Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Het algemene doel van deze procedure is om een geïsoleerd AA versus een veilige haven, gericht inducteerbare pluripotente stamcel of IPSC-klonen die GFP tot expressie brengen, te genereren. Dit wordt bereikt door eerst een AAVs één talons en een A VS één C-A-G-E-G-F-P donorplasmide efficiënt in IPC's te brengen door middel van nucleo-affectie. In de tweede stap worden de A a versus één gerichte cellen geselecteerd door middel van pur mycine op muis embryonale feedercellen.

Vervolgens worden de individuele GFP-tot expressie brengende A A VS één gerichte klonen in een matrigel-gecoate 96-wellplaat opgepikt. In de laatste stap worden de A A VS één G-F-P-I-P-S-C-klonen uitgebreid met E acht medium en standaard IPSC-kweektechnieken. Uiteindelijk worden immunofluorescentiemicroscopie en flowcytometrie gebruikt om de uniforme en robuuste expressie van GFP in AA VS één gerichte menselijke IPSC-klonen te tonen.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stap van het oppikken van kolonies microdissectie van gerichte klonen omvat met behulp van speciale kolonie-oppikgereedschappen onder een microscoop, wat moeilijk te leren is tijdens zij-aan-zij-instructie. Begin met het wassen van de IPSC-culturen één keer per keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter van 37 graden Celsius zachte celdissociatiereagens toe aan elke put en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten wanneer meer dan 50% van de cellen zich heeft losgemaakt van het kweekvat.

Gebruik een P 1000 pipet om mechanisch eventuele resterende celklonters of aangehechte cellen te verstoren. Voeg vervolgens twee milliliter E acht medium toe aan elke put en gebruik een 10 milliliter pipet om de culturen verder te dissociëren tot enkele celsuspensies. Bundel nu de geoogste cellen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer ze neer.

Re-suspendeer het pellet in een minimale hoeveelheid E acht medium voor het tellen. Na bevestiging van de levensvatbaarheid van de culturen door trian blauwe exclusie, evenals hun voldoende dissociatie, worden 3 miljoen cellen overgebracht naar elk van twee 15 milliliter conische buizen terwijl de cellen worden gecentrifugeerd. Zet het elektroporatiesysteem in op het celtypespecifieke programma voor de menselijke embryonale stamcel H negen. Voeg vervolgens 10 microgram van de homologe recombinatiedonor alleen toe aan één pellet voor het controlemonster en 10 microgram van de homologe recombinatiedonorplasmide, samen met vijf microgram van elk talonplasmide voor het experimentele monster.

Voeg vervolgens 100 microliter kamertemperatuur volledige P drie primaire celtransfectieoplossing toe aan elk van de controle- en experimentele pellets en resuspendeer de cellen. Breng de monsters over in individuele cuvetten en eet de monsters onmiddellijk na de transfectie. Voeg 500 microliter kamertemperatuur E acht medium toe aan elke Q vet en breng vervolgens de getransfecteerde IPSC-monsters druppelsgewijs over in individuele 10 centimeter schotels die DR vier muis embryonale fibroblasten bevatten. Voor het oppikken van de kolonies, co-leer elk putje van een 96-wellplaat met 50 microliter basement membrane matrixoplossing en bewaar de plaat een nacht bij vier graden Celsius de volgende ochtend.

Wanneer de plaat kamertemperatuur heeft bereikt, aspireer de overtollige oplossing en laad elke put met 100 microliter E acht medium gesupplementeerd met 10 micromolair Y 2 7 6 3 2. Plaats vervolgens een omgekeerd microscoop in een biologische veiligheidskast en steriliseer deze met een lichte spray van 70%ethanol. Plaats vervolgens een glazen pastorpipet boven een Bunsen-brander om een kolonie-oppikgereedschap te maken met een kleine haak aan het uiteinde na sterilisatie met 70%ethanol.

Plaats de haak in de kap om te drogen en plaats de IPSE-kweek op de microscoopstandaard om de klonen te kiezen. Lokaliseer een geschikte kolonie onder een lage vergroting en gebruik het kolonie-oppikgereedschap om deze op te sporen en te kwartieren. Schap vervolgens voorzichtig de gekwarteerde kolonie van het kweekvat en gebruik een P 200 pipet ingesteld op ongeveer 30 microliter om de vrij zwevende IPC's te verzamelen en de cellen direct op de basement membrane matrix te plateren.

Zodra ze worden geoogst, moeten de IPC's binnen twee tot vier uur na het plateren hechten. Incubeer de opgepikte kolonies tenslotte een nacht bij 37 graden Celsius en ververs de cellen de volgende ochtend met volledig E acht medium. Het is belangrijk om alleen hoge kwaliteit I PSCs te transfecteren gedurende het hele experiment.

De IPSC-culturen moeten voornamelijk distincte kolonies bevatten met een mozaïekachtige morfologie zoals de cellen hier te zien zijn en de gedifferentieerde cellen mogen niet meer dan 10%van de cultuur zijn. De transfecteerbaarheid van de IPC's kan worden beoordeeld en geoptimaliseerd met behulp van het kleine PAX GFP-vector, aangezien transfectie met PAX GFP typisch de maximaal haalbare efficiëntie vertegenwoordigt vanwege zijn kleine omvang. De transitoire expressie van een A VS één C-A-G-E-G-F-P intel en getransfecteerde IPC's bereikt een piek bij 48 tot 72 uur na transfectie, wat kan worden bevestigd met een kleine portie van getransfecteerde cellen door middel van flowcytometrie. De transfectie-efficiëntie kan sterk variëren.

Zelfs in experimenten met een GFP-positieve fractie is slechts 10% Individuele klonen die een uniforme fluorescentie vertonen, moeten groot genoeg zijn voor kolonie-opname na pure mycine-selectie. Verder, eenmaal in het 96-well formaat, moeten de uitgebreide gerichte IPSC-klonen een stabiele en uniforme expressie van GFP vertonen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u I PSCs efficiënt kunt transfecteren door middel van nucleaire affectie en hoe u AV één veilige haven kunt isoleren.

Gerichte IPSE-klonen met behulp van kolonie-oppikgereedschappen.