Name: Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij Ex Vivo Flowcytometrie en Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer ex vivo validatie van in vivo NIRF-beeldvorming in muizen met xenografttumoren met behulp van gelabelde nanobodies en antilichamen. Deze methode combineert flowcytometrie en microscopie voor betrouwbare bevestiging van beeldvormingsresultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de graduate school &#39;Ontsteking en regeneratie&#39; van de Collaborative Research Centre 841 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), door de Collaborative Research Centre 877 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , door de Werner Otto Foundation (Peter Bannas), door de Wilhelm Sander Foundation (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), en door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag en Friedrich Koch-Nolte). Wij danken de University Cancer Center Hamburg (UCCH) In vivo Optical Imaging Core Facility en het personeel van UKE voor overleg en hun hoge kwaliteit service. De Core Facility werd mede ondersteund door subsidies van Deutsche Krebshilfe (German Cancer Aid).

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen over de ethische gebruik van dieren en werden goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn begaan van het Universitair Medisch Centrum, Hamburg. 1. Bereiding van tumorcellen, muis en antilichaamconstructen <ol><li> Voorbereiding van lymfoom cellen en aliquoting van Basement Matrix (Matrigel). <ol><li> De dag voor de injectie van tumorcellen zet een gesteriliseerde tip doos (1.000 III tips) en de juiste pipet in de -20 ° C vriezer. </li><li> Ontdooi de fles met de kelder matrix op ijs in het 4 ° C koelkast O / N. </li><li> Op de dag van de injectie te vullen een ijsemmer en plaats de kelder matrix samen met pipet, tips, en 1 ml spuiten met 30 G naalden op ijs. </li><li> Aliquot lymfoom cellen in een volume van 100 pl RPMI medium in 1,5 ml microcentrifuge buizen en meng voorzichtig met 100 ul van de kelder matrix. Opstellen in de pre-gekoeldespuiten en op ijs gezet totdat injectie. OPMERKING: Gebruik een goede steriele techniek en te werken op het ijs de hele tijd om verstopping van de kelder matrix te voorkomen. </li></ol></li><li> Muizen Voorbereiding <ol><li> Gebruik 8-10 weken oude athymische naakt muizen (NMRI- Foxn1 n u). </li><li> Ter vermindering autofluorescentie van de darm houden muizen op een alfalfa dieet gedurende 1 week voor in vivo beeldvorming. </li><li> Voor injectie van lymfoom cellen verdoven muizen te bewerkstelligen met 2% isofluraan in een inductie kamer. Handhaaf 1-2% isofluraan voor de duur van de procedure met een isofluorane verdeelstuk. </li><li> Injecteren lymfoom cellen subcutaan in de schouder flanken. Voor direct intra-individuele vergelijking injecteren antigeen-positieve en antigeen-negatieve cellen aan de rechter- en linkerkant, respectievelijk. <ol><li> Gebruik een duim en wijsvinger op de huid van de muis knijpen en trek deze uit de buurt van het lichaam van de muis. Injecteer langzaam en gelijkmatig inhet zakje door de vingers, waardoor een cluster cellen onder de huid. De kelder matrix helpt houden geïnjecteerde cellen op zijn plaats. </li></ol></li></ol></li><li> Voorbereiding van antilichaamconstructen <ol><li> Label monoklonale antilichamen en enkel domein nanobodies met een commercieel verkrijgbaar eiwit labeling kit voor de fluorescente kleurstof AlexaFluor-680 (AF680) (excitatie golflengte = 679 nm, emissiegolflengte = 702 nm) volgens instructies van de fabrikant. Bereken het aantal kleurstoffen per Nanobody en conventionele antilichamen met molaire extinctie coëfficiënt van 15720 mol -1 cm -1 en 203.000 mol -1 cm -1, respectievelijk. Beoordeel de zuiverheid van antilichaamconstructen door SDS-PAGE grootte fractionering en Coomassie brilliant blue vlek. </li><li> Zorg ervoor dat de specificiteit van de gemerkte conjugaten door het uitvoeren van een serie van in vitro experimenten voordat de eigenlijke imaging studies. Test de specificiteit van het label eentibody construeert in vitro door middel van het blokkeren van studies en aspecifieke isotypecontroles 8,20. LET OP: In stap 1.2.4 mobiele nummers voor antigeen-negatieve en antigeen-positieve cellen (of verschillende cellen lijnen) kan worden aangepast volgens verschillende groeicijfers. Voor deze experimenten werden 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 negatieve en 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 positieve cellen gebruikt om tumoren van vergelijkbare grootte te verkrijgen. In stap 1.3.1 het proces van etikettering en de etikettering werkzaamheid van antilichaam sondes met fluoroforen kan verschillen door de etikettering kit gebruikt. </li></ol></li></ol> 2. In vivo beeldvorming <ol><li> Na 7-9 dagen, als de tumoren bereikt ~ 8 mm Injecteer 50 ug AlexaFluor680 gemerkt antilichaam constructen in een volume van 200 pi zoutoplossing intraveneus in de staartader van de muis (mAb-AF680 50 ug met 2 kleurstoffen / molecuul ≈ ~ 4 ^ 14 fluorchromen ≈ ~ 0,8 ug fluorchromen; Nanobody-AF680: 50 μg met 0,3 kleurstoffen / molecuul ≈ ~ 5,6 ^ 14 fluorchromen ≈ ~ 1,1 ug fluorochromen). </li><li> Initialiseer de imaging-systeem en verdoven muizen te bewerkstelligen met 3% isofluraan met behulp van een XGI-8 anesthesie-systeem in de inductie kamer voorafgaand aan de beeldvorming. Handhaaf 1-2% isofluraan voor de duur van de beeldopname met de isofluraan verdeelstuk ondergebracht in de beeldvorming kamer. <ol><li> Plaats muizen op verwarmde afbeeldeenheid met tumoren gericht naar de camera. Toezien op de juiste verdoving door knijpen de teen of de staart van het dier; enige reactie van het dier aangeeft dat verdoving te licht. </li><li> Bewaken van de