Name: Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Leer hoe mastcel secretiegranula en exocytose worden bestudeerd met fluorescentie-reportergenen en confocale beeldvorming. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van granulamorfologie en genfunctie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr U. Ashery voor de gave van NPY-mRFP cDNA. Wij danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, en Y. Zilberstein voor onschatbare hulp bij microscopie en het beeld analyseert. We danken ook Dr. Joseph Orly voor kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Israel Science Foundation, opgericht door de Israëlische Academie voor Wetenschappen (1139-1112 naar RS-E.).

1. Voorbereiding van de RBL Cell Culture Media <ol><li> Meng 500 ml van laag glucose Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met 56 ml foetaal runderserum (dit maakt 10% FBS) en voeg 5,5 ml penicilline streptomycine (dit maakt ~ 1% PEST). </li><li> Filter de media met behulp van 500-1.000 ml Fles-Top Vacuum filters Met 0,22 pm poriegrootte en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> 2. Cultuur van RBL Cellen <ol><li> Groeien RBL cellen in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C in ofwel platen of kolven. RBL-cellen die groeien in 10 cm platen worden aangevuld met 10 ml medium en vormen confluente monolaag van ~ 10 7 cellen / plaat. </li><li> Wanneer de cellaag nadert confluentie replate de kweek bij een lagere dichtheid. <ol><li> Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met behulp van een steriele Pasteur pipet verbonden vacuüm. </li><li> Spoel de cel monolaag met voorverwarmd (37° C) 0,25% trypsine / EDTA dat de gehele monolaag (het volume afhankelijk van de grootte van kweekplaat / fles bedekt, 2 ml 10 cm plaat). Dit zal de cellen los. </li><li> Als alternatief, spoel de cel monolaag met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), verwijder de PBS en voeg voorverwarmde (37 ° C) trypsine / EDTA. Deze stap los de cellen sneller. </li><li> Plaats de plaat / kolf in een incubator bij 37 ° C (niet meer dan 10 min). </li><li> Inspecteer de cellen onder de optische microscoop te kijken of ze hebben losgemaakt. Als de cellen niet los na 10 min, tik zachtjes op de plaat / kolf. </li><li> Medium In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de drager dient ten minste 2-voudig groter dan het volume van de trypsine-oplossing). </li><li> Pellet de cellen door centrifugatie gedurende 3 min bij 200 g bij 25 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in medium. Verdun de cellen door 01:10 en zaad in een nieuwe cultuur schotel. Incubeer de cellen gedurende 48-72 uur, totdat zij reach ongeveer 90% confluentie. </li><li> Herhaal dezelfde procedure (paragraaf 2.2.1-2.2.8) tot 3 maanden (30 passages). </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van transfectie media. <ol><li> Bereid een oplossing van 100 mM K-buizen pH 7, 1 mM oplossing van Ca2 + acetaat en 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat. </li><li> Verdun de oplossing van 100 mM K-Pipes pH 7 tot 20 mM met DMEM media, voeg 1 mM oplossing van Ca 2+ acetaat tot een eindconcentratie van 10 uM en 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat tot een eindconcentratie van 2 mM. </li><li> Weeg Kalium glutamaat en aan de oplossing tot een eindconcentratie van 128 mM, meng en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Houd de resterende oplossingen (bijv. K-buizen, Ca2 + acetaat, Mg2 + acetaat) bij -20 ° C. </li></ol> 4. Transfectie van cellen RBL <ol><li> Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met eensteriel pasteurpipet verbonden vacuüm. </li><li> Spoel de cel monolaag met voorverwarmde (37 ° C) trypsine / EDTA dat de gehele monolaag bestrijkt. Plaats de plaat / kolf in een incubator bij 37 ° C (niet meer dan 10 min). Controleer of de cellen losgemaakt met de optische microscoop. </li><li> Medium In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de media moeten minstens 2 groter dan het volume van de trypsine-oplossing). </li><li> Tel het aantal cellen met behulp van hemocytometer. </li><li> Pellet 1,5 x 10 7 cellen door centrifugatie gedurende 3 min bij 200 xg bij 25 ° C. Verwijder het supernatants en voeg 280 pl transfectiemedium. Breng de reactie mengsel in 4 mm cuvet. </li><li> Voeg 20 ug