Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe succesvol superresolutiebeelden van de immuunsynapsen van natuurlijke killer- of NK-cellen op de ondersteunde lipide dubbellaag kunnen worden vastgelegd. Dit wordt bereikt door een glasondersteunde vlakke lipide dubbellaag te construeren met antilichamen tegen NK-cel activerend receptor CD 16 In kamerslides. De eerder geïsoleerde NK-cellen worden vervolgens toegevoegd aan de vlakke, met antilichamen ingebedde lipide dubbellaag, gevolgd door kleuring van de cellen met f actin en perforine.

De laatste stap is het beeldvormen van de resulterende NK-celsynapsen met behulp van de stead-microscoop, uiteindelijk het beeldvormen van de NK-synapse op de ondersteunde lipide dubbellaag. Het gebruik van stead toont de NK-celsynapse in verbeterde detail, wat de visualisatie van de ultrastructuur van het actinocytoskelet en perran-positieve lytische korrels mogelijk maakt die gepositioneerd zijn over gebieden met lage F-actinedensiteit. Het voordeel van deze techniek is dat de glazen ondersteunende vlakke lipide barrière de plasmamembraan van de T-cel kan nabootsen, het eiwit op deze vlakke lipide barrière.

Ze kunnen lateraal bewegen, wat een betere replicatie van de vorming van een logisch relevante immunosynapse kan veroorzaken. Deze boodschap kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, waardoor onderzoekers de synapsevorming kunnen visualiseren op een gecontroleerde manier met details, wat onhaalbaar is met commerciële en microscopische benaderingen. Een postdoc-fellow schilderij en een afstudeerstudentenbeurs zullen de procedure demonstreren om de glasondersteunde vlakke lipide dubbellaag te assembleren.

Eerst bereid 100 milliliter piranha-oplossing door 30% waterstofperoxide te mengen met zwavelzuur in een beker in een verhouding van één op drie. Plaats twee rechthoekige nummer 1,5 dekglasjes gedurende 20 tot 30 minuten terwijl de dekglasjes worden schoongemaakt. Haal één buis met eerder bereide 400 micromolar DOPC-lipiden en één buis met eerder bereide 80 micromolar biotin PE-lipiden op.

Transporteer ze op ijs naar de argontank nadat een nieuwe microcentrifugebuis met argon is gedeoxygeneerd. Voeg samen de DOPC en biotin PE toe in een verhouding van één op één. Het specifieke volume kan variëren op basis van experimentele behoeften, maar moet minimaal twee microliter zijn.

Elk deoxygeneer de mengbuis en de afzonderlijke reagensbuizen voordat de ladder terug wordt geplaatst in de koelkast. Nadat ze klaar zijn met schoonmaken, spoel de dekglasjes grondig af met gedestilleerd water. Laat de dekglasjes een paar minuten aan de lucht drogen, trek vervolgens 1,5 microliter van het liposoommengsel aan en verdeel het in een enkele druppel in een van de baankamers van een kamerslide.

Het gebruik van twee druppels per baan is typisch, maar niet noodzakelijk. Plaats nu snel en efficiënt het droge dekglas over de druppels, zorg ervoor dat de druppels voldoende ruimte hebben zodat ze niet samensmelten zodra het dekglas is geplaatst. Zorg er verder voor dat de druppels circulair en goed gedefinieerd blijven zonder de randen van de kamerwanden aan te raken.

Druk stevig tussen en rond elke baan om een waterdichte afdichting tussen het dekglas te garanderen. Markeer de posities van de druppels met een stift. Geef vervolgens 100 microliter aqueus 5% casing door de kamer om de dubbellaag te blokkeren.

Probeer ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de flowkamer zijn. Injecteer vervolgens 100 microliter streptadine met een concentratie van 333 nanogram per milliliter in elke baan. Na incubatie gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur, spoel door drie milliliter heaps gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine door elke baan te laten lopen.

Om de overtollige tritin te verwijderen, voeg 100 microliter biotinyleren fluorescerend gelabeld anti CD 16 toe bij de eerdere bepaalde eiwitconcentratie zoals beschreven in het tekstprotocol na incubatie in het donker gedurende 20 tot 30 minuten. Spoel opnieuw door drie milliliter heaps gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine door elke baan te laten lopen. Stroom vervolgens 100 microliter D-biotine met een concentratie van 25 nanomolar door de kamer om eventuele overtollige STR tabine te binden en zo de kans op niet-specifieke binding van STR tabine aan de cellen te elimineren.

Tel vervolgens menselijke NK-cellen en resuspendeer ze in een concentratie van 500.000 per milliliter in heaps gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine. Was de D-biotine uit de kamer met nog eens drie milliliter heaps gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine per baan. Zodra de cellen in de gewenste concentratie zijn gesuspendeerd, voeg 100 microliter toe aan elke baan.

Plaats de kamer in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator gedurende 30 tot 60 minuten. Na deze incubatieperiode, fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 minuten. Spoel door drie milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing door elke baan te laten lopen om het paraformaldehyde te verwijderen.

Voeg vervolgens 400 microliter blokkeerbuffer toe voordat je bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten incubeert. Vervolgens kleur je f-actine en perforine door twee microliter verdunde fluorescerend gelabelde Phin en fluorescerend gelabelde anti-perran monoklonaal antilichaam toe te voegen en in te cuberen bij kamertemperatuur gedurende één uur voordat je door drie milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing door de kamer te laten lopen. De kamer is klaar om met beeldvorming te beginnen.

Schakel alle benodigde hardwaremodules van de stead-microscoop in. Start de beeldanalysesoftware en schakel zowel resonante scanning als stead-modules in. Wacht na het maken van deze selecties ongeveer drie tot vijf minuten totdat de software is gestart.

Klik op het configuratietabblad bovenaan het scherm, selecteer laserconfig. Schakel vervolgens het witte licht en de stead 592 nanometer