ademfrequentie; de verdoving is te licht als de ademhaling wordt verhoogd en te diep als de ademfrequentie wordt verlaagd, diep of onregelmatig. Bescherm hoornvliezen dier met een oogzalf tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose. </li></ol></li><li> Kies fluorescerende filter sets van 615-665 nm voor excitatie, 695-770 nm voor EMISSIESn, en 580-610 nm excitatie voor achtergrond aftrekken met een 51 2x 512 pixelmatrix grootte. Stel belichtingstijd op auto, pixel binning aan middelgrote en F / Stoppen om 2. OPMERKING: Kortere sluitertijden maken snellere framerates; langere belichtingstijden grotere gevoeligheid. Binning regelt de pixelgrootte van de CCD camera. Het verhogen van de binning vergroot de pixelgrootte, gevoeligheid en frame rate, maar vermindert ruimtelijke resolutie. F / Stop stelt de grootte van de opening cameralens. Het diafragma grootte regelt de hoeveelheid licht gedetecteerd en de diepte van field.Note die instellingen kunnen verschillen door beeldvorming apparaat en experimentele set-up. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor een optimaal resultaat. <ol><li> In de imaging software belichting optimaliseren tijd, F / stop en pixel binning op basis van de expressie van de cellijn. Wijzig deze instellingen op elk moment tijdens een experiment zonder impact op het kwantitatieve resultaat. Als alternatief, laat de Imaging Wizard software automatisch te bepalende parameters. </li></ol></li><li> Afbeelding muizen vóór de injectie en 6 uur na injectie van antilichaamconstructen. OPMERKING: De etikettering werkzaamheid kan de vereiste dosis die nodig is voor een optimale beeldvorming resultaten beïnvloeden. Daarom is de hoeveelheid benodigde antilichaam-construct voor optimale beeldvorming resultaat moet empirisch worden bepaald. Het variabel etikettering werkzaamheid en de grootte van het construct en de tumormodel en de doelwit-antigeen expressie. </li></ol> 3. Oogst en Voorbereiding van tumoren <ol><li> Vul een emmer en plaats 4% paraformaldehyde (PFA) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) / proteaseremmer (AEBSF) en PBS / 0,2% runderserumalbumine (BSA) op ijs. </li><li> Nadat de opnamesessie voltooid, verhogen de concentratie van isofluraan tot 4%. Na het dier ophoudt ademhaling, haal hem uit de beeldvorming podium en het uitvoeren van cervicale dislocatie. </li><li> Mount muis op een piepschuim blok en spray met 70% ethanol. </li><li> Gebruik schaars en een tang om de buitenste huid gesneden en trek het voorzichtig terug naar tumoren bloot. Verwijder tumoren met scalpel waarborgen tumorweefsel intact. </li><li> Cut tumoren in de helft met behulp van een scalpel. Plaats een halve in een verzamelbuis met PBS / AEBSF voor FACS analyse en de andere helft in een 50 ml buis met 4% PFA voor immunohistochemie. </li><li> Voorbereiding voor immunohistochemie <ol><li> Houd tumoren in 4% PFA in de koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur. Breng tumoren een buis met PBS / 30% sucrose en in de koelkast bij 4 ° C totdat de tumor zinkt naar de bodem van de buis. </li><li> Snijd de tumoren in de juiste stukken voor de cryomolds. Doe de tumoren in cryomolds en vul met oktober verbinding, zodat de tumoren zijn gedekt. </li><li> Zet mallen op droog ijs en wacht tot de verbinding is volledig bevroren. Transfer bevroren tumoren tot -80 ° C vriezer en op te slaan voor immunohistochemie. </li><li> Cut bevroren tumoren in delen van 8 urn met een microtoom. Gebruik standaard immunohistochemischechemie protocol te kleuren met antilichaam tegen CD31-AF488 aan bloedvaten en diamidino-fenylindool (DAPI) visualiseren om kernen te visualiseren. OPMERKING: Tumor secties zijn zeer gevoelig voor licht als ze fluorescerend gemerkte antilichamen bevatten al. Blootstelling minimaliseren zoveel mogelijk aan licht. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor FACS-analyse <ol><li> Plaats petrischaal op ijs en verwijder de plunjer van een injectiespuit 2,0 ml. Doe de tumor in de cel zeef en snijd hem voorzichtig in 3-4 stukken met behulp van een scalpel. Giet de eerste PBS in de petrischaal en gebruik het platte uiteinde van de plunjer aan de tumor mash binnen de cel zeef. </li><li> Spoel de cel zeef met de eerste PBS te wassen alle cellen met een pipet 10 ml. Overdracht celsuspensie in een nieuwe buis en rotatie bij 500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS / 0,2% BSA. Tellen cellen. </li><li> Aliquot 1-5 x 10 6 lymfoom cellen in een 5 ml FACS buis. Spin cellen weer (500xg), gooi supernatant en resuspendeer in 100 ul PBS / 0,2% BSA. </li><li> Eventueel blok FcR met een anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2) die bindt aan FcyR op ijs gedurende 10 min. Was de cellen eenmaal met PBS / 0,2% BSA. </li><li> Voeg anti-CD45-mAb aan leucocyten van andere cellen onderscheiden. Incubeer gedurende 20 min op ijs in het donker, gevolgd door twee wassen met PBS / 0,2% BSA. </li><li> Vlak voor FACS analyse vlek met propidiumiodide gedurende 15 min op ijs om de dode cellen, gevolgd door twee wassen met gewoon PBS onderscheiden. Resuspendeer in 150 pi voor FACS-analyse. LET OP: In stap 3.7.4 en stap 3.7.5 andere antilichamen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de tumor entiteit. </li></ol></li></ol> 4. FACS analyse <ol><li> Gebruik een reeks van gating tools waarmee u de poort van de bevolking van belang in de vorm van grote spreiding, discriminatie doublet, uitsluiting van dode cellen, gating voor CD45 positieve cellen, en gating voor antigeen-positieve cellen. <ol><li> Op het eerste, de poort uit celpuin in een voorwaartse verstrooiing (FSC-A) versus zijwaartse verstrooiing (SSC-A) met behulp van een twee-parameter plot. Volgende discard cel wambuizen. Tot slot, poort uit non CD45-antigeen-positieve (CD45) en dode / stervende cellen (LD - levend / dood-vlek). </li></ol></li><li> Neem monsters met dezelfde sjabloon voor alle experimenten. OPMERKING: Raadpleeg het protocol van de fabrikant voor technisch advies over het gebruik van hardware en analytische software. </li></ol> 5. microscopisch onderzoek <ol><li> Analyseren in lood tumor cryocoupes met behulp van een confocale microscoop met een olie-immersie lens (40x objectief). Gebruik een He-Neon 633 nm laser excitatie van AF680, een Argon laser voor AF488, en een 405-Diode voor DAPI. </li><li> Verwerk de ruwe beeldgegevens met behulp van een software compatibel is met de microscoop. Voeren achtergrond-correctie en ruisfilter indien nodig. Voeren aanvullende aanpassingen afbeelding zoals snijden, bijsnijden evenals de helderheid en het contrast aanpassen. <ol><li> Eindelijk geafbeelding van een enkele samengestelde overlay nerate uit alle detectie kanalen. Pas de helderheid en het contrast van de afzonderlijke lagen. De samengestelde beelden zal lokalisatie van cellen (DAPI-vlek, blauw), de distributie van gelabeld antilichaam constructen (AF680-vlek, rood) en bloedvaten (AF488-vlek, groen) zien. </li></ol></li></ol> 6. In vivo beeldvorming Analysis <ol><li> Open beeldbestanden in imaging software en maak een overlay-afbeelding van beeldgegevens foto te combineren met het fluorescentie data. Optimaliseer beeldweergave door het verwijderen van weefsel autofluorescentie achtergrond signaal van de specifieke fluorescente signaal. Dit kan gedaan worden door het aftrekken van de verworven met een achtergrond filter instellen van de ervaring met de set die specifiek zijn voor de tracer filter afbeelding afbeelding. </li><li> Tekenen identieke cirkelvormige meetgebieden van belang (ROI) rond de antigeen-positieve tumor het antigeen-negatieve tumor. Om achtergrond signaalintensiteit bepalen, plaatst een cirkelvormige ROIin een gebied van het dier waar fluorescentiesignaal laag zal zijn (bijvoorbeeld achterpoot). <ol><li> Gebruik dezelfde ROI voor alle dieren op alle tijdstippen. Voor het plaatsen, gebruik fotografische zwart-wit beelden van de tumor marges te identificeren. </li></ol></li><li> Weergave ROI gegevens in een meettafel. Gebruik gemiddelde stralende efficiëntie gegevens, die een meer kwantitatieve vergelijking van fluorescente signalen voor verdere statistische analyses mogelijk maakt. <ol><li> Display en vergelijken van gegevens als absolute signaalintensiteiten of bereken de signaal-achtergrond verhouding met behulp van gemeten ROI-gegevens van gerichte weefsel en achtergrond weefsel. Bereken de tumor-tot-achtergrond verhouding van de tumoropname waarde door de achtergrondwaarde bepaald uit de achterste ledematen delen. </li><li> Als controles werden ook geanalyseerd antigeen-negatieve en antigeen-positieve tumoren in dezelfde dieren als ingespoten met gemerkte isotype controles om de specificiteit van signalen in vivo te evalueren. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies+from+llama+effectively+and+specifically+block+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo.</a> FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monoclonal+antibody+detects+a+developmentally+regulated+mouse+ecto-ADP-ribosyltransferase+on+T+cells%3A+subset+distribution%2C+inbred+strain+variation%2C+and+modulation+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation.</a> J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetic+immunization+to+raise+antibodies+recognizing+toxin-related+cell+surface+ADP-ribosyltransferases+in+native+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation.</a> Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+and+specificity+of+toxin-related+mouse+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+depends+on+its+association+with+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts.</a> Blood. 105, 3663-3670 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+magnetic+resonance+imaging+of+enzyme+activity+on+the+cell+surface%3A+in+vitro+and+in+vivo+monitoring+of+ADP-ribosyltransferase+2+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells.</a> Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+toxin-related+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+sensitizes+T+cells+but+not+B+cells+to+NAD-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death.</a> Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).</li>
<li>Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+nomenclature+for+mammalian+ADP-ribosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases.</a> Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+targeting+of+T+cells%3A+comparison+of+nanobodies+and+conventional+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies.</a> Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).</li>
<li>Scheuplein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%2B+and+ATP+released+from+injured+cells+induce+P2X7-dependent+shedding+of+CD62L+and+externalization+of+phosphatidylserine+by+murine+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells.</a> J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).</li>
<li>Vaneycken, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+screening+of+anti-HER2+nanobodies+for+molecular+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.</a> FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).</li>
<li>Xavier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+preclinical+validation%2C+dosimetry%2C+and+toxicity+of+68Ga-NOTA-anti-HER2+Nanobodies+for+iPET+imaging+of+HER2+receptor+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer.</a> J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).</li>
