Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van isolaten van AAVS1 safe harbor-gerichte, induceerbare pluripotente stamcel- of iPSC-klonen die GFP tot expressie brengen. Dit wordt bereikt door eerst AAVS1-talens en AAVS1-C-A-G-E-G-F-P-donorplasmiden efficiënt in iPSC's over te brengen via nucleofectie. In de tweede stap worden de AAVS1-gerichte cellen geselecteerd met puromycine op embryonale feeder-cellen van muizen.

Vervolgens worden de individuele GFP-expresserende AAVS1-getargete klonen overgebracht naar een met matrigel gecoate 96-wells plaat. In de laatste stap worden de AAVS1-GFP-iPSC-klonen uitgebreid met E8-medium en standaard iPSC-kweektechnieken. Ten slotte worden immunofluorescentiemicroscopie en flowcytometrie gebruikt om de uniforme en robuuste expressie van GFP in AAVS1-getargete humane iPSC-klonen aan te tonen.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het plukken van kolonies microdissectie van doelkloons vereisen met speciale colony-picking-instrumenten onder een microscoop, wat moeilijk aan te leren is tijdens instructie naast elkaar. Begin met het éénmaal wassen van de IPSC-culturen met PBS. Voeg vervolgens één milliliter zachte cel-dissociatie-reagens van 37 °C toe aan elke well en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende ongeveer vijf minuten, totdat meer dan 50% van de cellen is gedissocieerd van het cultuurvat.

Gebruik een P 1000 pipet om eventuele resterende celklonters of gehechte cellen mechanisch te verbreken. Voeg vervolgens twee milliliters E eight medium toe aan elke put en gebruik een 10 milliliter pipet om de culturen verder te disaggregeren tot enkelcel-suspensies. Voeg nu de geoogste cellen samen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer deze.

Resuspendeer de pellet in een minimale hoeveelheid E8-medium voor het tellen. Nadat de levensvatbaarheid van de culturen is bevestigd via trypan blue-uitsluiting en is vastgesteld dat de dissociatie voldoende is, worden 3 miljoen cellen overgebracht naar elk van de twee conische buizen van 15 milliliter. Terwijl de cellen centrifugeren, wordt het electroporatiesysteem ingesteld op het celtype-specifieke programma voor de humane embryonale stamcellijn H9. Voeg vervolgens 10 microgram van de homologe recombinatiedonor alleen toe aan één pellet voor de controlemonster, en 10 microgram van het homologe recombinatiedonorplasmide, samen met vijf microgram van elk taline-plasmide, voor het experimentele monster.

Voeg vervolgens 100 µL kamertemperatuur complete P three primaire celtransfectie-oplossing toe aan elk van de controle- en experimentele pellets en resuspendeer de cellen. Breng de monsters over naar individuele cuvetten en elektroporeer de monsters onmiddellijk na de transfectie. Voeg 500 µL kamertemperatuur E eight medium toe aan elke cuvet en breng de getransfecteerde IPSC-monsters vervolgens druppelsgewijs over naar individuele 10 cm schalen die DR four muis embryonale fibroblasten bevatten. Voordat de kolonies worden opgepikt, wordt elke put van een 96-wells plaat gecoat met 50 µL basement membrane matrix-oplossing, waarna de plaat de volgende ochtend overnacht bij 4 °C wordt bewaard.

Wanneer de plaat kamertemperatuur heeft bereikt, wordt het overtollige medium afgezogen en elke put gevuld met 100 µL E eight medium aangevuld met 10 µM Y 2 7 6 3 2. Plaats vervolgens een geïnverteerde microscoop in een biologische veiligheidskabinet en steriliseer deze met een lichte spray van 70% ethanol. Plaats daarna een glazen pasteurpipet boven een bunsenbrander om, na sterilisatie met 70% ethanol, een instrument voor het plukken van kolonies te maken met een klein haakje aan de punt.

Plaats de haak in de zuurkast om te drogen en plaats vervolgens de IPSE-cultuur op de microscopietafel om de klonen te selecteren. Lokaliseer een geschikte kolonie bij een lage vergroting en gebruik het instrument voor kolonie-picking om deze te markeren en in kwartieren te verdelen. Schraap vervolgens voorzichtig het kwartier van de kolonie uit het cultuurvat en gebruik een P 200 pipette, ingesteld op ongeveer 30 µL, om de vrij zwevende IPC's op te vangen, waarbij de cellen direct op de basement membrane matrix worden geplaatst.

Zodra ze worden geoogst, moeten de iPSCs binnen twee tot vier uur na het uitplaten hechten. Incubeer de geselecteerde kolonies tot slot een nacht bij 37 °C en ververs de cellen de volgende ochtend met compleet E8-medium. Het is belangrijk om gedurende het hele experiment alleen hoogwaardige iPSCs te transfecteren.

De IPSC-culturen moeten voornamelijk bestaan uit afzonderlijke kolonies met een kasseimorfologie zoals de cellen hier te zien zijn, en de gedifferentieerde cellen mogen niet meer dan 10% van de cultuur uitmaken; het transfectievermogen van de IPC's kan worden beoordeeld en geoptimaliseerd met behulp van de kleine PAX GFP-vector, aangezien transfectie met PAX GFP vanwege de geringe omvang doorgaans de maximaal haalbare efficiëntie vertegenwoordigt. De transiënte expressie van een A VS one C-A-G-E-G-F-P intel in getransfecteerde IPC's bereikt een piek 48 tot 72 uur na transfectie, wat met een klein deel van de getransfecteerde cellen via flowcytometrie kan worden bevestigd. De transfectie-efficiëntie kan sterk variëren.

Zelfs in experimenten met A is een GFP-positieve fractie slechts 10%. Individuele klonen die een uniforme fluorescentie vertonen, zouden groot genoeg moeten zijn voor colony picking na selectie met puremycine. Bovendien zouden de uitgebreide targeted iPSC-klonen, eenmaal in het 96-wells formaat, een stabiele en uniforme expressie van GFP moeten vertonen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe iPSC's efficiënt kunnen worden getransfecteerd via nucleofectie en hoe een AAV safe harbor kan worden geïsoleerd.

Gerichte IPSE-klonen met behulp van colony picking-instrumenten.