NPY-mRFP plasmide en hetzij 30 ug controle lege plasmide of een geteste plasmide. Het eindvolume van het reactiemengsel moet 300 pi. </li><li> Direct te plaatsen op ijs gedurende 10 min. Veeg de cuvette van restwater en proceed elektroporatie bij 300 V 9 msec. </li><li> Voor metingen van exocytose, replate de cellen direct in 24 well weefselkweek gerechten die 300 ul medium. Voeg 8 ul van het reactiemengsel (4 x 10 5 cellen) aan elk putje. Voeg 4 x 10 5 niet getransfecteerde cellen extra putjes controle. Bereid voldoende putjes om ten minste in duplo putjes voor elke behandeling voor elke transfectie. </li><li> Voor time lapse microscopie, replate de cellen direct in een 8-well kamer borosilicaat coverglass systeem met 80 ul medium. Voeg 1,5 ul van het reactiemengsel (7,5 x 10 4 cellen) aan elke kamer. (Probeer te voorkomen dat het gebruik van de kamers aan de rand van het dekglaasje, de kamers in het centrum van het dekglaasje zijn gemakkelijker te afbeelding). OPMERKING: Belangrijk is, niet alle cellen reactie op een trekker en zo nu en dan de time-lapse microscopie wordt ingetrokken als gevolg van het verlies van focus en drift van het 8-well kamer borosikunst op dekglaasje systeem. Daarom bereiden tenminste 8 kamers voor elke behandeling voor elke transfectie. </li><li> Voor sensibiliseren de cellen voor FcsRI gemedieerde activering, voeg 1 ug / ml muizen monoklonale DNP IgE aan de media (Incubeer de cellen met IgE gedurende tenminste 2 uur). </li><li> Na 18-24 uur gebruik een fluorescentiemicroscoop te bevestigen dat de cellen brengen de plasmiden. De excitatie en emissie golflengtes van mRFP fluorescentie zijn: Aex 584, Aem 607 nm. NPY-mRFP moeten verschijnen in vesiculaire structuren die overeenkomen met de SGS. Als het tweede gen van interesse gefuseerd aan een fluorescerend tag een fluorescentiemicroscoop op de co-expressie van beide plasmiden te bevestigen aan dezelfde cellen. Bijvoorbeeld, wanneer de te testen gen gefuseerd aan GFP, de excitatie en emissie golflengtes van GFP fluorescentie zijn: A ex 488, Aem 507 nm. De GFP-gelabeld eiwit zou moeten verschijnen op dezelfde cellen die NPY-mRFP uiten. </li><li> Voor exocytose metingen overgaan to stap 5 en voor time-lapse microscopie, ga verder met stap 6. </li></ol> 5. Het meten van NPY-mRFP Exocytose <ol><li> Voorbereiding van Tyrode buffer: <ol><li> Bereid een oplossing van 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl en 8 mM NaH 2PO 4 in DDW. Meng goed en bewaren bij 4 ° C. Deze stap is voor de bereiding van 20x Tyrode buffer. </li><li> Bereid een oplossing van 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM glucose en 1 tot 20 verdunning van Tyrode 20x in DDW en meng. Deze stap is voor de voorbereiding van 1x Tyrode buffer. </li><li> Aliquot de 1x Tyrode buffer en bewaar bij -20 ° C. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien. </li></ol></li><li> Verwijder het kweekmedium van de 24 well plaat en was 3 maal met Tyrode buffer. Bereid gestimuleerde cellen door toevoeging van 200 pi Tyrode buffer controleputjes. </li><li> Bereid 10 pl / putje van 20x geconcentreerde activerend reagens [(bv 1000 ng / ml DNP-BSA of DNP-HSA (Ag), 200 uM Ca2 + ionofoor (A23187 bijvoorbeeld), en een combinatie van 20 uM Ca2 + ionofoor en 1000 nM 12-O- tetradecanoylforbol-13-acetaat (TPA)]. Als reagentia worden bewaard in DMSO verdund reagentia in 20x concentratie Tyrode buffer met 1% DMSO. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Verwijder de supernatanten van elk putje voorzichtig een 96 wells plaat, plaats op ijs en voorkomen tegen licht. (De bovenstaande vloeistoffen bevatten het chimère peptide NPY-mRFP die werd vrijgelaten uit de cellen). </li><li> Voeg 200 ul Tyrode buffer die 0,5% Triton X-100 aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. (Deze stap is belangrijk voor de bereiding van cellysaten die bevatten de rest van NPY-mRFP die niet losgelaten uit de cellen). Verzamel de cellysaten en overbrengen in een 96 wells plaat, plaats op ijs en voorkomen tegen licht. </li><li> Meet de fluorescentie van de cel supernatanten en cellysaten met een tllingen plaat lezer, met behulp van een 590-, 20 nm bandbreedte excitatiefilter en 635-, 35 nm bandbreedte emissie filter. </li><li> Bereken het percentage van NPY-mRFP uitgebracht: OPMERKING: De fluorescentie lezer maatregel