Name: Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer TALEN-gemedieerde genbewerking in humane iPSCs via nucleofectie en puromycine-selectie. Deze methode genereert stabiele GFP-expresserende klonen in de AAVS1 safe harbor voor onderzoek naar stamcelbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het NIH Common Fund en het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases.

1. Voorbereiding van basaalmembraanziekte Matrix en Coating van Plasticware <ol><li> Leg de bevroren basaal membraan matrix voorraad van -20 ° C op ijs en het ontdooien overnacht bij 4 ° C. </li><li> Na ontdooien pipet 2 mg aliquots van basaalmembraan matrix in vooraf gekoelde eppendorfbuizen. Bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is. </li><li> Voor te bereiden basaal membraan-matrix gecoate platen, ontdooien één portie op ijs tot het laatste stuk ijs in de eppendorfbuis verdwijnt (meestal binnen ~ 2 uur). </li><li> Na ontdooien voeg basaalmembraan matrix 12 ml koude (4 ° C) DMEM / F12 basaalmembraan matrix coating oplossing. </li><li> Voeg basaal membraan matrix oplossing voor de juiste cultuur vat. Voor een 6-well plaat, afzien van 1 ml per putje. Zwenk de plaat om te zorgen dat het basaal membraan matrix oplossing dekt volledig elk putje. </li><li> Parafilm verzegelen het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, en incubeer bij room temperatuur gedurende 1 uur voor gebruik. Als alternatief winkel basaal membraan-matrix gecoate platen / borden bij 4 ° C en binnen 2 weken van de coating. OPMERKING: Voeg extra DMEM / F12 om het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schaal om uitdroging te voorkomen. Voor het gebruik van 4 ° C bewaard basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, plaats hem in een biologisch veiligheidskabinet en laat deze op kamertemperatuur komen gedurende ten minste 30 min. </li><li> Zuig basaalmembraan matrix volledig vóór de toevoeging van medium en cellen. </li></ol> 2. Voorbereiding van de E8 medium <ol><li> Bereid E8 kweekmedium door het ontdooien van E8 supplement overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 10 ml E8 basaal medium uit de 500 ml bouillon en gooi ze weg. </li><li> Pipetteer de gehele 10 ml flacon van E8 supplement direct in 490 ml E8 basaal medium. Doe niet warm volledige E8 medium in een 37 ° C waterbad, zo herhaalde temperatuurschommelingen de bFGF kan worden afgebroken in het complete E8 medium. </li><li> Gebruik volledige E8 medium binnen 2 weken na toevoeging van het supplement. </li></ol> 3. Het ontdooien van iPSCs <ol><li> Verwijder een flacon van bevroren iPSCs van vloeibare stikstof en plaats op droog ijs. </li><li> Snel ontdooien van de flacon in een 37 ° C waterbad; zwenk de flacon in het waterbad tot er slechts een klein fragment van ijs resten. </li><li> Spray de flacon met 70% ethanol en transfer naar een biologisch veiligheidskabinet. </li><li> Voeg 1 ml kamertemperatuur E8 medium druppelsgewijs direct aan het flesje. </li><li> Met behulp van een pipet 2 ml, breng de celsuspensie druppelsgewijs in 9 ml E8 medium in een 15 ml conische buis. Schud de buis regelmatig zodat de cellen en medium meng goed snel. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in een geschikt volume E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632. </li><li> Voeg de cellen om een ​​passend aantal kelder membrane-matrix beklede putjes, en plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator &#39;s nachts. Het wordt aanbevolen om de plaat ten minste 0,2 x 10 6 iPSC per putje van een 6-wells plaat te snel herstel na ontdooiing mogelijk te maken. </li></ol> 4. Onderhoud en Routine passage van de iPSCs <ol><li> Vernieuwen E8 medium dagelijks. </li><li> Controleer de morfologie en confluentie van cellen met een omgekeerde microscoop. iPSCs van hoge kwaliteit te groeien in flat kolonies met duidelijke grenzen; individuele kolonies bezitten een &quot;geplaveide-achtig &#39;uiterlijk. </li><li> Passage van de iPSCs cellen wanneer ze bereiken ~ 70% confluentie. </li><li> Bereid een EDTA passage door toevoeging van 0,9 g NaCl en 500 pi 0,5 M EDTA tot 500 ml DPBS. Meng goed op te lossen NaCl, en vacuüm filter te steriliseren. Warm een ​​hoeveelheid van de passage oplossing in een 37 ° C waterbad voor passage. </li><li> Om passage, aspiratie verbruikte kweekmedium en was cellen eenmaal met een gelijk volume warme pasSaging oplossing. Aspireren, en pipet genoeg EDTA passage oplossing voor de vacht van de cellen (1 ml per putje van een 6-wells plaat). </li><li> Plaats de cellen onder een omgekeerde microscoop en observeer de iPSC kolonies. Het verschijnen van gaten in kolonies en verhoogde randen moeten duidelijk worden binnen 2 tot 5 minuten. </li><li> Zuig het EDTA passage oplossing zorgvuldig. </li><li> Pipetteer 10 ml afzien 4 ml E8 medium (bij gebruik van een 6-wells plaat) onder hoge druk direct in elk putje worden gepasseerd. </li><li> Verzamel de iPSC bosjes, en opgesplitst in een passend aantal putten, afhankelijk van de split-ratio van 1: 8 tot 1:12. Niet over-pipet, als uitsplitsing van celklonten zal resulteren in slechte levensvatbaarheid. </li><li> Plaats de plaat in een couveuse, en rock de plaat heen-en-weer en side-to-side meerdere malen om de cellen te verspreiden. </li></ol> 5. Voorbereiding van de MEF en iPSCs voor Tansfection <ol><li> 48 uur voorafgaand aan transfection, passage iPSCs bij ~ 1: 6 in vier of meer putjes van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat, waardoor ze 70% confluent twee dagen vandaar zijn. </li><li> De volgende dag ontdooien DR4 MEFs in MEF medium dat bestaat uit DMEM (hoog glucose) aangevuld met 10% FBS en 1x MEM-NEAA. </li><li> Plaat DR4 MEFs in twee 10-cm schalen bij ~ 2 x 10 4 cellen / cm2 en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Op de dag van transfectie veranderen MEF medium E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 30 min alvorens transfectie op iPSCs. </li><li> Optioneel: Als flowcytometrische analyse van iPSCs na transfectie wordt gewenst, verwijderen van een basaal membraan-matrix gecoate plaat van 4 ° C en plaats bij kamertemperatuur. </li><li> Optioneel: 4 uur voorafgaand aan transfectie, vullen vóór transfectie iPSC kweek met Y-27632 bij de eindconcentratie van 10 uM. </li></ol> 6. Gentle-cel dissociatie reagens Treatment eennd Transfectie van iPSCs met een Electroporation System <ol><li> Verwijder P3 primaire cel transfectie oplossing bij 4 ° C en laat op kamertemperatuur komen gedurende ~ 30 min. Voeg de gehele 100 ul aanvulling op de transfectie oplossing vóór gebruik. </li><li> Warme zachte-cel dissociatie reagens in een 37 ° C waterbad. </li><li> Verkrijgen AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) en AAVS1-CAG-EGFP donor van -20 ° C. </li><li> Verwijder iPSCs uit de incubator en een keer wassen met DPBS. </li><li> Voeg 1 ml zachte cel dissociatie reagens per putje en incubeer iPSCs bij 37 ° C gedurende 5 minuten, of totdat meer dan 50% van de cellen losgemaakt van het kweekvat. </li><li> Pipetteer de cellen en neer een paar