Name: Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer super-resolutiebeeldvorming van immunologische synapsen van NK-cellen met behulp van STED-microscopie en glas-ondersteunde planaire lipidebilayers. Deze methode onthult de ultrastructuur van het actinecytoskelet en perforinegranula.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Emily Mace en Malini Mukherjee voor beeldvorming en deconvolutieanalyse. Het werk in het Liu-laboratorium werd gedeeltelijk ondersteund door de Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant nummer AI36211 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, de Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund en het Lymphoma SPORE Developmental Research Program van Baylor College of Medicine en het Methodist Research Institute.

1. Bereiding van liposomen <ol><li> Bereken de hoeveelheid chloroform gesuspendeerd voorraadoplossingen van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-cap biotinyl (Biotin-PE) voor het verwaterde aandelen maken op de gewenste uiteindelijke concentratie. Eindconcentraties van 400 uM en 80 uM DOPC biotine-PE fosfolipiden maken bij elk 10 ml, allereerst plaatsen 629 ui 10 mg / ml DOPC en 88 pl 10 mg / ml biotine-PE in afzonderlijke glazen chromatografiebuizen. LET OP: het is belangrijk om glas Hamilton spuiten en glazen chromatografie buizen reinigen met het schoonmaken oplossing (1 L 95% ethanol en 120 ml water met 60 g kaliumhydroxide, KOH), terwijl het overbrengen-chloroform opgeschort voorraad oplossing van DOPC en biotine-PE. </li><li> Droog de chloroform met een stroom van argon in de chemische kap. Dicht de chromatografiebuis door parafilm. </li><li> Betreft de nieuwe gedroogd liposomen een hoog vacuüm in een lyophilizER O / N om eventuele resten chloroform te verwijderen. Voor dezelfde dag voltooid, droog voor 60-90 min. </li><li> Terwijl de vriesdroger runs, bereiden wat verdunning buffer. Voor dit protocol bereiden 25 ml met 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; en 2% (gew) n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG) wasmiddel. Meng de eerste twee ingrediënten samen eerst, dan verdringt zuurstof met argon voor het toevoegen van de droge OG poeder. Na voorbereiding, filtreer de OG oplossing 0,2 micron celluloseacetaat membraan en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Breng in twee schroefdop flessen 1 L Tris-buffer zoutoplossing in dezelfde concentraties, maar zonder OG. Plaats een gedestilleerd water gereinigd magnetische roerstaaf in de bodem van elk. Bereid 6 extra liters van het Tris-zoutoplossing buffer. Verwijderen van zuurstof uit de flessen met argon en plaats ze bij 4 ° C ook. </li><li> Na vriesdrogen, los de gedroogde lipiden in de Tris-zoutoplossing OG buffer een 4 mM oplossing van elk merk. Naar het voorbeeldvolumes, 2 ml aan de DOPC buis en 0,2 ml biotine-PE-buis. </li><li> Meng de biotine-PE lipiden met de DOPC lipiden. Dit verbetert de mobiliteit van de SLB, als de gekoppelde biotine de vloeibaarheid van het fosfaat kopgroepen kunnen beïnvloeden. Tot een eindconcentratie van 80 uM biotine-PE maken, meng 0,2 ml 4 mM biotine-PE en 1 ml van 4 mM DOPC. Voeg vervolgens 8,8 ml van de Tris-zoutoplossing OG buffer. </li><li> Voor een eindconcentratie van 400 uM DOPC eenvoudig mengen 1 ml 4 mM DOPC met 9 ml Tris-zoutoplossing OG. </li><li> Vul het sonicator met ijswater. Plaats de glazen buis met het verdunde fosfolipide in het midden van de sonicator met een hulpprogramma klem. Ultrasone trillingen de verdunde fosfolipide gedurende 10 minuten totdat de oplossing helder. OPMERKING: ijs toevoegen in de sonicator waterbad om de temperatuur laag te houden, omdat geluidsgolven warmte zal genereren. </li><li> Vul de buis met argon om de zuurstof verdringen in de lucht boven de vloeistof en verzegeld met parafilm. </li></ol&gt; 2. Dialyse van liposomen <ol><li> Snijd twee delen droog dialyseslang (molecuulgewicht cut-off: 12-14,000, diameter: 6.4 mm) van geschikte lengte (in dit voorbeeld, 40 cm), één voor elke fosfolipide verdunning van de rol. </li><li> Rehydrateren de buizenstelgedeelten door hen te laten weken in een 200 ml gedestilleerd water in een bekerglas gedurende 2 minuten. </li><li> Magnetron deze gedurende 5 minuten op een hoge stand, of ten minste tot het water op kookpunt komt. </li><li> Een knoop aan het ene uiteinde van elke buis en spoel het interieur met enkele milliliters van Tris-zout-OG buffer. Daarna zorgvuldig knijp zoveel deze wasbuffer mogelijk de hoeveelheid buffer in de resterende minimaliseren. </li><li> In een laminaire stroming kap, voeg de verdunde fosfolipiden in elke buis en klem de open einden met een kleine dialysebuis sluiting, zodat alle lucht uit te sluiten. Compleet lucht uitsluiting zal het offer van een klein volume van het monster nodig door klemmen onder de &amp;# 8220; waterlijn &quot;. </li><li> Dompel de monsters in de eerder bereide flessen Tris-buffer zoutoplossing zonder OG. Verdringen van zuurstof in de fles met argon alvorens opnieuw verzegelen en plaats te roeren O / N bij 4 °. </li><li> Breng de slang in een nieuwe fles Tris-buffer zoutoplossing zonder OG elke 12 h gedurende minstens 3 keer. </li><li> Kort voor het verwijderen van de gedialyseerde lipiden, stelt een aantal kleine buisjes waarin de lipiden aliquot vult elk met argon om de zuurstof te verdringen. </li><li> Na 36 uur, neem de dialyse flessen in de laminaire stroming kap en verwijder de dialyse buizen van de flessen. Hebben een bankje luier of beker bij de hand om de natte runoff verzamelen. </li><li> Snijd de dialysebuizen boven de clip, verwijder dan de clip en het gedialyseerd lipide-oplossing via een pipet voorzichtig in een 1 ml porties in de pre-bereide buizen gevuld met argon gas op ijs. </li><li> Aliquot de waterige liposoom-oplossing, gebruikt u de argon stroom aan zuurstof weer verdringen in elke buis. </li><li> Bewaar de liposomen bij 4 °. Niet invriezen. </li></ol> 3. Bepaling van antilichaam dichtheid van de lipide bilaag <ol><li> Bereid een verdunningsreeks van gebiotinyleerd, fluorescentie-gemerkt antilichaam, 50 ul volume voor elke verdunning, bij de volgende concentraties: 0 nM (blanco), 10 nM, 50 nM, 100 nM en 500 nM. (Hierna aangeduid als &quot;sample-serie&quot;). </li><li> Voeg 1 ul van silicapareltjes in 6 wells van een 96-well V-bodemplaat. Zorg ervoor dat de kralen goed schudden voor pipetteren, omdat ze de neiging om zich te vestigen. OPMERKING: Als hebben besteld droge korrels in plaats van geschorst, volgt u de instructies van de fabrikant om te verdunnen. </li><li> Om deze kralen, voeg 2 pl gemengde DOPC: biotinyl fosfolipiden bij een 1: 1 verhouding. Doe dit voor elk putje. </li><li> Pulse de plaat op een vortexer met gemiddelde sterkte 3 maal gedurende 10 seconden elke interactie met de kralen en de fosfolipiden bevorderen. </li><li> Voeg 150 ul 5% casein aan elk putje. Meng goed door en neer te pipetteren driemaal. </li><li> Laat de plaat broeden in het caseïne-oplossing gedurende 10 minuten, dan was het uit. Te wassen, vult elk putje tot een totaal volume van 250 ui met HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS) met 1% humaan serum albumine (HSA). Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 min. Pipet en verwerp de top 200 ul van supernatant, en herhaal twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. </li><li> Voeg 50 ul van streptavidine op 333 ng / ml concentratie. Pulse de plaat weer 3x 10 sec, en laat het zitten op een shaker voor 15 min. Was 3x als in stap 6 tot en ongebonden streptavidine verwijderen. </li><li> Voeg 50 ul van de fluorescent gelabelde gebiotinyleerde antilichaam uit de eerder bereide verdunningsreeks (zie stap 3.1) aan elk putje, en vervangt de plaat op de shaker gedurende 20-30 min. Was 3x als in stap 6 om ongebonden antilichaam te verwijderen. