Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Het algemene doel van deze procedure is om de eiwitexpressieprofielen van vloeibare en vaste tumoren te verduidelijken. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen uit bloed of weefselmonsters van patiënten te verrijken. In de tweede stap worden eiwitten uit de kankercellen geïsoleerd en vervolgens gemengd met een tumorspecifieke susac-kwantificeringsstandaard.

In de laatste stap wordt het eiwitmengsel verteerd. Uiteindelijk wordt massaspectrometrie gebruikt om de eiwitexpressieprofielen van vloeibare en vaste tumoren te tonen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het oncologie- en pathologiegebied te beantwoorden, zoals hoe kunnen doelwitten voor geneesmiddelen en mechanismen van therapieresistentie worden geïdentificeerd?

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontdekking van biomarkers, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het onderzoek naar diverse, vaste en vloeibare kankersoorten. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Hannibal Berger Institute for Pathology en Dr.Christophe Lanz van mijn laboratorium Om vloeibare tumorcellen voor fluorescente sortering door stromcytometrie voor te bereiden, begint u met het citeren van een milliliter van het humane mononucleaire celmonster opgehangen in PBS plus 2%FBS voor de negatieve controle, en een milliliter voor elke fluorescente kleurstof die in de uiteindelijke kleuring wordt gebruikt. Vervolgens incubeert u de cellen met de juiste antilichamen voor het isoleren van de leukemiecellenpopulatie en voor de compensatiecontroles op ijs.

Na 30 minuten, wast u de cellen tweemaal met PBS plus 2%FCS. Voeg vervolgens een celviabiliteitskleuring toe aan de geschikte buisjes en sorteert u de cellen volgens het schema. Verzamel de monsters in IMDM plus 10%FCS om vaste tumoren te verzamelen door middel van laser capture microdissectie.

Gebruik eerst een microtoom om vijf tot 10 micrometer dikke secties te snijden uit formine-gefixeerde paraffine-ingesloten monsters. Monteer vervolgens de secties op met film bedekte membraanslides en droog de monsters gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Deparizeer en rehydrateer de secties door opeenvolgende incubaties van één minuut in xyleen, absoluut ethanol, 70%ethanol en water.

Vervolgens kleurt u de secties met hematien gedurende 20 seconden. Spoel ze af met kraanwater en verzamel de interessante cellen met het laser capture microdissectie systeem om eiwit uit de gesorteerd vloeibare tumorcellen te extraheren. Centrifugeer het monster drie keer, waarbij de cellen worden gewassen in 500 microliters koud PBS tijdens de tweede twee centrifugaties.

Vervolgens incubeert u de cellen in 40 microliters lysatbuffer per een maal 10 tot zes cellen. Na 15 minuten centrifugeert u het lysaat en brengt u het heldere lysaat bevattende supernatant over naar een nieuw reactiebuisje om eiwit uit de micro gedissekteerde vaste tumorcellen te extraheren. Incubeer het weefselmonster met 60 microliters weefsel lysis buffer bij 72 graden Celsius.

Na 15 minuten verzamelt u het vocht door een korte centrifugatie en brengt u het supernatant over naar een nieuw reactiebuisje. Soniceer vervolgens het lysaat op ijs gedurende drie minuten, gevolgd door een incubatie met 15 microliters met 20% natrium ESAL sulfaat bij 99 graden Celsius in een verwarmingsblok met 600 RPM agitatie. Na één uur centrifugeert u het lysaat en brengt u de S natin over naar een nieuw buisje.

Bepaal vervolgens de eiwitconcentraties van de verhelderde cellulaire en super SLAC standaard, en meng vervolgens gelijke hoeveelheden van de tumorcelstukjes met super SLAC standaard, gevolgd door lithium. Doe desal sulfaatbuffer bij 25% van het monstervolume en reducerend middel bij 10% van het monstervolume. Verwarm vervolgens de resulterende oplossing gedurende 10 minuten bij 72 graden Celsius in een verwarmingsblok.

Om de eiwitconcentratie van het vaste tumorlysaat op een platelezer te meten, mengt u een standaard runderserumalbumine verdunningsoplossingsserie, het lysaat en de geschikte super SLAC standaard met een commercieel verkrijgbare eiwitanalyse en een 96-wellplaat. Na één minuut schudden, incubeert u het monster gedurende de juiste tijdsduur en meet u de absorptie zoals aangegeven door de fabrikant. Meng vervolgens gelijke hoeveelheden van opgehelderde lysaat en de super SLAC standaard met 200 microliters ureum in een filtereenheid en centrifugeert u de monsters gedurende 30 minuten.

Om de tumorcellysaten te analyseren door middel van vloeistofchromatografie en massaspectrometrische analyse. Begin door de peptiden van belang in 30 microliters laadbuffer gedurende vijf minuten in een sonicatiebad op te lossen. Centrifugeer vervolgens het eiwit en breng het heldere supernatant over in een mass spectrometrische autosamplerbuisje.

Injecteer vervolgens vijf microliters monster per analyse in het nano lc, ms MS systeem autosampler, en concentreer en ontzout de peptiden online in een omgekeerde fase C 18 voorgemonteerde en geventileerde kolomopstelling. Scheid ten slotte de peptiden op een omgekeerde fase C 18 microkolom in een zelfgestuurde nanospray kolom. Gebruik een 90-minutengradiënt van vijf tot 35% acetyl nitrile versus 0,1% aqueus mierenzuur bij 300 nanoliters per minuut, en gebruik vervolgens een nanospray ionenbron om de peptiden over te brengen en te analyseren.

Met behulp van een top 15 data-afhankelijke acquisitiemethode kunnen verschillende soorten massaspectrometers worden gebruikt voor het analyseren van de peptiden. Proteomische profilering van vloeibare en vaste tumoren van patiënten is een veelbelovende benadering voor de ontdekking van nieuwe diagnostische en voorspellende biomarkers. Bijvoorbeeld, deze eerste figuur toont een voorbeeld van een gating strategie voor het isoleren van CD een 17 kleurstoffen, leukemiecellen uit een vloeibare tumormonster.

Terwijl hier een vijf tot tien micrometer dikke sectie wordt gemonteerd op met film bedekte membraanslides zoals net is gedemonstreerd. Zoals getoond, werd een gebied van belang handmatig geselecteerd en uitgesneden door laser capture microdissectie, onbegeleide clusteranalyse van de eiwitexpressieprofielen van vloeibare en vaste tumormonsters kan vervolgens worden uitgevoerd door massaspectrometrie, waardoor de duidelijke scheiding van de verschill