arbitraire fluorescentie-eenheden (AFU). AFU zijn afhankelijk van het apparaat en de gevoeligheid en de transfectie-efficiëntie. <ol><li> Stel de autofluorescentie van niet-getransfecteerde RBL cellen als blanco. Verdeel de AFU van elk supernatant aan de totale fluorescentie (AFU van de bovenstaande vloeistoffen + AFU van de bijbehorende lysaat) en vermenigvuldig met 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse Microscopie van Exocytose <ol><li> Seed 7.5 × 10 4 van de getransfecteerde cellen / kamer in een 8-well kamer borosilicaat dekglaasje systeem. Na 18-24 uur, verwijder het kweekmedium uit de kamers en was 3 maal met Tyrode buffer </li><li> Voeg 72 ul van Tyrode buffer aan elke kamer. Verdun de activerende reagentia Tyrode buffer 10x concentratie. </li> &lt;li&gt; Gebruik een confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verhitte kamer (37 ° C) en CO2 controller (4,8%) en een 40x of 63x objectief. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en lasers. Zorg ervoor dat de verwarmde kamer is op de juiste temperatuur voor het starten van het experiment. </li><li> Plaats de kamer in de verwarmde ruimte en zorg ervoor dat de kamer goed en stabiel is geïnstalleerd. </li><li> Zet de fluorescentie licht volgens de relevante fluorofoor en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang is in het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren. Het is belangrijk dat dit veld over 2-3 getransfecteerde cellen bevatten. De getransfecteerde cellen moet goed gespreid maar elkaar niet raken. </li><li> Pas het laservermogen (afhankelijk van de microscoop) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren, en stel de versterking en offset de signaal-ruisverhouding te passen. Scan snel in ofder de duur van laser expositie (gemiddeld 2) te verminderen. </li><li> Pas de pinhole grootte een maximum, dit maakt het verminderen van de laservermogen en afbeeldingen gerichte langere periode te handhaven. Indien gewenst, stelt u de parameters voor de Z-stack om het beeld te reconstrueren in de driedimensionale, pas de pinhole grootte tot 1 luchtig eenheid (AU), die de beste signaal-ruisverhouding geeft en het verwerven van de opeenvolgende scannen van twee-dimensionale confocale optische schijfjes in de z -axes optische plakjes ≤0.7 urn. </li><li> Stel het interval tussen elke verkrijging 15-30 sec en de duur van de totale acquisitie tot 15 min, en begint aan afbeeldingen. Na 5 min van verwerving pauzeren de tijdreeks. Voeg 8 ul van de 10x trekker over en onmiddellijk verder met de overname. </li><li> Sla de foto&#39;s, het uitvoeren deconvolutie met behulp van een deconvolutie software en reconstrueren de stapels tot drie dimensionale beelden en een film met Imaris software. </li></ol><ol><li> Importeren de gegevens van de deconvoluted tijdreeksen beelden die werden verkregen door de confocale fluorescentie microscoop Imaris software. Deze software leest meer dan 40 microscopie bestanden. Als de software niet kan lezen van de bestanden; de bestanden converteren naar TIF-bestanden en import. </li><li> Om tijd punten toe te voegen aan het einde van een open data set druk op Bewerken -&gt; Add Time Points en de set importeren nieuwe gegevens. </li><li> Maak het oppervlak van de mRFP kanaal met behulp van de optie oppervlak wizard. Kies de standaard algoritme. Kies het kanaal van NPY-mRFP. Markeer de optie smoothing om ruis te verminderen. Om verlies te voorkomen van kleine details te verminderen het gebied detailniveau tot 0,05 micrometer. </li><li> Stel de intensiteit drempel. Nieuwe grijze oppervlak zal worden weergegeven. Ga naar &#39;Instellingen&#39; en schakel de stijl van &quot;Middelpunt&quot; tot &quot;Surface&quot;. </li><li> Ga naar het tabblad statistiek in de eigenschappen van het geselecteerde object, selecteert u de gedetailleerde tabblad en de specifieke waarde such fluorescentie-intensiteit, volume etc. </li><li> Bekijk de gegevens en bevestigen dat de waarden zijn compatibel met de beelden. Bijvoorbeeld kunnen twee of meer aangrenzende korrels worden gemeten als een grotere korrel. Voor het kwantificeren van de gemiddelde korrelgrootte verdelen de grootte van de gefuseerde granules het werkelijke aantal korrels. </li><li> De gewenste gegevens naar Excel-bestanden te exporteren en analyseren van de gegevens. </li></ol> f