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 100 ul HBS / 1% HSA, dan naar een FACS buis. Herhaal dit twee keer tezorgen voor efficiënte verwijdering van alle korrels uit de put, voor een totaal van 300 pl, en doe dit voor elke wel. </li><li> Breng de verkregen buizen naar de flowcytometer. Het is tijd om ze te lezen. </li><li> Voeg 1 druppel uit het flesje gemerkt &quot;B&quot; van de fluorescentie-intensiteit kalibratie (FIC) bead kit (hierna &quot;standaardreeks&quot;) in een FACS buis en verdund met 300 ui HBS / 1% HSA. </li><li> Lees deze buis, maar de data gewoon nog niet opnemen. Voor nu, gewoon zorgen dat de lege kralen goed zijn op nul gezet. Maak een histogram dat de fluorescentie van de kralen gemeten in het juiste kanaal, dan verschuiven de spanning van de excitatie laser naar beneden totdat de piek ligt in het uiterste linkerkant van het histogram. </li><li> Verwijder de buis en voeg 1 druppel van elk van de andere 4 buizen in de reeks (label 1 tot 4) aan dezelfde buis. Nu, plaats de buis in de machine weer, en het hieruit resulterende gegevens, die moet verschijnen als 5 verschillende pieken. </li&gt; <li> Lees elke individuele buis uit de reeks monsters. </li><li> Met behulp van FACS-analyse software, trek een poort die de gehele breedte van elke piek in de standaard serie histogram op de helft van de maximale punt. Dat is een poort voor elke piek. Doe hetzelfde voor elk monster. Let op de MFI (gemiddelde fluorescentie-intensiteit) voor elke poort. </li><li> Met behulp van een spreadsheet programma invoer de gemeten MFI-waarden in de juiste plaats. Ook het invoeren van de MESF (Moleculen van Equivalent Oplosbare Fluorochroom) waarden (gemiddeld aantal fluorescerende moleculen coaten elke kraal) voor elke fles die in de standaard serie. Deze informatie kan worden gevonden door het volgen van de aanwijzingen op de plastic pot de buizen kwam. </li><li> Gebruik de spreadsheet plot de MFI tegen MESF waarden, waardoor een lineaire correlatie tussen het aantal fluoroforen en de gemeten intensiteit. </li><li> Met de module &#39;eiwitten en labels in de micro-volume spectrofotometer de verhouding tussen kleurstof pro bepaleneiwit in het gemerkte antilichaam. </li><li> Voer de labelingsefficiëntie van het monstereiwit, de gemiddelde diameter van de korrels bekleed met lipiden en de MFI-waarde voor elke invoer. De spreadsheet wordt automatisch gebruik maken van de formule uit de lijngrafiek gegenereerd in stap 3.16 naar de MESF waarden te berekenen voor elk eiwit verdunning en het zaaien dichtheid van het monster eiwit bij elke concentratie. </li></ol> 4. isoleren en kweken van menselijke NK-cellen <ol><li> Aliquot 15 ml perifeer bloed of buffy coat in een 50 ml conische buis. Verdun het bloed met PBS met 1% FBS in een verhouding van 1: 1. </li><li> Voeg 13 ml Ficoll langzaam naar de bodem van de buis met 10 ml serologische pipet. </li><li> Centrifuge deze buis gedurende 20 minuten bij 1200 xg het gaspedaal en het afbreken of het laagst instellingen. </li><li> Na centrifugeren gebruik een serologische pipet tot de drijvende melkachtige witte middenlaag van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te verzamelen, which moeten zitten en de kruising tussen een heldere gele bovenste laag en een meer troebel lichtgekleurde onderlaag, die beide zitten boven een onderste laag van rode bloedcellen (RBC). NB Niet elke RBC te verzamelen in het verzamelen van de PBMCs. </li><li> Plaats de verzamelde PBMC in een nieuwe 50 ml conische buis, en verdun tot de capaciteit met PBS met 1% FBS. Centrifugeer opnieuw, ditmaal met de rem en gaspedaal maximum voor 5 min bij 300 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS met 1% FBS. </li><li> Tel de cellen tijdens nogmaals op dezelfde instellingen centrifugeren als in stap 4.6. </li><li> Verwijder het supernatant weer en resuspendeer de cellen in R10 medium bij een dichtheid van 10 miljoen cellen / ml. </li><li> Neem 30 miljoen cellen in een 5 ml polystyreen buis en isoleren NK cellen met een magnetische scheiding kit volgens de instructies van de fabrikant. Na afsluiting, tellen de cellen één en resuspendeer in een dichtheid van 500,000 cellen / ml in R10 compleet medium (88% RPMI, 10% FBS, 1% HEPES, 1% natrium pyruvaat) aangevuld met IL-2 (100 U / ml). Kweken bij 37 ° C in een CO2 incubator en vervang 2-3 maal per week medium. </li></ol> 5. Montage van de Glass-ondersteunde Planar lipidendubbellaag <ol><li> Bereid 100 ml Piranha-oplossing door het mengen van 30% waterstofperoxide met zwavelzuur in een verhouding van 1: 3 in een bekerglas. OPMERKING: voeren werken met schadelijke stoffen zoals zwavelzuur altijd in een correct aangewezen chemische dampkap. </li><li> In deze oplossing, dompel 2 rechthoekige # 1.5 dekglaasjes in piranha oplossing voor 20-30 min. OPMERKING: Het is essentieel om de dekglaasjes reinigen door piranha oplossing. </li><li> Terwijl de dekglaasjes worden gereinigd, neem 1 tube van vooraf bereide 400 uM DOPC lipiden en 1 tube van eerder 80 uM biotine-PE lipiden voorbereid. Vervoeren ze op ijs om de argon tank. </li><li> Verplaats zuurstof in een nieuwe microcentrifugebuis met argon,voeg samen de DOPC en biotine-PE bij een 1: 1 verhouding. Specifiek volume zal variëren op basis van experimentele behoeften, maar moet op minimaal 2 pl elk. Verdringen van zuurstof in het mengsel buis eenmaal meer met argon gas, en de individuele reagensbuizen ook, alvorens terug te keren van de laatste naar de koelkast. </li><li> Nadat ze klaar schoonmaken Spoel de dekglaasjes met gedestilleerd water. Stel de dekglaasjes aan de lucht drogen gedurende enkele minuten. </li><li> Zuig 1.5 ul van de liposoom mengsel bereid in stap 5.4 en aliquot in een druppel in een van de kamers baan van de kamer schuif. Het gebruik van 2 druppels per laan is typisch, maar niet noodzakelijk. </li><li> Snel en efficiënt plaats de droge dekglaasje over de druppeltjes. Zorg ervoor dat de druppels voldoende afstand zodat zij niet fuseren zodra het dekglaasje geplaatst. Zorg er verder voor dat de druppels blijven ronde en goed gedefinieerde, zonder het aanraken van de randen van de wanden. Druk deze stevig aantussen en rond elke baan om een ​​waterdichte afdichting tussen het dekglaasje en glijbaan zorgen. </li><li> Markeer de posities van de druppels met een viltstift </li><li> Pass 100 pl waterige 5% caseïne door de kamer om de bilaag te blokkeren. Probeer ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de stroom kamer. </li><li> Injecteer 100 ui streptavidine bij een concentratie van 333 ng / ml in elke laan. Incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wassen door het uitvoeren van 3 ml HBS / 1% HSA door elke baan om de overtollige streptavidine verwijderen. </li><li> Voeg 100 ul gebiotinyleerde fluorescent gemerkt anti-CD16 zoals Alexa Fluor 568 aan de eiwitconcentratie eerder bepaalde meest effectief in punt 3. Incubeer in het donker gedurende 20-30 minuten te zijn. Was opnieuw door het uitvoeren van 3 ml HBS / 1% HSA door elke baan. </li><li> Flow 100 pl D-biotine in een concentratie 25 nM door de kamer om eventuele overmaat streptavidine de kans op niet-specifieke binding van st binden waardoor derhalvereptavidin aan de cellen. </li><li> Telling NK-cellen en resuspendeer in een concentratie van 500.000 / ml in HBS / 1% HSA. </li><li> Terwijl het draaien van de cellen af, was het D-biotine uit de kamer met een andere 3 ml HBS / 1% HSA per rijstrook. </li><li> Controleer de mobiliteit van liganden op de SLB door fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) op een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie voorafgaand aan het toevoegen NK-cellen. </li><li> Nadat de cellen klaar centrifugeren en werden opnieuw gesuspendeerd in de gewenste concentratie, voeg 100 ul aan elke baan. </li><li> Plaats de kamer in een 37 ° 5% CO2 incubator gedurende 30-60 min. </li><li> Daarna worden, zet de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10-20 min. Was door het uitvoeren van 3 ml PBS door elke baan om de paraformaldehyde verwijderen. </li><li> Voeg 400 ul blokkerende buffer (5% normaal ezel serum