Name: Mechanische vatverwonding in zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer mechanische vatverwonding in zebravis embryo's voor hemostaseonderzoek met Danio rerio. Deze methode maakt real-time microscopie van wondgenezing en ontsteking mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs. Stephen Wilson en Lisa Wilsbacher bedanken voor de nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH HL054737.

OPMERKING: De procedures met behulp van zebravis werden goedgekeurd door UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van Gereedschap <ol><li> Steek minutia pin in een penhouder en klem de pin. </li><li> Met behulp van fijne punt tang, buig de punt van de pen om een ​​lichte haak te creëren. </li><li> Voor manipulatie en stabilisatie van het embryo tijdens blessure, buig het einde van een 28 gauge ½ inch naald gemonteerd op een insulinespuit behulp punttang. </li></ol> 2. Voorbereiding van de zebravis embryo&#39;s voor letsel <ol><li> Opgezet zebravis broedparen en het verzamelen van eieren in ei water (60ug / ml aquarium zouten) zoals eerder 22 getoond. </li><li> Voeg 0,003% N-fenylthioureum (PTU) om het ei water wanneer de embryo&#39;s zijn ongeveer 8 uur na de bevruchting (HPF) om melanisatie voorkomen. </li><li> Dechorionate twee dagen na de bevruchting (DPF) embryo&#39;s voorafgaand aan het experiment met behulp van fijne punt tang. <br/&gt; OPMERKING: Embryo&#39;s kunnen op elk moment worden gewond na circulatie begint. De hier gepresenteerde gegevens voor 2 dpf embryo, maar de techniek is met succes toegepast in embryo tot 5 dpf. </li><li> Verdoven het embryo met 0,02% gebufferde 3-aminobenzoëzuur (tricaïne) ongeveer 10 min voor manipulaties. </li></ol> 3. mechanische Vessel Letsel van embryo&#39;s <ol><li> Transfer narcose embryo&#39;s tot een depressie dia op een dissectie stereomicroscoop met behulp van een transfer pipet. </li><li> Met behulp van de korte platte kant van de naald naar het embryo met de dominante hand te manipuleren, de positie van de embryo op zijn kant met het ventrale oppervlak afgekeerd van de naald. </li><li> Plaats de munitia pin met de tip wees direct tegen het ventrale oppervlak van de vis posterior naar de urogenitale opening. Plaats de minutia pen onder een lichte hoek zodat de gebogen tip rechtstreeks kan doorboren de periderm in de staartader (figuur 1 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Met behulp van de naald aan het embryo te manipuleren, doorboren de caudale ader met de minutia pin door het embryo te tikken in de pen om iets te haken de pin in de ader. </li><li> Met behulp van de naald, trek het embryo uit de buurt van de minutia pin om een ​​klein scheurtje in het vat te maken. OPMERKING: Een succesvolle letsel zal leiden tot onmiddellijke bloeden uit de ader. </li></ol> 4. Analyse van Hemostasis <ol><li> Kies alleen embryo&#39;s met zichtbaar circulerende bloedcellen voor deze procedure. </li><li> Bereid de timer zodra de minutiae pen wordt getrokken uit het vat begint. </li><li> Start de timer zodra bloedverlies gevisualiseerd worden uit de wond. Wanneer bloedverlies uit de wond ophoudt, stopt de timer en noteer de totale tijd als Bloeden Time. Als coagulatie wordt geremd, om de tijd wanneer er niet langer zichtbaar circulerende bloedcellen. </li></ol> 5. Analyse van de Wound Healing <ol><li> Transfer post-letsel dieren op glazen bodem beeldvorming gerechten voor microscopie. </li><li> Verwijder het merendeel van het ei water. </li><li> Bedek de embryo&#39;s in 0,3-1,2% laag smeltpunt agarose opgelost in ei water, verwarmd tot tussen de 42 en 45 ºC en aangevuld met 0,02% tricaïne. </li><li> Plaats embryo op hun kant behulp van een tang. </li><li> Na de agarose afkoelt, vul de schaal met 0,02% tricaïne in ei water. </li><li> Verwerven van beelden met behulp van helderveld, epifluorescentie of confocale microscopie. </li><li> Verwijder embryo uit de agarose behulp van een tang en transfer terug naar ei water. </li></ol>