<ol><li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+allergy+and+infection%3A+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%2C+angiogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li>
<li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+immunoregulation%2Fimmunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li>
<li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators+in+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li>
<li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34%28%2B%29%2C+c-kit%28%2B%29%2C+and+expresses+aminopeptidase+N+%28CD13%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li>
<li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li>
<li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+biology%3A+introduction+and+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).</li>
<li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agents+that+release+histamine+from+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li>
<li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li>
<li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li>
<li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li>
<li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+adenosine+receptors+function%3A+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134(2012).</li>
<li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li>
<li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li>
<li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li>
<li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li>
<li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li>
<li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li>
<li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li>
<li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules%3A+impact+on+size%2C+cargo%2C+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangenconflicten.

We beschrijven een innovatieve strategie die kwantificering van MC exocytose en vier (x, y, z, t) afmeting kwantificering combinatie van tijd vervallen driedimensionale beeldvorming van de SG in levende cellen met behulp van een reportergen voor exocytose. Deze techniek maakt het screenen van families van eiwitten voor hun impact op de MC-functie, zoals monitoring SG&#39;s al vanaf hun vertrek uit het Golgi door hun rijping, acquisitie van exocytose competentie en degranulatie. De combinatie van metingen van exocytose m...

Mestcellen (MC) zijn immuuncellen die bekend staan ​​om hun betrokkenheid bij allergische en ontstekingsreacties zoals artritis, astma, eosinofiele oesofagitis, chronische dermatitis en anafylactische shock 1,2 en andere aandoeningen zoals coronaire hartziekte 3,5 en kanker 3,4. Daarnaast MCs spelen een belangrijke rol in aangeboren en adaptieve immuniteit, zowel in de afweer tegen bacteriën en parasieten en door onderdrukking van immuunreacties, bijvoorbeeld het induceren allotransplantaat tolerantie 5,6. MCs afkomstig uit het beenmerg, het ontwikkelen van CD34 + / CD117 + pluripotente voorlopercellen 7. Geëngageerde beenmerg MC voorouders vrijkomen in de bloedbaan en migreren naar de perifere weefsels lokaliseren voornamelijk binnen bindweefsels en epitheeloppervlakken 8. Rijping en terminale differentiatie worden uiteindelijk gerealiseerd onder invloed of cytokines binnen het omringende milieu 8,9. MC kan worden geactiveerd door een allergeen (antigen, Ag), waarvan de ontmoeting resulteerde in de generatie van immunoglobuline E (IgE) type antilichamen. Binding van dergelijke IgE aan de MC&#39;s FcsRI receptoren, gevolgd door verknoping van celgebonden IgE bij hernieuwde blootstelling aan hetzelfde Ag, leidt FceRI aggregatie en initiatie van een signalerende cascade die culmineert in degranulatie [herzien 10,11] . MCs worden ze geactiveerd, onafhankelijk van IgE door neuropeptiden 5,12, toxines 13 bacteriële en virale antigenen 14,15, een aantal positief geladen peptiden gezamenlijk aangeduid als basis- secretagogen, immuuncellen en cytokines 5,13,12,16 17. MCs worden ze geactiveerd door veel van hun bezit mediatoren, die de ontstekingsreactie verder versterken. MC&#39;s zijn verpakt met secretoire korrels (SGS) dat immuno bevattenregulerende mediatoren, zoals vasoactieve aminen, zoals histamine en serotonine (bij knaagdieren), proteoglycanen, proteasen, zoals chymase en tryptase, vasculaire endotheliale groeifactor en verschillende cytokines en chemokines 8,9. Deze mediatoren &quot;klaar voor&quot; en eenmaal MCs worden geactiveerd door een geschikte stimulus, worden deze mediatoren vrijgemaakt uit de