en 0,2% Tritron X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Vlek F-actine en perforine door adding 200 ui verdund fluorescentie-gemerkt falloïdine (1 eenheid / ml gemerkt falloïdine) en fluorescentie-gemerkt anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was door draaien 3 ml PBS. De kamer is klaar voor de beeldvorming. </li></ol> 6. Beeldvorming van het NK Synapse op lipidendubbellaag behulp STED <ol><li> Zet alle benodigde hardware modules. </li><li> Start de software voor beeldanalyse. Enable zowel resonante scannen en STED modules. Na het maken van deze keuzes, wacht ongeveer 3-5 minuten voor de software te starten. </li><li> Klik op het tabblad &quot;Configuration&quot; aan de bovenkant van het scherm. </li><li> Selecteer &quot;Laser Config&quot; en zet dan het witte licht en STED 592 nm lasers. </li><li> Kies het 100x objectief, en lijn de excitatie laserstraal met de 592 nm uitputting laser. </li><li> Selecteer de &quot;Laser Config&quot; module, schakel dan de 592 uitputtinglaser, en afslag op de 660 nm uitputting laser. </li><li> Plaats de dia op het toneel, over de lens. Breng de cellen gebonden op de afgebakende bilayer regio in beeld met behulp van het witte licht lamp en de lenzen. </li><li> Terug naar het tabblad &quot;Acquisition&quot;, direct aan de rechterkant van het tabblad &quot;Configuratie&quot;. </li><li> Klik op het tabblad &quot;Overschakelen naar WhiteLight&quot;, zet dan die module op en sleep de excitatie laser lijn naar de juiste golflengte. </li><li> Selecteer de gewenste detector uit de lijst van beschikbare kamers, stel vervolgens het detectiebereik van de passende reeks van golflengten omvatten. OPMERKING: NOOIT het detectiebereik direct onder de excitatiebundel. </li><li> Klik op de &quot;Seqential&quot; knop in de linker &quot;Acquire&quot; werkbalk om de Sequential Scanning dialoog in de bodem van de werkbalk linker brengen. Hierdoor kan de gebruiker meerdere sequenties toevoegen, elkeen andere excitatie balk een andere kleur. Klik op &quot;Tussen Frames&quot;, en vervolgens de excitatiefrequentie, detector, en detectiebereik voor elke extra kleur als in de stappen 6.9 en 6.10. </li><li> Als alle instellingen zijn geoptimaliseerd, hit &quot;Start&quot; om de overname te beginnen. </li><li> Breng de gratis deconvolutie software (Huygens) met behulp van een instelling ontworpen voor STED deconvolutie, zoals eerder 13 beschreven. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De nieuwheid van de huidige studie is dat het een combinatie van de SLB-techniek met STED NK cel synapsen bestuderen. Eerdere studies hebben de lipidebilaag afgebeeld met TIRF aan T-cel synapsvorming 8 en signalering molecuul mensenhandel op het plasmamembraan 6 bestuderen. Anderen hebben STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven met behulp van antilichamen gecoat glas dia 13,14. De hybride werkwijze die hierin verder beschreven bouwt voort op deze inspanningen van de beeldvorming van de NK-cel synaps met de verbeterde helderheid geboden door super-resolutie beeldvorming over de lipidebilaag oppervlak, dat betere modellen het dynamische oppervlak van een APC. Hoewel SLBs zijn kunstmatige membranen ontbreken van cytoskelet, lipid rafts en andere liganden die eigenlijke doel cellen of APC&#39;s bezitten, kan deze techniek belangrijke functies, zoals de mobiliteit en oriëntatie van liganden recapituleren. Dit maakt het SLB systeem dienen als reductionistische benadering ontleden tHij bijdrage van individuele receptoren en liganden voor de vorming van de IS en de dynamiek van IS. Het belangrijkste kenmerk van SLBs dat onderzoekers deze techniek met hoge resolutie beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie en TIRF kunnen combineren. De introductie van STED microscopie nog verder verhoogt dit voordeel, het verstrekken van ongekende inzichten in IS onderzoek en de klinische toepassingen. Een mogelijke kritiek van dit systeem is dat de SLB het complex oppervlak van een APC niet adequaat nabootsen en dus het potentieel niet-fysiologische anatomische kenmerken in de resulterende synapsen. Hoewel het waar is dat de beperkte repertoire van oppervlaktemoleculen op de SLB niet volledig herhalen het heterogeen bevolkte oppervlak van een APC, kan deze limiet ook voordelig zijn doordat zij kunnen onderzoekers de invloed van afzonderlijke receptor en ligand interacties op synapsvorming bepalen . THier zijn een aantal cruciale stappen in het proces. Een van de meest kritische is dat oxidatie van de liposomen worden voorkomen door voortdurend met argon om de zuurstof in de buis en oplossing verplaatsen zoals in stap 1.10, 2.6 en 2.11. Oxidatie van de lipiden leidt tot verminderde lipiden mobiliteit, waardoor de mogelijkheid van oppervlakte-eiwitten vrij kunnen bewegen en deelnemen synaptische structureren belemmeren. Evenzo is het ook cruciaal voor al chloroform in het liposoom verwijderd door lyofilisatie (stap 1.2). Bij het bepalen van eiwit dichtheid in de lipide bilaag, is het van belang om eerst dispergeren silicium korrels in een homogene suspensie vrij van clusters. Indien nodig, kan sonicatie kralen worden toegepast. Bij de montage van de SLB, de eerste stappen (5,1-5,8), waarin de dekglaasjes worden gereinigd, de druppels zijn geplaatst, en dekglaasje wordt aangebracht zijn van vitaal belang. Een fout in een van deze kan noodzakelijk het starten van het experiment boven (vanaf het begin van hoofdstuk 5). Daarom is hetgoede gewoonte om meer coverslips schoon te maken dan nodig zal zijn om tijd te besparen in het geval van een ongeluk. Niet-clustering is de meest voorkomende probleem bij het werken met dit systeem. Indien bij het visualiseren van de cellen in de laatste stap, een niet fluorescerend synapsen vinden, zijn er een paar stappen die genomen kunnen worden. Een vlek van de verwante celoppervlak receptor worden toegevoegd aan de kamer om te verifiëren dat de cel niet vormde een synaps met de bilaag, terwijl cellen niet-specifiek hechten aan de glazen dekglaasje of bilaag oppervlak synaptisch-betrokken oppervlakte-eiwitten moeten weergegeven als afzonderlijke clusters op het vlak van de cel-bilaag-interface, terwijl unengaged oppervlakte eiwitten diffuse kleuring verschijnt rond de omtrek van de cel. Indien deze methode niet, moet men de cellen via flowcytometrie te controleren of het specifieke marker men hoopt studeren wordt uitgedrukt in gepaste overvloed op het celoppervlak. Bepaalde oppervlak proteins is bekend dat neerwaarts gereguleerd op lange termijn in vivo kweken. Hoewel dit protocol informatie specifiek hoe NK cel synapsvorming visualiseren, kan de SLB-systeem worden gebruikt om synapsvorming studeren in elke immunocyt denkbare simpelweg door substitutie van de primaire ligand in stap 5.11. Meerdere liganden kunnen ook gelijktijdig worden toegevoegd. Men hoeft ook geen streptavidine-biotine systeem voor het hechten van de oppervlakte-eiwitten in de bilaag. Nikkel-NTA: histidine interacties zijn ook haalbaar. Echter, vanwege de hoge sterkte en specificiteit van de streptavidine: biotine interactie, ons lab voorkeur dit systeem. Men kan ook variëren van de concentratie van cellen toegevoegd aan de bilaag van de voorgeschreven dichtheid in stap 5.13, alsmede de duur van de daaropvolgende incubatietijd om synapsen observeren in verschillende stadia van rijping. Dit kan zelfs live worden gedaan, hoewel dit natuurlijk sluit de mogelijkheid van het visualiseren van intracellulaire structures (tenzij ze al zijn gelabeld met een gesmolten fluorescerend label; ons lab maakt gebruik van een paar van zulke veranderde cellijnen). Door de hoge mate van maatwerk mogelijk in dit protocol, kan men de elementaire SLB techniek te gebruiken, samen met STED beeldvorming, een ongelooflijk breed scala aan vragen in de immunologie, celbiologie en biochemie aan te pakken, met inbegrip van basis lipide dynamiek 15, synapsvorming 16 intracellulaire signalering 17 en tumorcelmetastase 18.