<li>Tchouate Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Between+Epidermal+Growth+Factor+Receptor-Specific+Nanobody+Uptake+and+Tumor+Burden%3A+A+Tool+for+Noninvasive+Monitoring+of+Tumor+Response+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy.</a> Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).</li>
<li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+labelling+of+an+anti-epidermal+growth+factor+receptor+Nanobody+with+68Ga+via+a+novel+bifunctional+desferal+chelate+for+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumors+with+nanobodies+for+cancer+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy.</a> Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optical+imaging+of+human+breast+tumour+xenografts+using+anti-HER2+VHHs+site-directly+conjugated+to+IRDye+800CW+for+image-guided+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).</li>
<li>Zaman, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+bioconjugated+near-IR+quantum+dots+for+targeted+cellular+imaging+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer.</a> J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+visualization+of+human+tumor+xenografts+through+optical+imaging+with+a+near-infrared+fluorescent+anti-epidermal+growth+factor+receptor+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody.</a> Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).</li>
<li>Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+biodistribution+and+tumor+targeting+of+two+99mTc-labeled+anti-EGFR+nanobodies+in+mice%2C+using+pinhole+SPECT%2Fmicro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT.</a> J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).</li>
<li>Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody%3A+the+%27magic+bullet%27+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging.</a> Theranostics. 4, 386-398 (2014).</li>
<li>Siontorou, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+as+novel+agents+for+disease+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.</a> International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).</li>
<li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+trends+in+antibody-based+oncologic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent trends in antibody-based oncologic imaging.</a> Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).</li>
<li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+targeting+to+tumors%3A+principles%2C+pitfalls+and+%28pre-%29+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress.</a> Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).</li>
<li>Jain, R. K., Stylianopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+nanomedicine+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Delivering nanomedicine to solid tumors.</a> Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).</li>
<li>Lisy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li>
<li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li>
</ol>

Friedrich Koch-Nolte en Friedrich Haag ontvangen een deel van de antilichaam- en eiwitverkopen via MediGate GmbH, een volledige dochteronderneming van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf.

We gebruikten nabij-infrarode fluorofoor gemerkte nanobodies en conventionele monoklonale antilichamen gericht tegen hetzelfde doel op lymfoomcellen een multimodale vergelijking van in vivo en ex vivo analyses. We toonden aan dat Nanobodies zijn goed geschikt als diagnostische hulpmiddelen voor snelle en specifieke in vivo detectie van lymfomen. In vivo, s + 16a 680 mag een snelle en meer specifieke detectie van ARTC2-positieve xenograften. Afgezien van de verschillende kinetiek voor de beste tumor visualisatie in vivo, het grote nadeel van Nika102 680 was de hoge niet-specifieke signaal van ARTC2-negatieve tumoren en niet-specifieke achtergrond signalen. Ex vivo flowcytometrische analyses van verspreide cellen van ontleed tumoren toonde geen specifieke binding aan ARTC2-negatieve lymfoom cellen van geïnjecteerd AF680-conjugaten. Ex vivo fluorescentie bleek sterk en bijna homogenlende kleuring van cellen in ART2C-positieve tumor secties in het geval van nanobody s + 16a, bevestigt dat het Nanobody was in staat om zelfs afgelegen gebieden in de tumor te bereiken na 6 uur. In tegenstelling, het monoklonale antilichaam toonde zwakker en inhomogene kleuring van cellen in ARTC2-positieve tumoren na 6 uur. Betere beeldvormende resultaten met de conventionele antilichamen kan worden bereikt na 24 uur of 48 uur (gegevens niet getoond). Om een ​​grondige vergelijking van twee verschillende afmetingen constructen uitvoeren beeldvorming op verschillende tijdstippen (serieel-imaging) moet worden uitgevoerd om de optimale beeldvorming tijdstip kan voor elk construct. Net als andere eerdere studies, de resultaten gemeld hier benadrukken dat in vivo moleculaire beeldvorming met gemerkte Nanobodies maakt een snelle en specifieke dezelfde dag tumor beeldvorming met hoge tumor-tot-achtergrond ratio 12-15,17-19. Omgekeerd conventionele antilichamen resulteren in lage tumor-tot-achtergrond verhouding en niet-specifieke signalen van antigen-negatieve tumoren vroeg na injectie vanwege hun langzame klaring uit het lichaam. Om optimale beeldvorming resultaten conventionele antilichamen, imaging tijdstippen 24 uur of zelfs 48 uur na injectie gewoonlijk nodig. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere studies die hebben gesuggereerd dat conventionele antilichamen met bewezen therapeutische voordeel beperkt nut in moleculaire beeldvorming 17,19,26. Daarom conventionele antilichamen zouden tamelijk geschikt voor therapeutische doeleinden vanwege hun lange halfwaardetijd terwijl nanobodies tamelijk geschikt voor beeldvormingsdoeleinden vanwege hun snelle klaring uit de circulatie. Deze verschillen zijn te wijten aan het feit dat een overmaat van de kleinere nanobodies (15-17 kDa) snel wordt geklaard via renale eliminatie terwijl overmaat grotere conventionele antilichamen (150 kDa) wordt vastgehouden in de circulatie. Dus het grote voordeel van nanobodies voor moleculaire beeldvorming is de lage achtergrond signaal op vroege beeldvorming tijdstippen regardless van de geïnjecteerde dosis. Hierdoor dezelfde dag beeldvorming en vertaalbare de klinische setting. Omgekeerd kan conventionele antilichamen precies worden getitreerd om niet-specifieke achtergrondsignalen minimaliseren behoud voldoende specifiek signaal van het doelweefsel (ongepubliceerde gegevens). Een van de beperkingen van de in vivo NIRF beeldvormende techniek is het lage penetratiediepte waarmee doorgaans slechts beeldvorming van subcutaan, maar niet die van orthotope tumormodellen. Echter, zou deze beperking in een experimentele setting worden overwonnen door de recent ontwikkelde tomografische foto-akoestische technieken die het hele lichaam in beeld brengen van levende muizen 27 mogelijk te maken. Een andere beperking van de NIRF beeldvormende techniek is de beoordeling van de dosis weefsel in vergelijking tot radionuclide gemedieerde imaging. Echter, de nanobodies radiolabelen voor positron emissie tomografie (PET) beeldvorming van xenotransplantaatmodellen en exacte kwantitatieve beoordeling vantracer biologische distributie. Inderdaad, onze NIRF imaging resultaten volgens een recente studie die nanobodies en conventionele antilichamen voor PET vergeleken. De auteurs kwamen ook tot de conclusie dat nanobodies mogelijk dezelfde dag krijgt met hoge tumor-tot-achtergrond ratio 15. Slechts de etikettering van antilichaam constructen met het nabije infrarood fluorescerende kleurstof AF680 liet ons uitgebreide in vitro, in vivo en ex vivo nabij infrarood fluorescentie beeldvorming vergelijking met flowcytometrie, fluorescentie microscopie, en NIRF-imaging. Daarom, en omdat het niet-radioactieve, zeer gevoelig, goedkoop en gebruikt relatief eenvoudig te produceren gerichte probes bepleiten wij het gebruik van de NIRF-beeldvormende techniek voor evaluatie van nieuwe antilichaam constructen in preklinische moleculaire beeldvorming.

In dit rapport beschrijven we de implementatie van nabij-infrarood fluorofor gelabelde probes voor de validatie van in vivo xenograft beeldvorming experimenten met behulp van ex vivo flowcytometrie en fluorescentie microscopie van de ontleed xenograft tumoren. We vergelijken een enkel domein nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 en een monoklonaal antilichaam (Nika102, 150 kDa) 2,3 gericht op dezelfde doelgroep antigeen voor specifieke in vivo nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming in een lymfoom xenotransplantaatmodel. Het doelantigeen ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 wordt uitgedrukt als een GPI-verankerde celoppervlak ecto-enzym lymfoomcellen 4-9. Nanobodies afgeleid van kameelachtigen alleen zware keten-antilichamen de kleinste beschikbare antigeenbindende fragmenten 10,11. Met slechts ~ 15 kDa, deze kleine antilichaamfragmenten oplosbaar, zeer stabiel en renaal geklaard uit de circulatie 8,10. Teze eigenschappen maken ze bijzonder geschikt voor specifieke en efficiënte targeting van de tumor antigenen in vivo 12-20. Gemeenschappelijke antigeendoelen beschikbare nanobodies de epidermale groeifactor receptor (EGFR1 of HER-1), humane epidermale groeifactor type 2 (HER-2 of CD340), carcino-antigeen (CEA) en vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody conjugaten zijn veelbelovend gereedschap voor immunotherapie van kanker en de behandeling van ontstekingsziekten 22. Recente studies hebben aangetoond dat nanobodies mogelijk hogere tumor-tot-achtergrond (T / B) -ratios dan conventionele antilichamen in vivo moleculaire beeldvorming toepassingen 8,17,19. Dit is voornamelijk te verklaren door de relatief slechte en trage penetratie van conventionele antilichamen, langzame klaring uit de circulatie, en een lange retentie in niet-gerichte weefsels 23. Bovendien overmaat conventionele antilichamen leidt tot niet-specifieke accumulatie in doelantigen-negatieve tumoren veroorzaakt door de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) bewerkstelligen 24,25. Dit betekent dat hogere doses van conventionele antilichamen kunnen verhogen niet enkel specifieke signalen maar ook niet-specifieke signalen, waardoor de maximaal haalbare tumor-tot-achtergrond verhouding verminderen. Daarentegen verhogen van de dosis nanobodies verhoogt de signalen van antigeen-positieve tumoren, maar niet die van normaal weefsel of antigeen-negatieve tumoren (ongepubliceerde gegevens). Voorbij de vergelijking van nanobodies en conventionele antilichamen, schetsen we een intra-individuele beoordeling van antigeen-positieve en -negatieve xenograften in dezelfde muizen voor directe vergelijking van specifieke en niet-specifieke signalen als gevolg van de EPR-effect. Het nabij-infrarood fluorofoor geconjugeerde probes liet ons toe om een enkele sonde te exploiteren in vivo en ex vivo met behulp van nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming, flowcytometrie, en fluorescentie microscopie. Toepassing onze protocollen maakt nietradioactief, zeer gevoelig, en goedkoop optimalisatie van in vivo moleculaire beeldvorming experimenten zoals de evaluatie van nieuwe antilichaamconstructen voor specifieke tumor targeting. Het doel van deze tutorial studie is om het gebruik van NIRF-beeldvorming voor de evaluatie van nieuwe antilichaamconstructen in preklinische moleculaire beeldvorming te markeren. In dit protocol werden alle experimenten uitgevoerd met een dierenverblijf NIRF-beeldvormingssysteem, een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) stroom cytometer, en een confocale microscoop.