keer met een P1000 pipet om alle resterende cellen van het kweekvat dissociëren en te breken iPSC klonten. </li><li> Voeg 2 ml van E8 medium aan elk putje en pipet op en neer meerdere malen met een pipet 10 ml naar Fürtheh disaggregeren celklonten in enkele cellen OPMERKING: De transfectie efficiëntie daalt aanzienlijk als celklonten zijn niet voldoende uitgesplitst. </li><li> Verzamel iPSCs in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 3 min. </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer cellen in een minimale hoeveelheid E8 medium. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer na toepassing van een vitale kleurstof zoals 0,4% trypan blauw. Zorg ervoor dat de cellen voldoende kunnen worden gescheiden, terwijl het tellen (1-3 cellen per &quot;klomp&quot;). </li><li> Afzien van 3 x 10 6 cellen in elk van de twee 15 ml conische buizen en spin down opnieuw bij 100 xg gedurende 3 min. OPMERKING: Lage snelheid centrifugeren vermindert de cel stress en maakt een eenvoudige re-opschorting van iPSCs vóór elektroporatie. </li><li> Stel de elektroporatie systeem om het celtype specifieke programma voor de menselijke embryonale stamcellen lijn H9 (Program CB-150). </li><li> Na centrifugeren zuig het supernatant van de CELl pellets. Om één pellet, voeg 10 ug van het HR-donor als controle monster. Aan de andere pellet voeg 10 ug van het HR-donor, samen met 5 ug van elk TALEN (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) als experimenteel monster. </li><li> Resuspendeer elk celpellet in 100 ui P3 primaire cel transfectie oplossing en naar een cuvette. </li><li> Voer de transfectie en onmiddellijk 500 ul van kamertemperatuur E8 medium toe te voegen aan elke cuvette. </li><li> Breng de getransfecteerde iPSCs druppelsgewijs aan een 10-cm schotel met DR4 MEF bereid in stap 5.4. </li><li> Optioneel: Voeg enige druppels van elk experiment in een putje van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat of flowcytometrie anaylsis transfectie efficiëntie gewenst. </li><li> Herhaal de stappen 6,15-6,17 voor beide monsters afmaken. De volgende dag, wassen cellen met DPBS tweemaal en schakelen kweekmedium NutriStem, die lijkt te iPSC cultuur steunen op feeders beter dan E8. </li><li> Transient EGFP expressie pieken bij 48 tot 72 uur na transfectie; beoordelen transfectie-efficiëntie zoals gewenst. </li></ol> 7. Puromycine keuze van gerichte iPSCs <ol><li> Begin puromycineselectie 72 uur na transfectie wanneer de iPSCs oplopen tot 70% samenvloeiing. </li><li> Voor NCRM5 iPSCs, beginnen puromycineselectie bij 0,5 ug / ml puromycine (1/2 van de volledige dosis) verdund in NutriStem kweekmedium. De optimale puromycine concentratie kan variëren 0,25-1 ug / MLL enige iPSC lijnen. </li><li> Cultuur iPSCs in NutriStem + 0,5 ug / ml puromycine voor 3 dagen, het verversen van het medium dagelijks. </li><li> Na 3 dagen, verhoging van de concentratie van puromycine tot 1 ug / ml. </li><li> Culture iPSCs onder 1 ug / ml puromycine selectie voor een 7 tot 8 dagen of tot afzonderlijke kolonies verschijnen groot genoeg voor colony picking. </li></ol> 8. Colony Picking en uitbreiden van Gerichte iPSCs <ol><li> Gebruik basaal membraanmatrix bekleden een 96-well plaat door het afgeven 50 ui basaalmembraan matrix bekledingsoplossing (2 mg basaalmembraan matrix verdund in 12 ml DMEM / F12) in elk putje. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht voor het gebruik. </li><li> Nadat men de basaalmembraan matrix beklede plaat kamertemperatuur komen, zuigen de basaalmembraan matrix en breng 100 ui E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 in elk putje. </li><li> Een omgekeerde microscoop in een biologisch veiligheidskabinet, en spray licht met 70% EtOH te steriliseren. </li><li> Trek een glazen Pasteur pipet over een bunsenbrander om een ​​ideale kolonie-picking tool die een kleine &quot;haak&quot; aan het uiteinde heeft te verkrijgen. Steriliseer met 70% EtOH, en plaats in de kap te drogen. </li><li> Verwijder het schaaltje met gerichte iPSC kolonies uit de incubator en plaats in de kap onder de microscoop. </li><li> Pick iPSCs door het traceren van een cirkel rond de kolonie grens met de kolonie picking tool.</li><li> Gebruik de &quot;haak&quot; van de kolonie-picking middel om voorzichtig schrapen en verwijder de iPSC kolonie van het oppervlak van de plaat. Voor grotere kolonies, tekenen een X met de kolonie-picking tool om kwart de kolonie zal celgroei na re-plating te vergemakkelijken. </li><li> Zodra celklonten zijn vrijstaand en vrij zwevende, gebruik dan een P200 pipet ingesteld op ~ 30 pi aan de iPSCs verzamelen. Plaat cellen direct in de 96-well plaat. </li><li> Optioneel: gebruik een p20 pipet op ~ 5 ul de iPSCs verzamelen in een eppendorfbuisje, voeg 50 ul zacht-cel dissociatie reagens verteerbaar gedurende 5 min bij 37 ° C. Na de spijsvertering, voeg 500 ul E8 medium in de eppendorfbuis naar de zachte-cel dissociatie reagens te verdunnen en spin down de cellen op 200 xg in een standaard tafelblad microcentrifuge gedurende 5 minuten. Zuig vervolgens meeste van het medium en laat ~ 30 pi te resuspenderen en breng de cellen in 96-well plaat. LET OP: Dezeaanpak zal de dissociatie van de cel klomp en snelle uitbreiding van geplukt kolonie te vergemakkelijken. </li><li> Ga kolonie picking totdat een voldoende aantal iPSC kolonies werden verzameld (ongeveer 20-30 kolonies per experiment wordt aanbevolen). </li><li> Na kolonie plukken, plaats de 96-wells plaat in een incubator &#39;s nachts. Vernieuwen met complete E8 medium de volgende dag, en de cultuur tot ~ 70% confluent. </li><li> Passage cellen van de 96-well in een 24-well, dan in een 6-well, zoals beschreven in de stappen 4,5-4,10. OPMERKING: de hoeveelheden EDTA-oplossing en E8 medium verhoudingsgewijs worden verlaagd bij gebruik putjes kleiner dan een 6-wells plaat. </li><li> Beoordelen targeting succes door het knooppunt PCR en Southern blot analyse om gerichte cassette integratie en de afwezigheid van willekeurig geplaatste vectoren 16 bevestigen. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+insulator+in+AAVS1%2C+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+by+AAVS1+Transcription+Activator-Like+Effector+Nucleases.+Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells%3A+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li>
<li>Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stembook.org/node/1438">http://www.stembook.org/node/1438</a> (2008-2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De meest kritische stappen voor de succesvolle generatie AAVS1 safe-haven gerichte menselijke iPSCs zijn: (1) efficiënt leveren van TALEN en donorplasmiden in iPSCs door transfectie; (2) het optimaliseren van dissociatie van iPSCs in enkele cellen voor transfectie en uitplaatdichtheid na transfectie; (3) optimalisatie van de dosis en de geneesmiddel-selectie op basis van de groei van iPSC lijn; (4) voorzichtig ontleden en het plukken van gerichte koloniën en de overdracht aan de nieuwe plaat / goed. In vergelijking met ...