<ol><li>Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGore%2C+AV+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22">Cold Spring Harb Perspect Med</a>. 2 (5), a006684(2012).</li>
<li>Boatman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+hematopoiesis+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Assaying hematopoiesis using zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).</li>
<li>Ellett, F., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+organism+to+study+development+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model organism to study development of the immune system.</a> Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).</li>
<li>Lieschke, G. J., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fish immunology.</a> Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound repair.</a> Semin Immunol. , (2014).</li>
<li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-inflicted+injury+of+zebrafish+embryonic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (71), e4351(2013).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).</li>
<li>Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibrinogen+in+zebrafish+results+in+symptoms+consistent+with+human+hypofibrinogenemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia.</a> PLoS One. 8 (9), e74682(2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+zebrafish+antithrombin+III+triggers+disseminated+intravascular+coagulation+and+thrombosis%2C+revealing+insight+into+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemophilia+model+in+zebrafish%3A+analysis+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis.</a> Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+genetic+model+for+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis.</a> J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev Biol. 7, 48(2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).</li>
<li>Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fibrin+formation+and+platelet+and+endothelial+cell+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).</li>
<li>Bielczyk-Maczynska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+screen+of+identified+genome-wide+association+study+Loci+reveals+new+genes+controlling+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Zebravis zijn met succes gebruikt als model voor verschillende soorten wonden waaronder laser verwonding 13-15, laser geïnduceerde trombose 16 en epitheliale 10 verwonden. Wij rapporteren een methode mechanische verwonding die eenvoudig uit te voeren en geeft een gecontroleerde letsel bij een in vivo model dat zeer vatbaar realtime microscopie. Letsel heeft een snelle en meetbare hemostatische reactie en reproduceerbare wondherstel programma dat kan worden gevolgd met video en t...

Zebravissen zijn uitgebreid gebruikt om een verscheidenheid aan onderwerpen in de vasculaire biologie te bestuderen, waaronder vasculaire ontwikkeling, angiogenesis en hematopoietische ontwikkeling en pathologie1-3. Embryo's ontwikkelen een functionele circulatie evenals leukocyten en andere componenten van het aangeboren immuunsysteem binnen 1 dag na bevruchting (dpf) 1,4,5. De conservering van de inflammatoire en leukocytaire respons op verwonding heeft het zebravis-embryo tot een informatief model gemaakt voor diverse inflammatoire processen zoals tuberculeuze infectie, enterocolitis en weefselregeneratie6-9. Zebravis-embryo's zijn gebruikt om verwondinggerelateerde ontstekingen te bestuderen, met name in de context van epitheelverwonding en de neutrofielrespons10,11. Verwonding van het embryo resulteert in een sterk geconserveerde cellulaire respons van cellen op de verwondingsplaats en de aangeboren immuuncellen die worden gerekruteerd om op de verwonding te reageren en de resolutie ervan te reguleren11,12. Andere verwondingsmodellen hebben gefocuste laserpulsen gebruikt om verwonding ruimtelijk te lokaliseren naar specifieke celtypen, waaronder neuronen, spiercellen en cardiomyocyten13-15. 
Zebravis-embryo's zijn gebruikt als model om hemostase en trombose te bestuderen in omstandigheden van farmacologische en genetische manipulatie, met behulp van zowel mechanische als laser-geïnduceerde trombusvorming16-19. Componenten van de coagulatiecascade lijken goed geconserveerd te zijn en transgenen hebben gedetailleerde studies mogelijk gemaakt van trombocyten- en fibrinedeposities op de plaats van coagulatie17,20,21. De procedure gepresenteerd in dit artikel complementeert deze methoden door een systeem te bieden voor het bestuderen van mechanische vaatbeschadiging die resulteert in vaatbreuk, trombusvorming en resolutie, en vaatreparatie.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Agarose</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>Voorgeverfd tot 42 &ordm; C</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom imaging dishes</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium salts</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe with 28.5 G needle</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>329461</td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebravisembryo's (Danio rerio) hebben zich bewezen als een krachtig model voor het bestuderen van een verscheidenheid aan ontwikkelings- en ziekteprocessen. Externe ontwikkeling en optische transparantie maken deze embryo's bijzonder geschikt voor microscopie, en er zijn talrijke transgene lijnen die specifieke celtypen labelen met fluorescerende eiwitten, waardoor de zebravisembryo een ideaal systeem is voor het visualiseren van de interactie van vasculaire, hematopoietische en andere celtypen tijdens letsel en reparatie in vivo. Voorwaartse en omgekeerde genetica in zebravis zijn goed ontwikkeld, en farmacologische manipulatie is mogelijk. We beschrijven een mechanisch vasculair letselmodel dat gebruikmaakt van micromanipulatietechnieken en dat verschillende van deze kenmerken benut om reacties op vasculair letsel te bestuderen, inclusief hemostase en bloedvatreparatie. Met behulp van een combinatie van video- en timelapse-microscopie tonen we aan dat deze methode van vasculair letsel resulteert in meetbare en reproduceerbare reacties tijdens hemostase en wondreparatie. Deze methode biedt een systeem voor het bestuderen van vasculaire letsels en reparatie in detail in een volledig dierenmodel.