<table><tbody><tr><td>AF680 protein labelkit</td><td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/CD32-antilichaam</td><td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td>Gelabeld met secundair antilichaam met AF488</td></tr><tr><td>Anti-CD45-antilichaam V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision LE software</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Alternatief product kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Alternatief product kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Leica SP5 met de volgende lasers: He-Neon voor AF680, Argon Laser voor AF488 en een 405-Diode voor DAPI</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molcular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10 cellen&nbsp;</td><td>laboratorium specifiek</td><td></td><td>Andere cellen met verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microscoop</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200 met Filter Set #32 voor AF680: 000000-1031-354</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Alternatief in vivo beeldvormingssysteem kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Leica LAS software</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Software specifiek voor gebruikte microscoop</td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Software specifiek voor gebruikt beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Naalden 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Alternatief product kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Nika102-antilichaam AF680</td><td>laboratorium specifiek</td><td></td><td>Andere antilichamen tegen verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Mogelijke gevaren: carcinogeen, kan de ogen en de huid irriteren, contact kan uitdroging van de huid en/of allergische dermatitis veroorzaken</td></tr><tr><td>s+16a-nanobody AF680</td><td>laboratorium specifiek</td><td></td><td>Andere antilichamen tegen verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Spuiten 1 ml</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>Alternatief product kan worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

validatie van nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; in vivo</em&gt; tumor xenograft nirf-imaging experimenten op muizen, waarbij<em&gt; ex vivo</em&gt; flowcytometrie en microscopie

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft-beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.
Eerst beschrijven we hoe je subcutane tumoren bij muizen genereert, waarbij je antigeen-negatieve cellijnen gebruikt als negatieve controles en antigeen-positieve cellen als positieve controles in dezelfde muizen voor intra-individuele vergelijking. We geven aan hoe je intraveneus near-infrared fluorofoor gelabelde (AlexaFluor680) antigeen-specifieke nanolichamen en conventionele antilichamen toedient. In vivo beeldvorming werd uitgevoerd met een NIRF-beeldvormingssysteem voor kleine dieren. Na de in vivo beeldvormingsexperimenten werden de muizen geëuthanaseerd. We beschrijven vervolgens hoe je de tumoren voorbereidt voor parallelle ex vivo analyses door middel van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie om de in vivo beeldvormingsresultaten te valideren.
Het gebruik van de near-infrared fluorofoor gelabelde nanolichamen maakt non-invasieve beeldvorming op dezelfde dag in vivo mogelijk. Onze protocollen beschrijven de ex vivo kwantificering van de specifieke labelingefficiëntie van tumorcellen door middel van flowcytometrie en analyse van de distributie van de antilichaamconstructies binnen de tumoren door middel van fluorescentiemicroscopie. Het gebruik van near-infrared fluorofoor gelabelde sondes maakt non-invasieve, economische in vivo beeldvorming mogelijk met de unieke mogelijkheid om dezelfde sonde zonder verdere secundaire labeling te gebruiken voor ex vivo validatie-experimenten met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie.

Fluorescent gelabelde probes voor de combinatie van verschillende NIRF-beeldvormende technieken (figuur 1A). Ons doel in vivo NIRF-beeldvorming uitvoeren, flowcytometrie en fluorescentie microscopie achtereenvolgens om fluorescent gemerkte nanobodies en monoklonale antilichamen Vergelijk specifieke in vivo beeldvorming (Figuur 1B). Muizen werden geïnjecteerd met 50 ug Nanobody en monoklonaal antilichaam de specificiteit van de fluorescent gelabelde constructen in vivo beeldvorming evalueren. De resultaten toonden specifieke labeling van antigeen-positieve tumoren zowel Nanobody en monoklonaal antilichaam tegen 6 uur na injectie (Figuur 2). ROI analyses van de antigeen-positieve tumoren vertoonden een veel hogere T / B-verhouding van ~ 12 voor het Nanobody opzichte ~ 6 voor het monoklonale antilichaam. Bovendien is het Nanobody toonde geen aspecifieke signaal in de antigeen-negatieve tumoren, terwijl demonoklonaal antilichaam toonde aspecifieke storende signalen in de antigeen-negatieve tumoren. Naast de niet-specifieke signaal van de negatieve tumoren, het monoklonale antilichaam induceerden ook niet-specifieke achtergrond signalen in het gehele dier. Dit is waarschijnlijk te wijten aan overmatige vrij circulerende antilichamen, die te groot renaal wordt uitgescheiden zijn. Daarentegen, dieren geïnjecteerd met nanobodies toonde aspecifieke signalen alleen in de nieren als gevolg van de renale eliminatie