Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe superresolutiebeelden van de immunologische synapsen van natural killer-cellen (NK-cellen) op een ondersteunde lipide dubbellaag succesvol kunnen worden vastgelegd. Dit wordt bereikt door in kamerslides een glas-ondersteunde planaire lipide dubbellaag te construeren die antilichamen tegen de NK-cel-activerende receptor CD 16 bevat. De eerder geïsoleerde NK-cellen worden vervolgens toegevoegd aan de planaire lipide dubbellaag waarin antilichamen zijn ingebed, gevolgd door het kleuren van de cellen voor f-actine en perforine.

De laatste stap is de beeldvorming van de resulterende NK-celsynapsen met de stead-microscoop, waarbij uiteindelijk de NK-synaps op de ondersteunde lipide dubbellaag wordt afgebeeld. Het gebruik van stead toont de NK-celsynaps in verhoogde detailgraad, wat visualisatie mogelijk maakt van de ultrastructuur van het actine-cytoskelet en perran-positieve lytische granula die gepositioneerd zijn boven regio's met een lage F-actine dichtheid. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de glazen ondersteuningsvlak-lipidebarrière het plasmamembraan van de doelcel en de eiwitten op deze lipidebarrière kan nabootsen.

Ze kunnen zich zijdelings bewegen, wat de vorming van een immunologische synaps op een biologisch relevantere wijze kan nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het vakgebied van de immunologie, doordat onderzoekers de synapsvorming op een gecontroleerde manier en in detail kunnen visualiseren, wat onmogelijk is met commerciële en microscopische benaderingen. Een postdoc en een promovendus zullen de procedure demonstreren om de op glas ondersteunde planaire lipide dubbellaag te assembleren.

Bereid eerst 100 milliliters piranha-oplossing door 30% waterstofperoxide te mengen met zwavelzuur in een verhouding van één op drie in een bekerglas. Plaats twee rechthoekige dekglasjes nummer 1.5 gedurende 20 tot 30 minuten in deze oplossing om de dekglasjes te reinigen. Pak één buisje van eerder bereide 400 micromolar DOPC-lipiden en één buisje van eerder bereide 80 micromolar biotine PE-lipiden.

Transporteer ze op ijs naar de argontank nadat een nieuwe microcentrifugebuis is gedeoxygeneerd met argon. Voeg de DOPC en biotin PE in een verhouding van één-op-één aan elkaar toe. Het specifieke volume varieert afhankelijk van de experimentele behoeften, maar moet minimaal 2 µL bedragen.

Ontlucht elke buis met het mengsel en de individuele reagensbuizen voordat de ladder terug in de koelkast wordt geplaatst. Spoel na het reinigen de dekglasjes grondig af met gedestilleerd water. Laat de dekglasjes enkele minuten aan de lucht drogen, neem vervolgens 1,5 µL van het liposoommengsel op en breng dit als een enkele druppel aan in een van de baancompartimenten van een chamber slide.

Het gebruik van twee druppels per baan is gebruikelijk, maar niet noodzakelijk. Plaats nu snel en efficiënt het droge dekglas over de druppels; zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar staan zodat ze niet samenvloeien zodra het dekglas is geplaatst. Zorg er daarnaast voor dat de druppels rond en duidelijk begrensd blijven zonder de randen van de kamerwanden te raken.

Druk stevig tussen en rond elke baan om een waterdichte afsluiting van de afdekking te garanderen. Markeer de posities van de druppels door deze te verschuiven en glijden met een markerpen. Laat vervolgens 100 µL waterige 5% casing door de kamer stromen om de dubbellaag te blokkeren.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de stroomkamer aanwezig zijn. Injecteer vervolgens 100 µL streptavidine met een concentratie van 333 ng/mL in elke lane. Na incubatie gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur wordt gewassen door drie mL HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine door elke lane te leiden.

Om het overschot aan streptavidine te verwijderen, voegt u 100 µL biotinylerede, fluorescent gelabelde anti-CD16 toe bij de eiwitconcentratie die eerder is bepaald zoals beschreven in het tekstprotocol, gevolgd door incubatie in het donker gedurende 20 tot 30 minuten. Was opnieuw door drie mL HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine door elke lane te spoelen. Laat vervolgens 100 µL D-biotine met een concentratie van 25 nM door de kamer stromen om elk overschot aan streptavidine te binden en zo de kans op aspecifieke binding van streptavidine aan de cellen te elimineren.