Mechanische vaatletsel werd uitgevoerd op 2 dpf embryo (Figuur 2A - C). Letsel leidt tot een snelle en betrouwbare coagulatie respons, zoals gemeten door de tijd om het stoppen bloedingen (figuur 2D). Om te bepalen of verschillen in de coagulatie reactie meetbaar is het antistollingsmiddel hirudine toegediend aan het embryo door injectie in het kanaal van Cuvier onmiddellijk voor verwonding (5-10 nl van 1 eenheid per pl hirudine opgelost in water) (voor demonstratie van...

Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het veroorzaken van een mechanische vaatbeschadiging in zebravisembryo's. Dit wordt bereikt door de caudale vene van het zebravisembryo door te prikken met een fijne speld. Vervolgens wordt de hemostase beoordeeld door de tijd te meten dat er actief bloed uit de wond stroomt.Vervolgens wordt time-lapse microscopie uitgevoerd om aspecten van wondgenezing, zoals vaatreparatie, te visualiseren. De resultaten tonen aan dat mechanisch vaatletsel in zebravissenembryo's kan worden gebruikt om aspecten van hemostase en wondherstel, zoals bloedingstijden en de tijd die nodig is om de bloedstroom te herstellen, reproduceerbaar te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van muizen en andere standaardletselmodellen is dat ontsteking, hemostase en herstel in het zebravissenembryo eenvoudig kunnen worden gevisualiseerd met behulp van real-time microscopie.Begin met het plaatsen van een minutia-pin in een pinhouder en klem de pin vast met een fijne pincet. Buig de punt van de pin voorzichtig om een kleine haak te maken, waarmee het embryo tijdens de beschadiging kan worden gemanipuleerd en gestabiliseerd. Gebruik een combinatietang om het uiteinde van een 28 gauge, 1/2 inch naald op een insulinespuit te buigen.Bereid vervolgens zebravisembryo's voor door fokparen samen te stellen en eitjes op te vangen in eitjeswater, zoals eerder beschreven. Wanneer de embryo's een stadium van acht tot 24 uur na bevruchting of HPF bereiken, voegt u PTU toe aan het eitjeswater om pigmentatie te voorkomen. Gebruik bij twee dagen na bevruchting of DPF een fijne pincet om de chorionlaag van de embryo's te verwijderen; anesthetiseer de embryo's met een eindconcentratie van 0,02% gebufferd tricaine om de embryonale bloedvaten mechanisch te beschadigen.Gebruik een transferpipet om de geanestheseerde embryo's op een concave objectglas te plaatsen. Terwijl u aan een dissectiemicroscoop werkt met de korte, platte zijde van een injectienaald in de dominante hand, positioneert u het embryo op zijn zijde met het ventrale oppervlak van de naald afgekeerd. Plaats nu de minutia-pin zodanig dat de punt direct tegen het ventrale oppervlak van de vis rust, posterior van de urogenitale opening.Houd het in een lichte hoek, zodat de gebogen punt door het periderm direct in de coddle-ader kan dringen. Gebruik vervolgens de naald van de spuit om het embryo te manipuleren. Gebruik de minutia-pin om de coddle-ader door te prikken door het embryo tegen de pin aan te tikken, zodat de pin met de injectienaald lichtjes in de ader wordt gehaakt.Trek het embryo weg van de minutia-pin om een kleine scheur in het bloedvat te veroorzaken. Een succesvolle beschadiging resulteert in onmiddellijke bloeding uit de ader. Kies voor deze procedure alleen embryo's met zichtbaar circulerende bloedcellen.Terwijl de minutia-pin op zijn plaats blijft, trekt u deze uit het vat en start u een timer zodra het bloedverlies uit de wond zichtbaar is. Wanneer het bloedverlies uit de wond stopt, stopt u