De immunologische synaps (IS) ligt op een cruciaal knooppunt voor cel activatie en functie 1. Het is de primaire middel waardoor antigeenpresentatie en celgemedieerde immuniteit worden uitgevoerd. De vroegste microscopische studies van synapsvorming gebruikt een cel- conjugaat systeem 2. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat de meeste conjugaten worden gezien in profiel, als het ware, waardoor weergave van de synaptische structuur zelf van de waarnemer beperken. In 1999, het Dustin laboratorium gericht deze beperking door gebruik te maken van de glas-ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) techniek 3, die al eerder door de McConnel laboratorium van 4,5 had een pionier. Deze benadering verwijderd antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) ten gunste van een glas ondersteunde vlakke lipide oppervlak waarin eiwitten kunnen worden bevestigd en vrij bewegen in twee dimensies. Met behulp van deze methode, waren Dustin en collega&#39;s in staat om direct tot peer in thij synaps met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie, en voor de eerste keer krijg je een &quot;face-to-face&quot; blik op de structuur van de IS. Met het gebruik van SLB systeem heeft de details waarmee de IS kan worden gevisualiseerd is beperkt door de beperkingen van de huidige beeldvormingstechnieken 6-8. Met behulp van standaard technieken verlichting, de minimale resolutie (dwz minimumafstand tussen twee verschillende voorwerpen waarin zij onderscheiden kunnen worden) is &lt;200 nm op basis van Rayleigh criterium 9. Deze beperking belemmert de beeldvorming van zeer fijne, moleculaire schaal bouwsels de synaps en tot de ontwikkeling van superresolutie beeldvormingstechnieken 10-12, werd visualisatie van deze structuren beperkt tot beeldvorming van gefixeerde cellen met elektronenmicroscopie. Met de recente komst van een verscheidenheid van super-resolutie technieken zoals SIM (gestructureerde verlichting microscopie), PALM (fotogeactiveerde lokalisatie microscopie), STORM (stochastische optische reconstructie microscopie), en STED 10-12, onderzoekers zijn nu in staat om deze synaptische structuren te bestuderen in ongekend detail, dat heeft op zijn beurt voorzien van een steeds duidelijker begrip van de IS. De voordelen van STED microscopie beschreven vóór 13. Hier beschrijven we super-resolutie beeldvorming met STED microscopie uitgerust met de nieuw ontwikkelde 660 nm uitputting laser. Vergeleken met de conventionele 592 nm uitputting laser, de 660 nm laser maakt een bredere selectie van fluorescerende kleurstoffen (zie http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), vooral deze rode fluoroforen. Andere publicaties hebben de STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven op antilichaam-gecoate glaasjes 13,14. Hier wordt de SLB-systeem in combinatie met super-resolutie STED microscopie aan de NK-cel synaps bestuderen. Deze techniek heeft het voordeel boven antilichaambeklede objectglaasjes van een vloeistof is mozaïek, waarbij het ingebedde manteleiwitten vrij in een vlakke tweedimensionale vlak (XY-vlak) kan bewegen. Dit bootst getrouwer de organische en mobiele oppervlak van een doelcel, en derhalve beter recapituleert de vorming van een fysiologisch relevante immune synaps. Het doel van dit protocol is om de eindgebruiker met een gedetailleerde beschrijving van hoe het imago van de immunologische synaps van NK-cellen te bieden door het combineren van de SLB-systeem en super-resolutie STED microscopie. Het zal de eindgebruiker met de stappen die nodig zijn om te voorzien: de voorbereiding van de liposomen, bouwen-eiwit ingebed dubbellagen, bepalen de eiwit dichtheid op de lipidendubbellagen, en het verwerven van super-resolutie beelden met behulp van STED microscopie. Deze technieken zijn niet beperkt tot het gebied van immunologie, en kan breed worden toegepast in verschillende disciplines.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&Delta;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (natriumzout)</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Argon gas, gecomprimeerd</td><td>Airgas&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Een lyofilisator</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Lyofilisatiebuizen</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Chromatografiekolommen</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Octyl-β-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Dialysebuizen</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&nbsp;</a></td><td>132676</td><td>Liposoombereiding</td></tr><tr><td>96-well V-bodem polystyreen plaat (onbehandeld)</td><td>Corning</td><td>3896</td><td>antilichaamdichtheidsbepaling</td></tr><tr><td>Niet-gefunctionaliseerde silica-kralen</td><td>Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>SS06N</td><td>antilichaamdichtheidsbepaling</td></tr><tr><td>FACS-buizen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>antilichaamdichtheidsbepaling</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF-kralen</td><td>Bangs Laboratories</td><td>Variabel</td><td>antilichaamdichtheidsbepaling</td></tr><tr><td>Caseïne&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0875</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>HEPES gebufferde zoutoplossing + 1% HSA</td><td>Huisgemaakt</td><td></td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>Streptavidine&nbsp;</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>434301</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>Fluorescent gelabeld biotinyleren eiwit&nbsp;</td><td>Huisgemaakt</td><td></td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>25x75 mm glazen dekglas</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (30%)</td><td>Fisher Scientic&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>D-Biotine</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>Lipid bilayer voorbereiding</td></tr><tr><td>Lenspapier</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Type F Immersieolie</td><td>Leica&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Een Leica TCS STED microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Voor beeldvorming</td></tr></tbody></table>