Het vermogen om menselijke somatische cellen herprogrammeren in embryonale stamcel-achtige geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werd ontdekt door Takahashi et al. In 2007 1. Menselijke huidfibroblasten getransduceerd met retrovirussen expressie vier transcriptiefactoren (de zoge- noemde Yamanaka factoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc en Klf4) bleken vrijwel gelijkwaardig aan menselijke embryonale stamcellen (hESCs) op basis van morfologie, proliferatie, genexpressie en epigenetische status te hebben; cruciaal, iPSCs ook kunnen differentiëren in cellen van alle drie kiembladen 1. De proliferatieve potentie en differentiatie aantal iPSCs maakt hen zeer aantrekkelijk gereedschap; door herprogrammering cellen van patiënten die lijden aan specifieke ziekten, kan iPSCs worden gebruikt als in vitro ziekte modelsystemen en als potentiële therapeutica. Voor het laatste doel, moet een aantal zaken voordat het volledige potentieel van iPSCs worden aangepaktin een klinische omgeving kan worden gerealiseerd; het tumorigene potentieel van in vitro gekweekte hESCs en iPSCs, het gebruik van xenogene derivaten tijdens herprogrammering en celonderhoud en de noodzaak getransplanteerde cellen te volgen in vivo zijn cruciaal obstakels voor de klinische toepassing van pluripotente stamcellen (Beoordeeld door Hentze et bij. 2). Een ideale oplossing om de noodzaak voor het bijhouden van gedifferentieerde cellen na transplantatie zou een visueel detecteerbare merker die weerstaat zwijgen en schakering ongeacht de toepassing betrekken. Robuuste en duurzame expressie van geïntegreerde transgenen is eerst haalbaar wanneer exogeen DNA wordt ingebracht in safe-harbour loci; dat wil zeggen, genomisch sites die voldoende transcriptie van een geïntegreerde vector mogelijk terwijl tegelijkertijd verzachtende verstoringen van expressie in naburige genen 3. Een zo&#39;n site die is goed gekarakteriseerd sinds zijn ontdekking is het adeno-geassocieerde virus integratie site 1 (AAVS1), in het eerste intron van het proteïne fosfatase 1 regulerende subeenheid 12C (PPP1R12C) gen. Dit gen is aangetoond niet alleen toestaan ​​duurzame en robuuste expressie van transgenen geïntegreerd via uitgebreide tijd in kweek en in vitro differentiatie 3, maar tevens tot omliggende genen van transcriptionele verstoring 4; beide functies zijn waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van endogene chromatine isolatorelementen flankeren de AAVS1 plaats 5. Vooruitgang in genoom engineering tools in slechts de afgelopen tien jaar aanzienlijk vergemakkelijkt het gemak en de efficiëntie waarmee genetische manipulaties in elk celtype worden bereikt. Terwijl vroege succesvolle experimenten gebruikt buitengewoon lage endogene homologe recombinatie (HR) met een geïntroduceerd donor gen bereiken targeting in SER 6,7, het gebruik van plaats-specifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), dat significantly induceren van homologe recombinatie door het genereren van een dubbelstrengs DNA-break is sterk toegenomen de efficiëntie van dergelijke experimenten 8,9. De herbestemming van zowel transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen) van plantaardige pathogene Xanthomonas geslachten en de prokaryote geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 systeem in efficiënte site-specific ontwerper nucleases heeft gentargeting gemaakt in pluripotente stamcellen een toegankelijke en uitvoerbaar methodologie 10-13. Een recent artikel beschreef een efficiënte methode voor de stabiele integratie van een groen fluorescerend reporter cassette in de AAVS1 safe-haven locus in menselijke iPSCs behulp VERHAAL nucleases (Talens) 14. Deze gerichte iPSCs behielden hun fluorescentie zelfs nadat gericht differentiatie naar hartspiercellen en transplantatie in een muismodel van myocardinfarct (MI), het verstrekken van sterk bewijs voor het nut van dergelijkestabiel fluorescerende pluripotente stamcellen 14. Gerichte kolonies te krijgen, werd een gen-trap methode waarbij een splicing-acceptor (SA), 2A zelf-splitsende peptide sequentie plaatst het puromycine N-acetyl-transferase (PAC) gen onder controle van de endogene PPP1R12C promoter; dus, alleen iPSCs dat het DNA schenker ten AAVS1 locus hebben opgenomen uiten PAC, waardoor ze selecteerbaar gebaseerd op puromycine- weerstand; (Figuur 1, 15). Dit protocol beschrijft de procedures voor het genereren van AAVS1-GFP iPSCs gemeld in het recente document 14, met inbegrip van het proces van het transfecteren iPSCs met Talens en een 9,8 kb donor naar een 4.2kb DNA-fragment in de AAVS1 safe-harbour locus integreren, selecteren iPSCs gebaseerd op puromycine-resistentie en plukken kolonies klonale expansie. De hierin beschreven technieken kunnen worden toegepast op vele genoom technische experimenten.