Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing
24 februari 2015
Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.
Het algemene doel van deze procedure is om CPG-methylering in gerichte regio's van belang uit genomisch DNA te kwantificeren, geïsoleerd uit weefsel of cellen van belang. Dit wordt bereikt door eerst specifieke PCR-primers voor sulfonaat te ontwerpen om regio's van belang uit bi-sulfonaat geconverteerd genomisch DNA te versterken. In de tweede stap wordt de bi-sulfonaat geconverteerde regio van belang versterkt, en next generation sequencing of NGS-bibliotheken worden gegenereerd vanuit de amplicons cons.
Vervolgens worden de bibliotheken gesequenced en worden FASTQ-bestanden gegenereerd voor analyse. In de laatste stap worden de sequencing-reads uitgelijnd met de bi-sulfonaat geconverteerde referentie doelsequentie, en wordt het vijf procent mc berekend, uiteindelijk door sulfonaat amplicon-sequencing of BS A S kan worden uitgevoerd om de CPG-methylering in een willekeurige regio van belang uit elk modelorganisme nauwkeurig en nauwkeurig te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Sanger-sequencing, is dat BS A S nauwkeurige en nauwkeurige CPG-methyleringskwantificering biedt op een snelle, hoogdoorvoerige manier, waardoor de mogelijkheid bestaat om meerdere regio's in een groot aantal monsters te testen.
Na het identificeren van het doelwit en het ontwerpen van de primer, assembleer de reactie voor de doelwitoptimalisatie van een enkele amplicon, en verzegel vervolgens een PCR-plaat met hitte-afdichtingsfolie om de amplicons te visualiseren door pagina-elektroforese. Laad vervolgens de juiste putjes met 30 microliters PCR-reacties of ladder, en voer vervolgens de gel uit bij 200 volt gedurende ongeveer 45 minuten. Wanneer de eerste kleurstof het einde van de gel bereikt, stopt u de reactie en bedek vervolgens de hele gel met vijf microgram per milliliter vers bereide AUM-bromide.
Na vijf minuten, beeld de gel af via een UV-transluminator bij een excitatiegolflengte van 482 nanometer. Gebruik de ladder om de PCR AMPLICONS te bepalen om de specificiteit van de reactie te bepalen. Zoek naar meerdere banden anders dan de verwachte amplicon-grootte om de gemiddelde grootte van de gedetecteerde bibliotheekpieken en een schatting van de molariteit te bepalen.
Vervolgens voert u de bibliotheken uit op een capillaire elektroforese DNA-sizing chip met een hooggevoelige DNA-test volgens de instructies van de fabrikant. Om de bibliotheken te kwantificeren door QPCR. Gebruik primers ontworpen tegen de adaptersequenties in de gegenereerde bibliotheken en standaarden met een bekende concentratie op een real-time instrument, met behulp van de absolute kwantificeringsinstellingen volgens de instructies van de fabrikant.
Gebruik vervolgens de grootte van de bibliotheken en de molaire kwantificering uit de QPCR om de molaire concentraties van de bibliotheken te berekenen. Na het sequencen, importeert u de zipped fast Q-bestanden in de juiste sequencinganalyse-pijplijn, selecteert u import en selecteert vervolgens de sequencing-methode die is gebruikt om de reads te genereren om de Q-scores voor de read-trimmen-applicaties te behouden. Importeer de juiste zipped fast Q read-bestanden en deselecteer onder algemene opties de kwaliteitsscores verwijderen.
Selecteer een locatie voor de geïmporteerde reads en klik op voltooien. Selecteer vervolgens onder NGS-kerntools de sequenties bijsnijden. Markeer de reads die moeten worden bijgesneden en behoud alleen de reads met een score van minimaal Q 30.
Selecteer vervolgens het bijsnijden met behulp van kwaliteitsscores en stel de limiet in op 0,001. Om verder alleen de rieten met maximaal één dubbelzinnig nucleotide te selecteren. Selecteer dubbelzinnige nucleotiden bijsnijden en stel het maximale aantal dubbelzinnigheden op één.
Selecteer vervolgens een locatie om de bijgesneden reads op te slaan en klik op voltooien om de bijgesneden res naar de in silico bi-sulfonaat geconverteerde genreferentie te mappen. Selecteer onder NGS-kerntools de reads mappen. Om te verwijzen, selecteert u de bijgesneden reads die moeten worden toegewezen en klikt u op volgende.
Selecteer vervolgens onder referentiemaskering de geconverteerde referentiesequentie en selecteer geen maskering. Klik op volgende en wijs vervolgens een score van drie toe voor mismatches, invoegingen en deleties. Wijs een score van één toe voor de minimale fractie van de leeslengte die op de referentie wordt toegepast en wijs een score van 0,9 toe voor de minimale fractie van de identiteit tussen de kaart, lees en referentie onder niet-specifieke match-afhandeling, selecteer, negeren en klik op volgende onder uitvoeropties.
Selecteer vervolgens Creëer standalone read mappings. Selecteer vervolgens onder resultaatverwerking opslaan. Selecteer een locatie om de read-mapping op te slaan en klik op voltooien om de variant calling op de toegewezen reads uit te voeren.