Tel vervolgens de menselijke NK-cellen en resuspendeer deze in een concentratie van 500, 000 per milliliter in HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine. Was de D-biotine uit de kamer met nog eens drie milliliter HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine per lane. Zodra de cellen zijn geresuspendeerd in de gewenste concentratie, voegt u 100 microliters toe aan elke lane.

Plaats de kamer gedurende 30 tot 60 minuten in een incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Fixeer na deze incubatieperiode de cellen met 4% paraform aldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 minuten. Was door drie milliliters phosphate buffered saline door elk kanaal te laten lopen om het paraform aldehyde te verwijderen.

Voeg vervolgens 400 µL blokkeringsbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Kleur daarna f actin en perforine door twee µL verdunde fluorescentie-gelabelde Phin en fluorescentie-gelabelde anti-perforine monoklonaal antilichaam toe te voegen; incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur en was vervolgens door drie mL fosfaatgebufferde zoutoplossing door de kamer te spoelen. De kamer is nu gereed voor de start van de beeldvorming.

Schakel alle benodigde hardwaremodules van de STEAD-microscoop in. Start de software voor beeldanalyse op en activeer zowel de resonantiescan- als de STEAD-modules. Wacht na het maken van deze selecties ongeveer drie tot vijf minuten tot de software is opgestart.

Klik op het configuratietabblad bovenaan het scherm en selecteer 'laser config'. Zet vervolgens het witte licht en de stabiele 592 nanometer lasers aan. Kies het 100 x objectief en lijn de excitatielaserstraal uit met een 592 nanometer depletiemlaser.

Selecteer de laserconfiguratiemodule, schakel de 592 depletionlaser uit en schakel de 660 nanometer depletionlaser in. Plaats het objectglas op de tafel boven de lens. Breng de cellen die gebonden zijn aan het afgebakende dubbellaagsgebied in focus met behulp van de witlichtlamp en de oculairs.

Keer vervolgens terug naar het tabblad acquisitie direct rechts van het tabblad configuratie. Klik op het tabblad voor het schakelen naar wit licht, schakel deze module vervolgens in en sleep de excitatielaserlijn naar de juiste golflengte. Nadat de gewenste detector is geselecteerd en het detectiebereik is ingesteld, klikt u op de knop sequentieel in de linker acquisitiebalk om het dialoogvenster voor sequentiële scanning onderaan de linkerbalk te openen.

Hiermee kan de gebruiker meerdere sequenties toevoegen, elk met een verschillende excitatiestraal voor een andere kleur. Klik tussen de frames en stel vervolgens de excitatiefrequentiedetector en het detectiebereik in voor elke extra kleur. Zodra alle instellingen zijn geoptimaliseerd, klikt u op start om het acquisitieproces te beginnen.

De driekleurige STEAD-afbeelding van de NK-celsynaps op een door glas ondersteunde planaire lipide dubbellaag laat zien dat het anti-CD 16-antilichaam, weergegeven in rood, zich ophoopt op de lipide dubbellaag, wat de vorming van F-actine triggert, evenals de polarisatie en penetratie van perforine, weergegeven in blauw, door het F-actine-netwerk in het focale vlak. Met deze gecombineerde aanpak kunnen de microclusters van fluorescentielabelled anti-CD 16 binnen de door glas ondersteunde lipide dubbellaag duidelijk worden waargenomen, wat een directe weerspiegeling is van de clustering van CD 16 op de NK-cel. Vergeleken met de conventionele confocale afbeelding is de ringstructuur van het centrale CD 16-cluster in de STEAD-afbeelding gemakkelijker te onderscheiden vanwege de verminderde omgevingsfluorescentie.

Bovendien is de ultrastructuur van het actine-cytoskelet zichtbaar met een aanzienlijk verbeterde resolutie. In overeenstemming met eerdere observaties zijn de perin-positieve lytische granula gepositioneerd boven regio's met een lage F-actine-dichtheid. In de stead-afbeelding is een cruciaal detail zichtbaar dat grotendeels verloren gaat in de confocale afbeelding. Zodra de techniek onder de knie is, kan de uitvoering ongeveer vier uur in beslag nemen, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Het is belangrijk om te onthouden dat het monster zuurstofvrij moet blijven door herhaaldelijk de zuurstof te verdrijven met argon, en bij het assembleren van de kamer door het dekglas snel op het monster te plaatsen en dit vervolgens onder te dompelen in de inkapselingsoplossing.