van de kleine nanobodies. Flow cytometrie analyse van tumorcelsuspensies toonde specifieke labeling van antigeen-positieve tumorcellen zowel AF680-conjugaten 6 uur na injectie. De sterkere fluorescentie signaal van de nanobody gelabelde cellen in vergelijking met monoklonaal antilichaam gelabelde cellen weerspiegelt de in vivo NIRF-imaging resultaten. Belangrijk is de flowcytometrische analyses blijkt dat er geen niet-specifieke labeling van antigeen-negatieve cellen met een van de tweeconstructen (figuur 3). Fluorescentie microscopie van tumor vriescoupes vertoonden een sterke en nagenoeg homogene kenmerken van antigeen-positieve cellen met het Nanobody 6 uur na injectie. Omgekeerd, het monoklonale antilichaam toonde een veel zwakker en nogal homogene kleuring (Figuur 4A). Antigeen-negatieve tumoren tonen geen vlekken 6 uur na injectie van het Nanobody, terwijl antigeen-negatieve tumoren geïnjecteerd met de conventionele antilichamen tonen aspecifieke verspreid kleuring in de interstitiële ruimte (Figuur 4B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Figuur 1: fluorescentie beeldvorming en antilichaam constructen. (A) Imaging opstelling voor evaluatie van AF680-conjugaten: In vivo NIRF-imaging gevolgd door flowcytometrie en fluorescentie microscopie. (B </strong&gt;) Schematische voorstelling van AlexaFluor680 gelabeld nanobody s + 16a (rood) en monoklonale antilichaam Nika102 (blauw). Oranje sterren geven de AlexaFluor680 fluorochromen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Figuur 2: In vivo-beeldvorming NIRF afbeeldingen van het fluorescentiesignaal van antigeen-positieve (+) en antigeen-negatieve (-) tumoren bij muizen die zijn geïnjecteerd met Nanobody s + 16a (A) en monoklonaal antilichaam Nika102 (B). . In vivo beeldvorming werd uitgevoerd vóór (0 uur) en 6 uur na injectie. Signaalintensiteiten worden als stralende efficiëntie (p / sec / cm2 / sr) / (uW / cm2). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Figuur 3:Ex vivo FACS analyse van cel gebonden antilichaam constructen van tumorcelsuspensies. (A) Poortsignalen strategie voor FACS analyse van tumorcellen. (B) Histogrammen tonen de hoeveelheid intraveneus geïnjecteerd AF680-geconjugeerde nanobody s + 16a en antilichaam Nika102 specifiek de tumorcellen gebonden in vivo. Antigeen-negatieve tumoren worden weergegeven als ongevulde histogrammen en antigeen-positieve tumoren worden weergegeven als gevuld histogrammen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Figuur 4:. Ex vivo fluorescentie microscopie (A) Overzicht fluorescentie microscopie van gehele antigeen-positieve tumor cryocoupes 6 uur na injectie van s + 16a 680 of Nika102 680. Signaalintensiteiten van de in vivo intraveneusworpen AF680-conjugaten zonder secundaire-etikettering agenten worden weergegeven in het rood. Ex vivo tegengekleurd kernen worden weergegeven in blauw en schepen in het groen. Gestippelde lijnen geven buitenmarges van de gehele tumoren. (B) Close-up van fluorescentie microscopie van antigeen-positieve en antigeen-negatieve tumoren.

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van ex vivo validatie van in vivo near-infrared fluorescentie xenograft-beeldvormingsexperimenten in muizen met behulp van Fluor four-gelabelde nanobodies of conventionele antilichamen. Dit wordt bereikt door eerst near-infrared fluoro four-gelabelde antigeenspecifieke antilichamen en conventionele antilichamen toe te dienen aan muizen met zowel antigeen-positieve als antigeen-negatieve xenografts. De tweede stap is het uitvoeren van in vivo beeldvorming.Na de beeldvorming worden de muizen geofferd om de xenotransplantaten te verwijderen, die vervolgens worden verwerkt voor ex vivo analyses. Uiteindelijk worden ex vivo flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de in vivo beeldvormingsresultaten te valideren. Het voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals nucleaire beeldvorming, is dat het gebruik van een nabij-infrarode fluorescente kleurstof een uitgebreide in vitro, in vivo en ex vivo multimodale beeldvormingsvergelijking mogelijk maakt met een enkele probe voor flowcytometrie, fluorescentiemicroscopie en nabij-infrarode fluorescentiebeeldvorming.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van tumorbeeldvorming, zoals het lokaliseren van metastasen tijdens chirurgie en het monitoren van de efficiëntie van antitumortherapieën. De markering van antilichamen met fluorofoor maakt de exacte ex vivo kwantificering van celgebonden antilichamen mogelijk. Hierdoor kunnen we onderscheid maken of specifieke signalen die we in vivo waarnemen het gevolg zijn van antilichamen die gebonden zijn aan celoppervlakantigenen, of aspecifiek zijn door het zogenaamde enhanced permeability and retention-effect.Zeven tot negen dagen na de injectie van de tumorcellen, wanneer de tumoren een diameter van ongeveer acht millimeter zouden moeten hebben. Ter voorbereiding op de beeldvorming van de muizen brengt u eerst oogzalf aan en initialiseert u het beeldvormingssysteem. Plaats vervolgens de geanestheseerde muizen op de verwarmde tafel met de tumoren naar de camera gericht.Houd gedurende de gehele beeldgevingsprocedure een concentratie van 1 tot 2% isofluraan aan met behulp van het isofluraan-verdeelstuk in de beeldgevingskamer. Bewaak de ademhalingsfrequentie. Als deze te hoog is, is de anesthesie te licht; als deze traag of onregelmatig