de timer en noteert u de totale tijd als de bloedingsduur; indien de coagulatie is geremd, noteert u het tijdstip waarop er geen zichtbaar circulerende cellen meer zijn. Plaats de dieren na de verwonding in glazen imaging-schaaltjes voor microscopie en verwijder het grootste deel van het eitjeswater, waarna u de embryo's bedekt met 0,3 tot 1,2% low-melting agarose, aangevuld met 0,02% trica en verwarmd tot tussen 42 en 45 °C.Gebruik een pincet om de embryo's op hun zijde te positioneren. Nadat de aro is afgekoeld, vult u het schaaltje met 0,02% trica in eierwater. Gebruik brightfield epi-fluorescentie of confocale microscopie om beelden vast te leggen na de beeldvorming.Gebruik een pincet om de embryo's terug te plaatsen in het eierwater. Deze video toont een mechanische vaatbeschadiging die is uitgevoerd op een 2D PF-embryo. Er is actieve bloedverlies zichtbaar, gevolgd door een stopzetting van de bloeding; de beschadiging resulteert in een snelle en betrouwbare stollingsrespons, gemeten aan de hand van de tijd tot stopzetting van de bloeding, om te bepalen of er verschillen in de stollingsrespons gemeten konden worden.Het antistollingsmiddel odin werd aan de embryo's toegediend via injectie in het vat van QVA vlak voor het toebrengen van de wond. Zoals hier getoond, verhoogde het middel de bloedingstijd significant vergeleken met de vehicle-controle. In deze video is direct na het letsel bewijs van vaatschade en stolling te zien met behulp van transgene lijnen voor endotheliale markers en rode bloedcelmarkers.Er werden elke vijf minuten beelden vastgelegd gedurende een periode van 12 uur, waarop de verschillende stadia van wondherstel te zien zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een mechanische beschadiging veroorzaakt in zebravisembryo's.

mechanical-vessel-injury-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo's met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Het doel van dit protocol is om een nieuwe methode voor de beoordeling van de segmentale cardiale functie bij embryonale zebravissen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden te beschrijven.

Verplaatsinganalyse van Myocardiale mechanische vervorming (DIAMOND) onthult segmentale heterogeniteit van cardiale functie bij embryonale zebravis

We hebben het Marmarou-gewichtsverliesmodel voor volwassen zebravissen aangepast om een breed scala aan pathologieën te onderzoeken na traumatisch hersenletsel met stompe kracht (TBI) en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de daaropvolgende neuronale regeneratie. Dit Botte kracht TBI-model is schaalbaar, induceert een milde, matige of ernstige TBI en vat heterogeniteit van letsel samen die wordt waargenomen bij menselijke TBI.

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Dit protocol schetst een methode voor het enten van een magnetische kraal in het zich ontwikkelende zebravishart door middel van microchirurgie, waardoor mechanische krachten in vivo kunnen worden gemanipuleerd en mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom in endocardiale cellen kan worden geactiveerd.

Mechanische krachten manipuleren in het zich ontwikkelende zebravishart met behulp van magnetische kralen

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Leer mechanische vatverwonding in zebravis embryo's voor hemostaseonderzoek met Danio rerio. Deze methode maakt real-time microscopie van wondgenezing en ontsteking mogelijk.

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo's

Meer video's verkennen