super-resolutie beeldvorming van de natural killer cell immunological synapse op een glas-ondersteunde planar lipidendubbellaag

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Het glasondersteunde planaire lipide dubbellaagsysteem is in verschillende disciplines gebruikt. Een van de meest nuttige toepassingen van deze techniek is geweest in de studie van de vorming van de immunologische synaps, vanwege het vermogen van de glasondersteunde planaire lipide dubbellagen om het oppervlak van een doelcel na te bootsen terwijl ze een horizontale interface vormen. De recente vooruitgang in superresolutie-beeldvorming heeft wetenschappers verder in staat gesteld om de fijne details van de synapsstructuur beter te bekijken. In deze studie wordt een van deze geavanceerde technieken, gestimuleerde emissiedepletie (STED), gebruikt om de structuur van natuurlijke killer (NK) celsynapsen op de ondersteunde lipide dubbellaag te bestuderen. Hierin wordt een eenvoudig te volgen protocol gedetailleerd: hoe rauwe synthetische fosfolipiden te bereiden voor gebruik bij het synthetiseren van glasondersteunde dubbellagen; hoe te bepalen hoe dicht een eiwit van een bepaalde concentratie de bindingsplaatsen van de dubbellaag bezet; hoe een ondersteunde lipide dubbellaag te construeren die antilichamen bevat tegen het NK-celactiverende receptor CD16; en ten slotte, hoe menselijke NK-cellen op deze dubbellaag kan beeldhouwen met behulp van STED-superresolutiemicroscopie, met een focus op de verdeling van perforine-positieve lytische korrels en filamenteus actine op NK-synapsen. Door het glasondersteunde planaire lipide dubbellaagsysteem te combineren met de STED-techniek, demonstreren we de haalbaarheid en toepassing van deze gecombineerde techniek, evenals intracellulaire structuren bij NK-immunologische synaps met superresolutie.