cellen door gereguleerde exocytose (degranulatie) in een kwestie van seconden tot minuten 18,19. Deze initiële gebeurtenis wordt gevolgd door de de novo synthese en afgifte van een grote reeks van biologisch potente stoffen, zoals arachidonzuur metabolieten, verschillende cytokinen en chemokinen 20,21,22. Release van nieuw gesynthetiseerde producten gebeurt onafhankelijk van SG release. Tezamen zijn deze bemiddelaars initiëren vroege en late fase inflammatoire en allergische reacties. Daarom is het begrip van de mechanismen verantwoordelijk voor MC activering en degranulatie zijn zowel theoretisch en klinisch importance. De moeilijkheid om genetisch te manipuleren primaire en gekweekte MCs heeft bemoeilijkt de pogingen om de mechanismen die ten grondslag liggen MC degranulatie, die slecht bleef opgelost te helderen. Om dit probleem ontwikkelden we een reporter gebaseerde test met gelijktijdig transfecteren van de mucosale mast cellijn, rat basofiele leukemie (RBL) -2H3 (hierna RBL) of beenmerg afgeleide MCs (BMMCs) 30 met een gen van interesse en neuropeptide Y (NPY) gefuseerd aan monomere RFP (mRFP), als SG reporter. NPY is eerder aangetoond dat het gedrag van endogene SG merkers in andere systemen recapituleren. Bovendien, omdat mRFP fluorescentie pH ongevoelig expressie van NPY-mRFP maakt visualisatie van de zure SG en kwantitatieve beoordeling van exocytose door 96-well platen en een fluorescentie plaatlezer. We hebben aangetoond dat NPY-mRFP wordt geleverd aan de zure SG van RBL-cellen en BMMCs en wordt vrijgemaakt uit de cellenop een gereguleerde manier naast de endogene SG lading (dat wil zeggen, β-hexosaminidase en serotonine) 30, 32. Dit protocol voorziet in een hoge-resolutie-imaging gebaseerde methodologie die screening genen van belang zijn voor hun fenotypische en functionele impact op SG kenmerken en degranulatie in RBL cellen 32 toestaat. Specifiek, dit protocol maakt real time tracking van MC SG en kwantificering van de oppervlakte en het volume groot, aantal, kinetiek van assemblage, hun beweging langs de cel cytoskelet en hun uiteindelijke fusie met de plasmamembraan onder verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, sensibiliserende de cellen met DNP-specifieke IgE en het activeren van de cellen met een meerwaardige Ag (DNP geconjugeerd serumalbumine) onder verschillende verstoringen (dwz, het uitschakelen van genen van belang, meer dan de expressie van wt of gemuteerde genen, of farmacologische manipulaties) en vergeleken met controle cellen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE health care Life sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate membraan, poriegrootte 0.22&nbsp;&mu;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning weefselkweek behandelde kweekschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Oplossing (TE)</td><td>Life technologies</td><td>R001100</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>PIPES dikaliumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetaat hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetaat tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminzuur kaliumzout monohydraat (Kaliumglutamaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mm elektroporatie cuvetten</td><td>cell projects</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENE PULSER MET PULSCONTROLLER &amp; CAPACITANTIE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambered coverglass</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 well, vlakke bodem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 of CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate fluorescentie lezer- Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium ionofoor A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>Vermijden direct licht</td></tr><tr><td>12-O-tetradecanoyl-13-acetaat (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoklonaal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Vermijden direct licht</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Confocal fluorescerende microscoop:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 inverted</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel of Prism of andere analysesoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ander reagens:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&nbsp;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Mononatriumfosfaat&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>Steriele water</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoekt mestcel secretiegranula; biosynthese van exocytose