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Bewaar basal medium bij 4 &deg;C. Bewaar supplement bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Bewaar op kamertemperatuur. Eenmaal opgelost in H2O, bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Bewaar in vloeibare stikstof.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C. Ontdooi bij 4 &deg;C een nacht en verdeel in porties. Bewaar porties bij -20 &deg;C tot ze nodig zijn.</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>onderdeel van het elektroporeringssysteem</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>onderdeel van het elektroporeringssysteem</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Bij aankomst verwijder de Primary Cell Solution en supplement en bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C. Ontdooi een nacht bij 4&deg;C en verwarm een portie in een 37 &deg;C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C. Ontdooi een nacht bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 en pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 en 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C. Bereid werkporties van 1 mg/ml in ddH2O.</td></tr><tr><td>Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (gekoeld), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &times; 750 ml Swinging Bucket Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfectie, selection, en kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen talen-gericht, met een gfp-gen in de aavs1 safe harbor

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Gerichte transgeenadditie kan aanhoudende genexpressie bieden terwijl het gen-silencing en insertionele mutagenese omzeilt dat wordt veroorzaakt door willekeurige integratie via een viraal vector. Dit protocol beschrijft een universeel en efficiënt platform voor gerichte transgeenadditie in humane iPSC's, gebaseerd op het gebruik van gevalideerde open-source TALENs en een gene-trap-achtige donor om transgenen naar een veilige havenlocus te leveren. Belangrijk is dat effectieve genredigering beperkt wordt door de leveringsefficiëntie van genredigeringsvectoren. Daarom richt dit protocol zich eerst op de voorbereiding van iPSC's voor transfectie om een hoge nucleaire leveringsefficiëntie te bereiken. Wanneer iPSC's worden gedissocieerd in enkele cellen met behulp van een milde celdissociatiereagens en getransfecteerd met behulp van een geoptimaliseerd programma, kan >50% van de cellen worden geïnduceerd om de grote genredigeringsvectoren op te nemen. Omdat de AAVS1-locus zich in het intron van een actief gen bevindt (PPP1R12C), werd een splicing acceptor (SA)-gekoppeld puromycine-resistent gen (PAC) gebruikt om gerichte iPSC's te selecteren, terwijl alleen willekeurige integratie en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten. Deze strategie verhoogt de kans op het verkrijgen van gerichte klonen aanzienlijk en kan ook worden gebruikt in andere actieve gentargeteerexperimenten. Twee weken na puromycineselectie op de dosis die is aangepast voor de specifieke iPSC-lijn, zijn klonen klaar om te worden gepikt door handmatige dissectie van grote, geïsoleerde kolonies in kleinere stukken die worden overgebracht naar vers medium in een kleinere put voor verdere expansie en genetische en functionele screening. Dit protocol kan worden gevolgd om gemakkelijk meerdere GFP-reporter iPSC-lijnen te verkrijgen die nuttig zijn voor in vivo en in vitro beeldvorming en celisolatie.

Een visualisatie van het protocol is gegeven in Figuur 2, met perioden waarin iPSCs worden gekweekt in verschillende middelgrote gemarkeerd door een groen voor E8 of blauw voor NutriStem. Het is belangrijk om alleen hoogwaardige iPSCs transfecteren; onderzoeken cultuur gerechten gedurende routine-onderhoud en controleer of iPSC culturen bevatten voornamelijk verschillende kolonies, voorzien van een geplaveide-achtige morfologie (figuur 3A); gedifferentieerde cellen niet bezetten meer da...