Figuur 1 toont het resultaat van het antilichaam dichtheid van de lipide bilaag. Het principe is standaard kraaltjes met de standaardkromme van MESF versus MFI via stroomcytometrie (A) maken. De MFI van de reeks monsters werd omgezet in MESF met de standaard curve. Het antilichaam dichtheid van de lipide bilaag lineair gecorreleerd met de concentratie antilichaam (B). Figuur 2 toont de triple-color STED beeld van NK synaps op glas support vlakke lipide dubbellaag. Anti-CD16 antilichaam op de lipide bilaag accumuleert, triggering F-actine vorming en de polarisatie en penetratie van perforine via de F-actine maas in het brandpunt panel van immunologische synaps NK-cellen. Met behulp van deze gecombineerde aanpak, kan men netjes houden aan de microclusters van fluorescent gelabelde anti-CD16 binnen de SLB, die direct weerspiegelt de clustering van CD16 op het NK cel. Vergeleken met de conventionele confocale beeld, de structuur van CD16 central cluster wordt gemakkelijker onderscheiden in beeld STED vanwege de uitgeputte ambient fluorescentie. Bovendien wordt de ultrastructuur van het actine cytoskelet zien met aanzienlijk verbeterde resolutie. In overeenstemming met eerdere waarnemingen 16,17, worden de perforine-positieve lytische korrels gezien gepositioneerd boven gebieden met een lage F-actine dichtheid in de STED afbeelding, een cruciaal detail die meestal is verloren in de confocale afbeelding. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Dichtheid van 3G8 antilichaam op lipide bilaag. (A) lineaire correlatie tussen MESF en MFI voor standaard series. (B) Lineaire correlatie tussen eiwit dichtheid en concentratie monstereiwit verdunningsreeks, waarin het aantal fluorescentie-gemerkt eiwit monomeren per oppervlakte-eenheid als functie van toenemende concentratie op lipiden gecoate siLica kralen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Figuur 2. STED beeldvorming van NK synaps op vlakke lipide dubbellaag. Primaire NK-cellen werden gestimuleerd op de SLB met gebiotinyleerde fluorescent gemerkt anti-CD16 (rood), vaste, permeabel, en vervolgens gekleurd met falloïdine (blauw) en anti-F-actine (groen). Een afzonderlijke cel werd voor het eerst in beeld gebracht onder de normale confocale instelling en de STED instelling. Confocale en STED beelden werden deconvoluted behulp Huygens software. Schaal bar, 1 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.</a>