Onder re-sequencing-analyse selecteert u de detectie van varianten met lage frequentie en kiest u de read-mapping die moet worden geanalyseerd. Klik op volgende en vervolgens onder laagfrequentievariantparameter, voer 0,01% in en klik op volgende. Onder algemene filters, stelt u de minimale dekking in op 1000 om ervoor te zorgen dat de sequentie op een diepte van minimaal 1000 x is.
Klik vervolgens op volgende en selecteer vervolgens onder uitvoeropties geannoteerd tabel maken en selecteer een locatie om het variantentafelbestand op te slaan, klik op voltooien en gebruik de variantfrequenties op de geannoteerde CPG-sites in de regio van belang uit het variantentafelbestand om de frequentie van de cytosinemethylering bij een referentie cytosine in CG-context te berekenen door sulfonaat amplicon-sequencing reads die correct zijn uitgelijnd met de geconverteerde referentiesequentie zullen lijken op die geïllustreerd in de figuur. De CPG-dinucleotiden kunnen duidelijk worden geïdentificeerd en de methyleringstoestanden kunnen worden geschat door de base calls op de CPG-sites te observeren. In de toegewezen reads zal 0% methylering resulteren in toegewezen reads die thymine bevatten die zijn toegewezen aan de CPG-sites.
100%methyleringscontroles zullen resulteren in toegewezen reads die cytosines bevatten die zijn toegewezen aan CPG-sites. In dit experiment werden RNA en DNA gezamenlijk geïsoleerd uit een muis, cerebellum en retina. De opsine-expressie die selectief in retinaweefsel werd tot expressie
Overzicht
Bisulfiet amplicon sequencing (BSAS) is een techniek die wordt gebruikt om cytosine methylering in specifieke genomische regio's te kwantificeren. Deze methode combineert bisulfietconversie met PCR-amplificatie en next-generation sequencing om een nauwkeurige kwantificering van methylering te bereiken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Moleculair Biologie
- Epigenetica
Achtergrond
- BSAS maakt de analyse van DNA-methyleringspatronen mogelijk.
- Het is bijzonder nuttig voor het bestuderen van genregulatie en -expressie.
- De methode biedt high-throughput mogelijkheden voor meerdere monsters.
- Het biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden zoals Sanger sequencing.
Doel van de studie
- Om CPG-methylering in gerichte genomische regio's nauwkeurig te kwantificeren.
- Om het begrip van epigenetische regulatie in verschillende biologische contexten te verbeteren.
- Om de analyse van methylering in verschillende modelorganismen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van specifieke PCR-primers voor doelversterking.
- Het versterken van bisulfiet geconverteerd genomisch DNA.
- Het genereren van NGS-bibliotheken van PCR-amplicons.
- Het sequencen en analyseren van de resulterende FASTQ-bestanden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van CPG-methyleringsniveaus in verschillende weefsels.
- Aangetoonde verschillen in methyleringspatronen tussen cerebellum en retina.
- Inzichten geboden in de regulatie van opsinexpressie op basis van methyleringsstatus.
- De nauwkeurigheid en precisie van BSAS voor methyleringsanalyse gevalideerd.
Conclusies
- BSAS is een robuuste methode voor het kwantificeren van DNA-methylering.
- De techniek verbetert het vermogen om epigenetische modificaties te bestuderen.
- Het biedt potentie voor toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Targeted DNA methylation analysis via bisulfite amplicon sequencing (BSAS) addresses the need for high-throughput, quantitative epigenomic profiling in early discovery. It enables precise interrogation of epigenetic regulation in disease-relevant genomic regions, supporting target validation and mechanistic de-risking. The method provides base-specific methylation quantitation that informs hypothesis testing and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of epigenetic mechanisms in target gene promoters or CpG islands.
- Scientific Value: Provides absolute cytosine methylation quantitation with base specificity for functional target validation.
- Operational Value: Supports rapid analysis of up to 96 samples and 10 kb of targeted regions per run.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative methylation data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Produces NGS-ready libraries from amplicons for scalable, multiplexed epigenetic screening.
- Operational Value: Facilitates confirmation of regions identified in genome-wide methylation studies through targeted validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system analysis by comparing methylation patterns across tissues or disease models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment through site-specific methylation quantification.
- Operational Value: Provides predictive confidence in epigenetic mechanism de-risking prior to lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
BSAS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling epigenetic data integration at key decision points.
- Discovery Biology: Supports interrogation of epigenetic regulation in target validation workflows.
- Screening: Delivers quantitative, high-throughput methylation readouts for compound or condition comparison.
- Analytics: Generates variant frequency data at CpG sites for precise methylation level calculation.
- Translational Research: Connects discovery epigenetics to preclinical continuity via tissue-specific methylation profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for targeted epigenetic analysis across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in epigenetic mechanism validation and reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of methylation quantification across sample sets.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through epigenetic de-risking and capital efficiency in target selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on epigenetic validation of disease-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bisulfite conversion, PCR primer design, and NGS library preparation.
- Depends on access to benchtop next-generation sequencing and capillary electrophoresis for library quantification.
- Necessitates cross-team standardization of bioinformatics pipelines for read trimming, mapping, and variant calling.
- Involves adaptation considerations for different DNA sources and genomic regions of interest.
- Limited by the need for prior knowledge of target regions to design specific primers.