TALEN-gemedieerde genre-editing op het veilige haven-locus AAVS1 maakt hoog-efficiënte toevoeging van transgenen mogelijk in menselijke iPSC's. Dit protocol beschrijft de procedures voor het voorbereiden van iPSC's voor TALEN en donorvector-levering, het transfecteren van iPSC's en het selecteren en isoleren van iPSC-klonen om gerichte integratie van een GFP-gen te bereiken voor het genereren van reporter-lijnen.

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van isolaten van AAVS1 safe harbor-gerichte, induceerbare pluripotente stamcel- of iPSC-klonen die GFP tot expressie brengen. Dit wordt bereikt door eerst AAVS1-talens en AAVS1-C-A-G-E-G-F-P-donorplasmiden efficiënt in iPSC's over te brengen via nucleofectie. In de tweede stap worden de AAVS1-gerichte cellen geselecteerd met puromycine op embryonale feeder-cellen van muizen.Vervolgens worden de individuele GFP-expresserende AAVS1-getargete klonen overgebracht naar een met matrigel gecoate 96-wells plaat. In de laatste stap worden de AAVS1-GFP-iPSC-klonen uitgebreid met E8-medium en standaard iPSC-kweektechnieken. Ten slotte worden immunofluorescentiemicroscopie en flowcytometrie gebruikt om de uniforme en robuuste expressie van GFP in AAVS1-getargete humane iPSC-klonen aan te tonen.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het plukken van kolonies microdissectie van doelkloons vereisen met speciale colony-picking-instrumenten onder een microscoop, wat moeilijk aan te leren is tijdens instructie naast elkaar. Begin met het éénmaal wassen van de IPSC-culturen met PBS. Voeg vervolgens één milliliter zachte cel-dissociatie-reagens van 37 °C toe aan elke well en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende ongeveer vijf minuten, totdat meer dan 50% van de cellen is gedissocieerd van het cultuurvat.Gebruik een P 1000 pipet om eventuele resterende celklonters of gehechte cellen mechanisch te verbreken. Voeg vervolgens twee milliliters E eight medium toe aan elke put en gebruik een 10 milliliter pipet om de culturen verder te disaggregeren tot enkelcel-suspensies. Voeg nu de geoogste cellen samen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer deze.Resuspendeer de pellet in een minimale hoeveelheid E8-medium voor het tellen. Nadat de levensvatbaarheid van de culturen is bevestigd via trypan blue-uitsluiting en is vastgesteld dat de dissociatie voldoende is, worden 3 miljoen cellen overgebracht naar elk van de twee conische buizen van 15 milliliter. Terwijl de cellen centrifugeren, wordt het electroporatiesysteem ingesteld op het celtype-specifieke programma voor de humane embryonale stamcellijn H9. Voeg vervolgens 10 microgram van de homologe recombinatiedonor alleen toe aan één pellet voor de controlemonster, en 10 microgram van het homologe recombinatiedonorplasmide, samen met vijf microgram van elk taline-plasmide, voor het experimentele monster.Voeg vervolgens 100 µL kamertemperatuur complete P three primaire celtransfectie-oplossing toe aan elk van de controle- en experimentele pellets en resuspendeer de cellen. Breng de monsters over naar individuele cuvetten en elektroporeer de monsters onmiddellijk na de transfectie. Voeg 500 µL kamertemperatuur E eight medium toe aan elke cuvet en breng de getransfecteerde IPSC-monsters vervolgens druppelsgewijs over naar individuele 10 cm schalen die DR four muis embryonale fibroblasten bevatten. Voordat de kolonies worden opgepikt, wordt elke put van een 96-wells plaat gecoat met 50 µL basement membrane matrix-oplossing, waarna de plaat de volgende ochtend overnacht bij 4 °C wordt bewaard.Wanneer de plaat kamertemperatuur heeft bereikt, wordt het overtollige medium afgezogen en elke put gevuld met 100 µL E eight medium aangevuld met 10 µM Y 2 7 6 3 2. Plaats vervolgens een geïnverteerde microscoop in een biologische veiligheidskabinet en