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe superresolutiebeelden van de immunologische synapsen van natural killer-cellen (NK-cellen) op een ondersteunde lipide dubbellaag succesvol kunnen worden vastgelegd. Dit wordt bereikt door in kamerslides een glas-ondersteunde planaire lipide dubbellaag te construeren die antilichamen tegen de NK-cel-activerende receptor CD 16 bevat. De eerder geïsoleerde NK-cellen worden vervolgens toegevoegd aan de planaire lipide dubbellaag waarin antilichamen zijn ingebed, gevolgd door het kleuren van de cellen voor f-actine en perforine.De laatste stap is de beeldvorming van de resulterende NK-celsynapsen met de stead-microscoop, waarbij uiteindelijk de NK-synaps op de ondersteunde lipide dubbellaag wordt afgebeeld. Het gebruik van stead toont de NK-celsynaps in verhoogde detailgraad, wat visualisatie mogelijk maakt van de ultrastructuur van het actine-cytoskelet en perran-positieve lytische granula die gepositioneerd zijn boven regio's met een lage F-actine dichtheid. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de glazen ondersteuningsvlak-lipidebarrière het plasmamembraan van de doelcel en de eiwitten op deze lipidebarrière kan nabootsen.Ze kunnen zich zijdelings bewegen, wat de vorming van een immunologische synaps op een biologisch relevantere wijze kan nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het vakgebied van de immunologie, doordat onderzoekers de synapsvorming op een gecontroleerde manier en in detail kunnen visualiseren, wat onmogelijk is met commerciële en microscopische benaderingen. Een postdoc en een promovendus zullen de procedure demonstreren om de op glas ondersteunde planaire lipide dubbellaag te assembleren.Bereid eerst 100 milliliters piranha-oplossing door 30% waterstofperoxide te mengen met zwavelzuur in een verhouding van één op drie in een bekerglas. Plaats twee rechthoekige dekglasjes nummer 1.5 gedurende 20 tot 30 minuten in deze oplossing om de dekglasjes te reinigen. Pak één buisje van eerder bereide 400 micromolar DOPC-lipiden en één buisje van eerder bereide 80 micromolar biotine PE-lipiden.Transporteer ze op ijs naar de argontank nadat een nieuwe microcentrifugebuis is gedeoxygeneerd met argon. Voeg de DOPC en biotin PE in een verhouding van één-op-één aan elkaar toe. Het specifieke volume varieert afhankelijk van de experimentele behoeften, maar moet minimaal 2 µL bedragen.Ontlucht elke buis met het mengsel en de individuele reagensbuizen voordat de ladder terug in de koelkast wordt geplaatst. Spoel na het reinigen de dekglasjes grondig af met gedestilleerd water. Laat de dekglasjes enkele minuten aan de lucht drogen, neem vervolgens 1,5 µL van het liposoommengsel op en breng dit als een enkele druppel aan in een van de baancompartimenten van een chamber slide.Het gebruik van twee druppels per baan is gebruikelijk, maar niet noodzakelijk. Plaats nu snel en efficiënt het droge dekglas over de druppels; zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar staan zodat ze niet samenvloeien zodra het dekglas is geplaatst. Zorg er daarnaast voor dat de druppels rond en duidelijk begrensd blijven zonder de randen van de kamerwanden te raken.Druk stevig tussen en rond elke baan om een waterdichte afsluiting van de afdekking te garanderen. Markeer de posities van de druppels door deze te verschuiven en glijden met een markerpen. Laat vervolgens 100 µL waterige 5% casing door de kamer stromen om de dubbellaag te blokkeren.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de stroomkamer aanwezig zijn. Injecteer vervolgens 100 µL streptavidine met een concentratie van 333 ng/mL in elke lane. Na incubatie gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur wordt gewassen door drie mL HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine door elke lane te leiden.Om het overschot aan streptavidine te verwijderen, voegt u 100 µL biotinylerede, fluorescent gelabelde anti-CD16 toe bij de eiwitconcentratie die eerder is bepaald zoals beschreven in het tekstprotocol, gevolgd door incubatie in het donker gedurende 20 tot 30 minuten. Was opnieuw door drie mL HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine door elke lane te spoelen. Laat vervolgens 100 µL D-biotine met een concentratie van 25 nM door de kamer stromen om elk overschot aan streptavidine te binden en zo de kans op aspecifieke binding van streptavidine aan de cellen te elimineren.Tel vervolgens de menselijke NK-cellen en resuspendeer deze in een concentratie van 500, 000 per milliliter in HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine. Was de D-biotine uit de kamer met nog eens drie milliliter HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% menselijk serumalbumine per lane. Zodra de cellen zijn geresuspendeerd in de gewenste concentratie, voegt u 100 microliters toe aan elke lane.Plaats de kamer gedurende 30 tot 60 minuten in een incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Fixeer na deze incubatieperiode de cellen met 4% paraform aldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 minuten. Was door drie milliliters phosphate buffered saline door elk kanaal te laten lopen om het paraform aldehyde te verwijderen.Voeg vervolgens 400 µL blokkeringsbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Kleur daarna f actin en perforine door twee µL verdunde fluorescentie-gelabelde Phin en fluorescentie-gelabelde anti-perforine monoklonaal antilichaam toe te voegen; incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur en was vervolgens door drie mL fosfaatgebufferde zoutoplossing door de kamer te spoelen. De kamer is nu gereed voor de start van de beeldvorming.Schakel alle benodigde hardwaremodules van de STEAD-microscoop in. Start de software voor beeldanalyse op en activeer zowel de resonantiescan- als de STEAD-modules. Wacht na het maken van deze selecties ongeveer drie tot vijf minuten tot de software is opgestart.Klik op het configuratietabblad bovenaan het scherm en selecteer 'laser config'. Zet vervolgens het witte licht en de stabiele 592 nanometer lasers aan. Kies het 100 x objectief en lijn de excitatielaserstraal uit met een 592 nanometer depletiemlaser.Selecteer de laserconfiguratiemodule, schakel de 592 depletionlaser uit en schakel de 660 nanometer depletionlaser in. Plaats het objectglas op de tafel boven de lens. Breng de cellen die gebonden zijn aan het afgebakende dubbellaagsgebied in focus met behulp van de witlichtlamp en de oculairs.Keer vervolgens terug naar het tabblad acquisitie direct rechts van het tabblad configuratie. Klik op het tabblad voor het schakelen naar wit licht, schakel deze module vervolgens in en sleep de excitatielaserlijn naar de juiste golflengte. Nadat de gewenste detector is geselecteerd en het detectiebereik is ingesteld, klikt u op de knop sequentieel in de linker acquisitiebalk om het dialoogvenster voor sequentiële scanning onderaan de linkerbalk te openen.Hiermee kan de gebruiker meerdere sequenties toevoegen, elk met een verschillende excitatiestraal voor een andere kleur. Klik tussen de frames en stel vervolgens de excitatiefrequentiedetector en het detectiebereik in voor elke extra kleur. Zodra alle instellingen zijn geoptimaliseerd, klikt u op start om het acquisitieproces te beginnen.De driekleurige STEAD-afbeelding van de NK-celsynaps op een door glas ondersteunde planaire lipide dubbellaag laat zien dat het anti-CD 16-antilichaam, weergegeven in rood, zich ophoopt op de lipide dubbellaag, wat de vorming van F-actine triggert, evenals de polarisatie en penetratie van perforine, weergegeven in blauw, door het F-actine-netwerk in het focale vlak. Met deze gecombineerde aanpak kunnen de microclusters van fluorescentielabelled anti-CD 16 binnen de door glas ondersteunde lipide dubbellaag duidelijk worden waargenomen, wat een directe weerspiegeling is van de clustering van CD 16 op de NK-cel. Vergeleken met de conventionele confocale afbeelding is de ringstructuur van het centrale CD 16-cluster in de STEAD-afbeelding gemakkelijker te onderscheiden vanwege de verminderde omgevingsfluorescentie.Bovendien is de ultrastructuur van het actine-cytoskelet zichtbaar met een aanzienlijk verbeterde resolutie. In overeenstemming met eerdere observaties zijn de perin-positieve lytische granula gepositioneerd boven regio's met een lage F-actine-dichtheid. In de stead-afbeelding is een cruciaal detail zichtbaar dat grotendeels verloren gaat in de confocale afbeelding. Zodra de techniek onder de knie is, kan de uitvoering ongeveer vier uur in beslag nemen, mits deze correct wordt uitgevoerd.Het is belangrijk om te onthouden dat het monster zuurstofvrij moet blijven door herhaaldelijk de zuurstof te verdrijven met argon, en bij het assembleren van de kamer door het dekglas snel op het monster te plaatsen en dit vervolgens onder te dompelen in de inkapselingsoplossing.

