappende gebieden per plaat en tel 50 cellen per gebied. </li><li> Bereken fagocytose index met het percentage van geïnfecteerde macrofagen vermenigvuldigen met het gemiddelde aantal C. neoformans per macrofaag. Normaliseren fagocytische index expressie waarden als percentage van de 1x PBS behandelde controlegroep. Na verschillende tests berekent het gemiddelde en de standaarddeviatie van de gemiddelde trends in fagocytische index te bepalen. Gebruik student t-test voor significantie te bepalen. </li><li> Neem microfoto van cellen op 1000x of 400X vergroting. </li></ol></li></ol> 4. trypaanblauw Assay <ol><li> In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 6 macrofaag-achtige cellen per putje van een 6-well celcultuur plaat in een volume van 5 ml Dulbecco&#39;s minimaal essentieel medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine . Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Afbrekende macrofagen van cholesterol door de stappen 1,2-1,4 vervangen van 2 ml voor 200 ul indien van toepassing rekening te houden met het grotere goed formaat. OPMERKING: Zorg ervoor dat u een controle behandelde met 1x PBS, evenals een controle dat voorafgaand aan elke behandeling wordt geschraapt bevatten. </li><li> Voeg 500 ul 1X PBS aan elk putje en voorzichtig schrapen cellen met een cel schraper. Breng in een microcentrifugebuis en schorsen cellen door voorzichtig en neer te pipetteren. </li><li> Breng 10 pl van cellen en vlek met 1 ui 4% trypan blauw. </li><li> Tellen cellen op een hemocytometer en de levensvatbaarheid berekenen met de volgende formule:% levensvatbaarheid = [1 - (Blue cellen / totaal cellen)]x 100. normaliseren waarden van de controle die onbehandeld was. Na een aantal proeven te berekenen de gemiddelde waarde en de standaarddeviatie om trends vast te stellen van de levensvatbaarheid. Gebruik student t-test voor significantie te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij het ​​werken met dit protocol is het belangrijk om nauwkeurige celtellingen wanneer plating zoogdiercellen en opsoniserende C. verkrijgen neoformans-cellen. Dit minimaliseert de variatie tussen onderzoeken en zeer nauwkeurig 1: 1 tot doel effectorverhouding gedurende de studie. Het is ook kritisch om de timing van de cholesterol uitputting en infectie coördineren voorkomen opsonized gistcellen of behandelde macrofaag cellen uit rusten bij kamertemperatuur tussen de procedures. Periodes lange wachtt...

Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam 1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. &#39;Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen overspoelen en vormen een phagosome 2. Onder de zogenaamde &#39;professionele&#39; fagocyten zijn macrofagen. Macrofagen zijn zeer gespecialiseerde cellen die het uitvoeren van beschermende functies die onder andere het zoeken naar en het elimineren van ziekteverwekkers, het repareren van beschadigde weefsels, en het bemiddelen ontsteking, het grootste deel vandeze door het proces van fagocytose 1,2. Cryptococcus neoformans is een species van pathogene gist die een ernstige ziekte bekend als Cryptokokkose veroorzaakt. Cryptococcus sporen worden ingeademd door de gastheer en resulteren in een longinfectie die meestal asymptomatisch. Men denkt dat de blootstelling zeer gangbaar; Een monster van 61 kinderen uit de Pediatric Infectious Diseases Clinic bij het ​​Bronx Lebanon Hospital Center gevonden dat alle ondervraagde antilichamen tegen de cryptococcal polysaccharide glucuronoxylomannan en andere studies hebben aangetoond prevalentie in zowel menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) geïnfecteerde en geïnfecteerde volwassenen 3, 4. alveolaire macrofagen zijn de eerste regel van het antwoord op de longinfectie en in de meeste gevallen met succes duidelijk de ziekteverwekker. In immuungecompromitteerde personen (bijvoorbeeld HIV en AIDS patiënten) de gist kan overleven in macrofagen. In dezegevallen kan de macrofagen dienen als een niche voor de replicatie van het pathogeen en kan de verspreiding ervan naar het centrale zenuwstelsel (CZS) wanneer de ziekte wordt fatale 5 vergemakkelijken - 8. Er wordt gedacht dat macrofagen ook de gist kan leveren direct in de hersenvliezen, waardoor de gist de bloedhersenbarrière passeren via de &quot;Trojaans paard&quot; model 3,9 - 11. Het is dus belangrijk om het proces van fagocytose en de factoren die van invloed zijn, vooral in cryptococcal infecties begrijpen. Vorige werk in andere pathogeen systemen wijzen op cholesterol en rafts gevormd door cholesterol als het hebben een belangrijke rol te spelen in fagocytose 12-15. Cholesterol is de meest voorkomende soorten lipiden in zoogdiercellen en omvat 25 - 50% van de zoogdiercel membraan 16. Gevonden een rol spelen bij het moduleren van Biophysical eigenschappen van membranen door het veranderen van hun starheid 17. Cholesterol en sfingolipiden samen lipiden microdomeinen binnen het membraan bekend als lipide rafts. Lipide rafts zijn gevonden betrokken te zijn bij de vorming van caveolae, alsmede het verschaffen van een geïsoleerd domein voor bepaalde signalering 16-18. Door hun kleine formaat, is het moeilijk om lipide rafts in in vivo. Een handige manier om de rol van lipide rafts bestuderen is hun bestanddelen veranderen. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) een verbinding die is gevonden om cholesterol afbreken van zoogdieren membranen en wordt vaak gebruikt om de rol van rafts 18 bestuderen. In dit protocol presenteren we een methode om cholesterol uit gastcelmembranen afbreken en kwantificeren van het effect van de uitputting van het vermogen van de gastheercellen fagocyteren C. neoformans in vitro. Deze procedure maakt gebruik van celkweek techniqUES op een onsterfelijk macrofaagachtige cellijn (J774A.1) als model voor infectie. Cholesterol depletie werd bewerkstelligd door blootstelling aan MβCD die een hydrofobe kern specifiek de grootte van sterolen heeft en kan fungeren als een gootsteen voor cholesterol te trekken uit het membraan 19. Cholesterol depletie werd gemeten kwantitatief behulp van een commercieel verkrijgbare kit en kwalitatief toepassing van een gemodificeerde Bligh-Dyer lipide extractie gevolgd door dunnelaagchromatografie (TLC) 20. . Fagocytose werd gemeten door het infecteren van de cellijn met een cultuur van opsonized gist gemengd met een cocktail van interferon-γ en lipopolysaccharide voor het activeren van macrofagen Cryptococcus werd geopsoniseerd met een glucuronoxylomannan (GXM) antilichaam 21-23. Kleuring en microscopie experimenten termijn voor visualisatie van de cellen en de berekening van de fagocytose index van de mate van fagocytose beoordelen. Bij elkaar genomen, dit protocol describes een basismethode dat de wijziging van lipide samenstelling met een fysiologisch proces integreert.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Bewaar op 4 &deg;C en verwarm tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Bewaar ingevroren op -20 &deg;C en ontdooi voordat u toevoegt aan DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Gebruikt om DMEM te suppleren</td></tr><tr><td>Isotemp Celkweekincubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well kweekschaal</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfaatgebufferde Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Verdun tot 1x en filter of autoclaveer voor gebruik.</td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-cyclodextrine</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Los op in 1x PBS om oplossingen van 10 mM en 30 mM concentraties te maken</td></tr><tr><td>Orbitale schudder</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>Alle reagentia voor Cholesterol Assay zitten in het kit. Volg de instructies van de fabrikant.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plaat</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplaatlezer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC kamer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Papier</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Snij naar de gewenste grootte voor TLC tank</td></tr><tr><td>Afzuigkap</td><td></td><td></td><td>Elke afzuigkap die voldoet aan AIHA/ANSI Standaarden</td></tr><tr><td>6-Well plaat</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Celschraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meet tot 0,1 mg</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 met concentratiezone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Jodium chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Gebruik de Vision Works LS software voor densitometrie analyse</td></tr><tr><td>Glazen bodem confocale schaal</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Verkregen van Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Zie fabrikant voor bereidingsinstructies. Gebruik een glucoseconcentratie van 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Los op in 1x PBS om 1 mg/ml stock op te maken. Bewaar op -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Los op in 1x PBS om 0,1 mg/ml stockoplossing te maken</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannaan antilichaam (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift van Arturo Casadevall's Lab concentratie is 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Los 0,8 g Giemsa op in 25 ml glycerol en verwarm tot 60 &deg;C gedurende 1 uur. Voeg 25 ml methanol toe aan de oplossing en laat ten minste 1 maand op kamertemperatuur ouder worden.</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscoop met AxioCam MRm voor het maken van afbeeldingen</td></tr></tbody></table>