steriliseer deze met een lichte spray van 70% ethanol. Plaats daarna een glazen pasteurpipet boven een bunsenbrander om, na sterilisatie met 70% ethanol, een instrument voor het plukken van kolonies te maken met een klein haakje aan de punt.Plaats de haak in de zuurkast om te drogen en plaats vervolgens de IPSE-cultuur op de microscopietafel om de klonen te selecteren. Lokaliseer een geschikte kolonie bij een lage vergroting en gebruik het instrument voor kolonie-picking om deze te markeren en in kwartieren te verdelen. Schraap vervolgens voorzichtig het kwartier van de kolonie uit het cultuurvat en gebruik een P 200 pipette, ingesteld op ongeveer 30 µL, om de vrij zwevende IPC's op te vangen, waarbij de cellen direct op de basement membrane matrix worden geplaatst.Zodra ze worden geoogst, moeten de iPSCs binnen twee tot vier uur na het uitplaten hechten. Incubeer de geselecteerde kolonies tot slot een nacht bij 37 °C en ververs de cellen de volgende ochtend met compleet E8-medium. Het is belangrijk om gedurende het hele experiment alleen hoogwaardige iPSCs te transfecteren.De IPSC-culturen moeten voornamelijk bestaan uit afzonderlijke kolonies met een kasseimorfologie zoals de cellen hier te zien zijn, en de gedifferentieerde cellen mogen niet meer dan 10% van de cultuur uitmaken; het transfectievermogen van de IPC's kan worden beoordeeld en geoptimaliseerd met behulp van de kleine PAX GFP-vector, aangezien transfectie met PAX GFP vanwege de geringe omvang doorgaans de maximaal haalbare efficiëntie vertegenwoordigt. De transiënte expressie van een A VS one C-A-G-E-G-F-P intel in getransfecteerde IPC's bereikt een piek 48 tot 72 uur na transfectie, wat met een klein deel van de getransfecteerde cellen via flowcytometrie kan worden bevestigd. De transfectie-efficiëntie kan sterk variëren.Zelfs in experimenten met A is een GFP-positieve fractie slechts 10%. Individuele klonen die een uniforme fluorescentie vertonen, zouden groot genoeg moeten zijn voor colony picking na selectie met puremycine. Bovendien zouden de uitgebreide targeted iPSC-klonen, eenmaal in het 96-wells formaat, een stabiele en uniforme expressie van GFP moeten vertonen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe iPSC's efficiënt kunnen worden getransfecteerd via nucleofectie en hoe een AAV safe harbor kan worden geïsoleerd.Gerichte IPSE-klonen met behulp van colony picking-instrumenten.

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

This video describes a precise genome editing technique in human induced pluripotent stem cells, or hiPSCs, using TALENs to create double-stranded breaks at a targeted locus, inducing homology-directed repair for fluorescence protein gene integration.

TALEN-Mediated Targeted Gene Integration: Using Engineered Sequence-Specific Nucleases for the Precise Insertion of Fluorescent Protein Gene into hiPSCs

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Hier melden wij een snelle en efficiënte gen-editing methode op basis van RMCE in de AAVS1 locus van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), die verbetert eerder beschreven systemen. Met deze techniek kan isogene lijnen snel en betrouwbaar worden gegenereerd voor goede vergelijkende studies vergemakkelijkt-gemedieerde transgenese onderzoek met hPSCs.

Snelle en efficiënte generatie van recombinant humaan pluripotente stamcellen door Recombinase-gemedieerde Cassette Exchange in de<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Leer TALEN-gemedieerde genbewerking in humane iPSCs via nucleofectie en puromycine-selectie. Deze methode genereert stabiele GFP-expresserende klonen in de AAVS1 safe harbor voor onderzoek naar stamcelbiologie.

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor (Video) | JoVE Journal

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Meer video's verkennen