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Hier tonen we methoden voor het verankeren van celadhesie eiwitten waarvan bekend is dat moduleren synapsvorming naar de bovenste folder van de lipide bilyer en synapsvorming met behulp van TIRF microscopie visualiseren.

Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

In this video, we describe the lattice light-sheet microscopy technique to visualize interactions between live T-cells and antigen-presenting cells. The method involves focusing an ultrathin lattice light sheet on an interacting cell pair to obtain a series of two-dimensional images, which are combined to obtain high-resolution four-dimensional images that reveal the spatiotemporal dynamics of the cell-cell interaction.

Lattice Light Sheet Microscopy to Visualize Receptor-Ligand Interactions in Live Cells

This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

This video demonstrates an in vitro technique to study immune synapse formation between primary human T cells and supported lipid bilayers (SLB). T cell surface proteins interact with respective ligands immobilized on SLB to form an immune synapse, followed by the movement of lytic granules towards the synapse, which is visualized using fluorescence microscopy.

An In Vitro Technique to Study T Cell Interaction with Supported Planar Lipid Bilayers

Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Het protocol beschrijft een techniek om te bestuderen van de mogelijkheid van primaire polyklonale menselijke T cellen vormen van synaptic interfaces met behulp van vlakke lipide bilayers. We gebruiken deze techniek te laten zien van de differentiële synapse formatie vermogen van menselijke primaire T-cellen afgeleid van lymfeklieren en perifeer bloed.

Beoordeling van de synaptische Interface van primaire menselijke T-cellen uit perifeer bloed en lymfoïde weefsel

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Leer super-resolutiebeeldvorming van immunologische synapsen van NK-cellen met behulp van STED-microscopie en glas-ondersteunde planaire lipidebilayers. Deze methode onthult de ultrastructuur van het actinecytoskelet en perforinegranula.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Meer video's verkennen