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mestcellen (MC) zijn secretoire cellen van het immuunsysteem die de fysiologische en pathologische functies vervullen door het vrijgeven van voorgevormde en nieuw gesynthetiseerde allergische, ontstekings- en immuunregulerende mediatoren. MCs &#39;mediators beïnvloeden meerdere weefsels en organen culminerend in allergische en immuunreacties. De synthese, opslag en afgifte van de MC mediators zijn sterk gereguleerd. De voorgevormde bemiddelaars zijn verpakt in cytoplasmatische secretoire korrels (SG) die fuseren met de plasmamembraan en de inhoud ervan vrij te maken door gereguleerde exocytose. We presenteren een protocol gebaseerd op de co-expressie van een gen van belang met een reportergen dat is gericht op de SG en opgenomen in een reguleerbare wijze naast de endogene SG mediators. Het protocol maakt hoge resolutie vierdimensionale confocale analyses van de MC SG&#39;s en het toezicht op hun tijdlijn van biogenese naar aanleiding exocytose. Dus, door dit protocol voor screening van genen interest hun fenotypische en functionele effect maakt ontcijferen moleculaire mechanismen die de biogenese en exocytose MC SG bepalen en identificeren van de betrokken regulatoren. Daarbij moet verder inzicht in de cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor MCs functie in gezondheid en ziekte worden.

Vanwege de lage transfectie efficiëntie van MC, genetische manipulaties waarschijnlijk geen invloed op uitlezingen van gemiddeld secretie gemeten door endogene mediators SG verlaten. Niettemin, door het instellen volledige co-expressie van het reportergen NPY-mRFP en de gecotransfecteerde plasmide in dezelfde cellen, controle van NPY-mRFP resultaten bewaken uitsluitend de celpopulatie die het gen van belang tot expressie brengt. Daarom is het voordeel van deze assay ten opzichte van conventionele werkwijzen is het vermo...

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel&#39;s.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de mechanismen die de ontwikkeling van mestcelsecretorische granula en cytose reguleren. Dit wordt bereikt door eerst mestcellen te cotransfecteren met een reportergen voor exocytose, evenals een gen van belang. De tweede stap is het beoordelen van het effect van het geteste gen op exocytose door de cellen te stimuleren en het fluorescentiesignaal van het reportergen tijdens exocytose te monitoren.Vervolgens wordt het effect van het geteste gen op de generatie en ontwikkeling van secretoire korrels in mestcellen beoordeeld middels confocale beeldvorming van het reportergen dat in de secretoire korrels gelokaliseerd is. De laatste stap is het uitvoeren van een morfometrische analyse van de secretoire korrels. Uiteindelijk wordt fluorescentielabeling van secretoire korrels in mestcellen met behulp van een reportergen gebruikt om veranderingen in mestcellen, de ontwikkeling van secretoire korrels en hun exocytose aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het meten van de afgifte van endogene mediatoren, beta-hexaminidase of histamine, is dat deze is gebaseerd op de co-

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a colorimetric assay to determine the degranulation activity of mast cells. The enzyme released by the mast cells hydrolyzes the substrate and produces a colored product. The degranulation activity of the mast cells was measured as the percentage release of enzymes outside the cell normalized with the total enzyme content in the cell.

Mast Cell Degranulation Assay to Study the Effect of a Target Chemical

This video demonstrates mast cell exocytosis induced by an activating reagent that includes a calcium ionophore, initiating the release of secretory granules containing the fluorescent reporter protein NPY-mRFP. Subsequently, we quantitatively assess the exocytosis by measuring the released NPY-mRFP using a fluorescence plate reader.

Measuring Mast Cell Exocytosis via Neuropeptide Y Monomeric Red Fluorescent Protein Release

This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran — a fluorescent reporter — which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium's higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

Mastceldegranulering, de vrijlating van allergische mediatoren, is belangrijk bij allergie, astma, en parasiet defensie. Technieken 1 voor de beoordeling van effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen op degranulatie Hier laten we zien, methodologie onlangs gebruikt om de krachtige remmende effect van antibacterieel middel triclosan 2 vertonen.

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.

Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Leer hoe mastcel secretiegranula en exocytose worden bestudeerd met fluorescentie-reportergenen en confocale beeldvorming. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van granulamorfologie en genfunctie mogelijk.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Meer video's verkennen