is, is de anesthesie te diep.Maak vervolgens beelden van de muizen nadat het basisbeeld is verkregen. Injecteer de muizen met 50 micrograms LOR six 80 gelabelde antilichaamconstructen. Doe dit in een volume van 200 microliters saline in de staartvene.Euthanaseer de muis na de beeldvorming, monteer deze op een blok piepschuim en reinig de muis met 70% ethanol. Snijd vervolgens de huid open om de tumoren bloot te leggen. Verwijder de tumoren met een scalpel en houd de tumoren intact.Snijd de tumoren na verwijdering doormidden en breng één helft over naar een schaal met P-B-S-A-E-B-S-F-oplossing op ijs voor fax-analyse, en breng de andere helft over naar een tweevoudig volume koude 4% PFA voor immunohistochemie. Na 24 uur in het fixatief bij 4 °C worden de tumoren overgebracht naar PBS met 30% sucrose en worden ze bij 4 °C bewaard totdat ze volledig in de oplossing zijn gezonken. Snijd de tumoren vervolgens in stukjes die in de cryo-vormen passen.Vul de vormpjes met OCT-compound en breng de tumorfragmenten over naar de vormpjes. Het weefsel moet volledig ondergedompeld zijn in OCT. Plaats de cryovormpjes vervolgens op droogijs en bewaar ze, zodra ze volledig bevroren zijn, bij minus 80 degrees Celsius tot ze verwerkt kunnen worden.Om de cellen voor te bereiden, brengt u de tumorhelft over naar een cellenzeef in de zeefhouder. Snijd het weefsel in drie tot vier stukken, verwijder vervolgens de zuiger uit een spuit van 2 mL en gebruik de zuiger om het weefsel tegen de zeef te pletten. Verzamel de oplossing die door de zeef stroomt. Nadat de weefsels zijn geplet, spoelt u de zeef door met PBS.Breng vervolgens de opgevangen suspensie over naar een nieuwe buis en centrifugeer deze 5 minuten bij 500 G. We resuspenderen de celpellet in 10 milliliters PBS met 0,2% BSA. Tel vervolgens de cellen, breng een aliquot van 1 tot 5 miljoen lymfoomcellen over naar een vijf milliliter fax-buis, centrifugeer de buis bij 500 G en verwijder het supernatant.Suspendeer de cellen vervolgens in 100 µL PBS met 0,2% BSA. Op dit punt is het mogelijk om FCR te blokkeren met behulp van een antilichaam dat bindt aan FC gamma R. Wacht 10 minuten en was de cellen eenmaal met PBS met 0,2% BSA. Voeg nu een anti-CD 45 monoklonaal antilichaam toe om de leukocyten te identificeren.Incubeer de cellen gedurende 20 minuten in het donker met dit antilichaam en voer vervolgens twee wasstappen uit om het te verwijderen vlak voor de FACS-analyse. Kleur de cellen gedurende 15 minuten op ijs met propidiumjodide om dode cellen te identificeren. Was ze vervolgens schoon met zuivere PBS.Vervolgens worden de cellen geresuspendeerd in 150 µL PBS en wordt de procedure voortgezet. De muizen kregen een injectie van 50 µg nanobody en monoklonaal antilichaam om de specificiteit van de fluorescentie-gelabelde constructen te evalueren. Voor in vivo beeldvorming.Alle beeldvorming werd uitgevoerd zes uur na de injectiestroom. Cytometrische analyse van tumorcel-suspensies toonde specifieke labeling van antigeen-positieve tumorcellen met beide AF six 80-conjugaten. Er was geen aspecifieke labeling van antigeen-negatieve cellen met een van beide constructen.De tumor. Cryosecties vertoonden een sterke en bijna homogene labelidng van antigeen-positieve cellen met het nanobody. De monoclonale antilichaam gaf echter, zoals verwacht voor het antigeen, een veel zwakkere en inhomogene kleuring.Negatieve tumoren vertoonden geen kleuring van het antilichaam-antigeen; negatieve tumoren vertoonden aspecifieke, verspreide kleuring in de interstitiële ruimte na injectie van het conventionele antilichaam. Dit was zeer vergelijkbaar met het kleuringsbeeld in de antigeen-positieve tumoren na injectie van het conventionele antilichaam zodra dit was beheerst.Het beeldvormingsgedeelte van deze technologie kan op één dag na deze procedure worden uitgevoerd. Andere methoden, zoals radiomerking van nanobodies, kunnen worden toegepast om de biodistributie van de geïnjecteerde conjugaten in verschillende weefsels of andere vraagstukken te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van multimodale ex vivo validatie van uw in vivo nabij-infrarood fluorescentie-beeldvorming met een fluoro-vier gelabelde probe.Hiermee wordt u voorzien van een techniek voor de evaluatie van nieuwe antilichaamconstructen voor preklinische moleculaire beeldvorming.

validation-nanobody-antibody-based-vivo-tumor-xenograft-nirf-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The video demonstrates a fluorescence imaging method for in vivo antibody localization in a mouse tumor xenograft model. It involves the injection of tumor cells in a mouse to generate solid xenografts beneath the skin. Subsequent injection of fluorescent antibodies confirms specific localization through enhanced fluorescence signals within the tumor xenograft.

In Vivo Fluorescence Imaging to Localize Antibodies in a Mouse Tumor Xenograft Model

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Leer ex vivo validatie van in vivo NIRF-beeldvorming in muizen met xenografttumoren met behulp van gelabelde nanobodies en antilichamen. Deze methode combineert flowcytometrie en microscopie voor betrouwbare bevestiging van beeldvormingsresultaten.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij Ex Vivo Flowcytometrie en Microscopie (Video) | JoVE Journal

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde

Meer video's verkennen