macrofagen cholesterol uitputting en het effect daarvan op de fagocytose van<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptokokkose is een levensbedreigende infectie veroorzaakt door ziekteverwekkende schimmels van het geslacht Cryptococcus. Infectie gebeurt bij inhalatie van sporen die kunnen repliceren in de diepe long zijn. Fagocytose van Cryptococcus door macrofagen is een van de manieren waarop de ziekte kan verspreiden in het centrale zenuwstelsel dodelijke hersenvliesontsteking veroorzaken. Daarom is onderzoek naar de associatie tussen Cryptococcus en macrofagen is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de infectie. De onderhavige studie beschrijft stap voor stap protocol macrofaag infectiviteit bestuderen door C. neoformans in vitro. Met behulp van dit protocol, wordt de rol van gastheer sterolen op gastheer-pathogeen interacties bestudeerd. Verschillende concentraties van methyl - cyclodextrine (MCD) gebruikt om cholesterol uit muizen reticulum sarcoom macrofaag cellijn J774A.1 afbreken. Cholesterol uitputting werd bevestigd en gekwantificeerd met behulp van zowel een commercieel beschike cholesterol kwantificering kit en dunnelaagchromatografie. Cholesterol uitgeputte cellen geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFNy) en geïnfecteerd met antilichaam opsonized Cryptococcus neoformans wildtype H99 cellen bij een effector-tot-doel-verhouding van 1: 1. Geïnfecteerde cellen werden gevolgd na 2 uur incubatie met C. neoformans en de fagocytose index werd berekend. Cholesterol depletie resulteerde in een significante vermindering van de fagocytose index. De gepresenteerde protocollen bieden een handige methode om de inleiding van de infectie proces na te bootsen in een laboratoriumomgeving en bestuderen van de rol van gastheer lipidesamenstelling op besmettelijkheid.

Cholesterol Uitputting Analyse van het supernatans gereserveerd stap 1.3 van het protocol volgens de instructies van de fabrikant in de Amplex Red Cholesterol Assay kit levert een verhoogd cholesterolgehalte in MβCD behandelde monster vergeleken met de 1x PBS controle. Afhankelijk van celtype en MβCD gebruikte concentratie cholesterol depletie kan variëren. Voor J774 behandeld met 10 mM MβCD, werd een afname van ongeveer 50% waargenomen. Uitputting kan worden berekend met waarden verkregen uit ...

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor de infectie van macrofagen met Cryptococcus neoformans. Ook wordt een methode uitgelegd voor het verminderen van sterolen in de macrofagen. Deze protocollen bieden een leidraad om schimmelinfecties in vitro te bestuderen en de rol van sterolen in dergelijke infecties te onderzoeken.

Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Het algemene doel van deze procedure is om de rol van cholesterol bij de opname van Cryptococcus neoformans door macrofagen te verduidelijken. Dit wordt bereikt door eerst cholesterol te verwijderen uit een muizenmacrofaag-cellijn met behulp van methyl-bèta-cyclodextrine. Vervolgens wordt de cholesteroluitputting bevestigd en gekwantificeerd met behulp van dunlaagchromatografie en een commercieel verkrijgbare kit.Vervolgens worden de Cryptococcus neoformans-cellen geopsoniseerd met antilichamen die specifiek zijn voor glucuronoxylomannaan (GXM) of een GXM-component van de Cryptococcus-capsule. Ten slotte worden de cholesterol-uitgeputte macrofagen geïnfecteerd met de geopsoniseerde Cryptococcus neoformans. Uiteindelijk worden fluorescentiemicroscopie en lichtmicroscopie gebruikt om de geïnfecteerde cellen te visualiseren en om de graad van fagocytose te berekenen.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze met basis laboratoriumapparatuur in relatief korte tijd kan worden uitgevoerd en toch kwantitatieve resultaten oplevert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van schimmelpathogenese. Bijvoorbeeld: wat is de rol van lipidengroepen van de gastheer in de optiek van schimmelpathogenen?De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of de bestrijding van occulte infecties, omdat internalisatie in macrofagen een kritische stap is voor de initiatie van ernstige aandoeningen. Hoewel deze methoden inzicht kunnen bieden in de infectiviteit van schimmelpathogenen, kunnen ze ook worden toegepast op andere organismen, zoals obligate intracellulaire pathogenen. Zaai in een steriele biosafety cabinet 10⁵ J 7 74 A 0.1 macrofaag-achtige cellen per putje van een 96-wells kweekplaat. Incubeer deze overnacht bij 37 °C en 5% CO2 in 200 µL DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine of PS; ga de volgende dag verder.Verwijder het medium van de cellaag en gebruik gefiltreerde of geautoclaveerde PBS om de cellen tweemaal te wassen. Voeg 200 µL methyl-beta-cyclodextrine of embeta CD-oplossing toe in de gewenste concentratie, of 1x PBS als controle, en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C onder schudding. Verwijder het supernatant en bewaar dit bij kamertemperatuur voor kwantitatieve analyse met een commercieel verkrijgbare kit.Was de cellen onmiddellijk na deze procedure met PBS of serumvrij DMEM twee tot drie keer voordat de cholesterolkwantificatie wordt uitgevoerd of wordt overgegaan tot de infectie. Ga naar een steriele biologische veiligheidskast om de cholesterol-gedepleteerde macrofagen te infecteren. Zaai 10⁵ macrofaag-achtige cellen per well uit.Incubeer in een 96-wells plaat gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2 gelijktijdig. Kweek een cultuur van C. neoformans H99 door één kolonie van een uitgestreken plaat te isoleren en 10 ml YNB te inoculeren; incubeer dit gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Centrifugeer de C. neoformans-cultuur de volgende dag bij 1.700 ×g en 4 °C gedurende 10 minuten.Verwijder het supernatant en voeg vijf milliliters 1x PBS toe voordat u opnieuw centrifugeert. Gebruik vervolgens gefilterde 1x PBS om de cellen nog drie keer te wassen voordat u de cellen resuspendeert in vijf milliliters 1x PBS. Bereid vervolgens een seriële verdunning van de gewassen cultuur door 100 microliters van het oorspronkelijke monster toe te voegen aan 900 microliters 1x PBS.Om een verdunning van 1:10 te verkrijgen, voegt u 100 µL van het 1:10 verdunde monster toe aan 900 µL 1x PBS om een verdunning van 1:100 te verkrijgen. Voeg tenslotte 200 µL van het 1:100 verdunde monster toe aan 800 µL 1x PBS. Om een verdunning van 1:500 te verkrijgen, voegt u 10 µL van de uiteindelijke verdunning toe aan een hemocytometer en telt u de cellen om het aantal cellen te berekenen. Om een werkoplossing te bereiden voor het activeren van macrofagen en het opsoniseren van C. neoformans, verdunt u LPS en interferon-gamma 100 keer vanuit de voorraadoplossingen door 10 µL van elke verbinding te verdunnen in 990 µL PBS. Combineer voor elk monster 7,5 µL LPS, 1,25 µL interferon-gamma, 1,25 µL GXM-antilichaam en 1,25 × 10⁵.Seed neo forman-cellen en breng vervolgens, met behulp van DMEM aangevuld met FBS en Ps, het volume aan tot 250 µL per monster. Vortex de oplossing en incubeer deze gedurende 20 minuten bij 37 °C onder schudcondities voordat de macrofagen worden geïnfecteerd; cholesteroluitputting kan na de cholesteroluitputting worden uitgevoerd. Gebruik serumvrij DMEM om ze twee keer te wassen voordat er 200 µL opsoniseerde C. neoformans-werkoplossing aan elk monster wordt toegevoegd.Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Fixeer en kleur vervolgens de cellen. Nadat de cellen twee keer zijn gewassen met DMEM en de cellaag 10 minuten aan de lucht is gedroogd, worden 200 µL ijskoude methanol toegevoegd om de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur te fixeren, waarna de resterende methanol wordt verwijderd.Voeg vervolgens 200 µL 10 x giza toe en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Was daarna twee of drie keer met gedeïoniseerd water, laat de dop eraf en laat het de volgende dag overnacht drogen, of tot een week later onder een microscoop. Tel 300 cellen per datapunt en noteer het aantal geïnfecteerde macrofagen en het aantal opgenomen cryptococcus-cellen.Bereken de PHA-acidische index door het percentage geïnfecteerde macrofagen te vermenigvuldigen met het gemiddelde aantal C neoformans per macrofaag. Normaliseer de F-acidische index door de waarden uit te drukken als een percentage van de XPBS-behandelde controle. Bereken na verschillende proeven de gemiddelde waarde en de standaarddeviatie van het gemiddelde om trends in de F-acidische index te bepalen.Gebruik de student t-toets om de significantie te bepalen, zoals hier wordt getoond. Analyse van het bewaarde supernatant van met M&beta;CD behandelde cellen onthulde verhoogde cholesterolwaarden in vergelijking met het supernatant geïsoleerd uit PBS-controlecellen, wat wijst op een hoger niveau van cholesteroldepletie in de met M&beta;CD behandelde cellen. Depletie kan worden berekend met behulp van cholesterolwaarden verkregen uit het supernatant en het cellysaat, zoals hier wordt geïllustreerd, ter ondersteuning van de resultaten van de cholesteroldepletie.Celllysaat geanalyseerd met TLC vertoont een duidelijke afname in de kleuring van cholesterol in cellen behandeld met toenemende concentraties M beta CD cytometry. Analyse van de TLC laat een vergelijkbare trend zien als de kwantitatieve assay na infectie; de cellen blijven gehecht en intact, en de celmorfologie blijft ongewijzigd in C. neoformans-geïnfecteerde cellen vergeleken met onbehandelde controlecellen. Micrografen van optimaal geïnfecteerde cellen tonen duidelijk C. neoformans die zijn opgenomen in de zoogdiercellen.Deze grafiek laat zien dat, wanneer dit wordt berekend op basis van 300 macrofaagcellen per behandelingsgroep, een afname van de F-zure index werd gevonden in cholesterol-uitgeputte cellen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd. Dit is exclusief de incubatietijden die na deze procedure gedurende de nacht moeten plaatsvinden. Andere methoden, zoals de extractie van detergent-resistente membranen uit de macrofagen, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of cholesterol-uitputting de opname van Cryptococcus vermindert door de lipid-rafts van de gastheer te beïnvloeden na de ontwikkeling ervan.Deze technieken maken het voor onderzoekers op het gebied van membraanbiologie en immunologie mogelijk om de mechanismen van fagocytose door macrofagen en de interacties met pathogene schimmels te begrijpen. Houd er rekening mee dat het werken met pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn; er moeten daarom altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van beschermende uitrusting tijdens het uitvoeren van deze procedure.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van...

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

In this video, we demonstrate a cytotoxicity assay to assess Cryptococcus neoformans, a pathogenic fungus, infection in macrophages. The cytotoxicity is determined by the release of cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme due to macrophage lysis caused by Cryptococcus neoformans infection.

A Lactate Dehydrogenase Release Assay to Detect Cryptococcus neoformans Infection in Macrophages

Source:Adepemi O. Ogundeji1, Nozethu Mjokane1, Maphori Maliehe1, Olihile M. Sebolai11Department of Microbiology and Biochemistry, University of the Free State.This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.

Visualiseren Non-lytische Exocytosis van Cryptococcus neoformans Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

We beschrijven een methode om de snelheid van fagosomen te meten die zich in levende cellen, geïnfecteerd met of zonder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, naar het centrum van de cel bewegen, met behulp van spinning disk confocale fluorescentiemicroscopie om gefluorescerende geïnfecteerde cellen te identificeren en helder veld microscopie om fagosomen te detecteren.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Leer hoe cholesterol de opname van Cryptococcus neoformans door macrofagen beïnvloedt via methyl beta cyclodextrin-depletie en microscopische analyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van fungale pathogenese.

Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van

Meer video's verkennen