Name: Imaging Lokale Ca 2+ Signalen in gekweekte zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer lokale Ca2+ signalen in zoogdiercellen beelden met fluorescentiemicroscopie en geautomatiseerde analyse. Deze methode detecteert IP3-gemedieerde calciumdynamica met hoge resolutie voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies GM 100201 aan I.F.S en GM 048071 en GM 065830 aan I.P.

We presenteren gedetailleerde procedures voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen in de menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen. Deze procedures kunnen worden aangepast aan het intracellulaire Ca2 + signalen in veel celtypen 8-10. 1. Bereiding van Cellen <ol><li> De cultuur van de cellen af ​​te beelden volgens de instructies vermeld op de website van hun leverancier. </li><li> Een paar dagen voor beeldvorming, oogsten cellen gekweekt in weefselkweek kolf met 1 ml 0,25% trypsine / EDTA (2-3 min). Na onthechting, voeg een gelijk volume kweekmedium aan het trypsine te inactiveren. </li><li> Voer een celgetal met behulp van een hemocytometer en zaad cellen in glazen bodem beeldvorming gerechten bij een dichtheid van 3-7 x 10 4 cellen per gerecht. Selecteer de cellen voor beeldvorming experimenten bij het bereiken van 60% samenvloeiing (2-3 dagen). </li></ol> 2. Voorbereiding van oplossingen en reagentia <ol><li> Bereid een Ca 2+ bevattende HEPES gebufferdzoutoplossing (Ca2 + -HBSS) uit (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, en 10 glucose; pH = 7,4 bij kamertemperatuur (RT) met NaOH. Bereid Ca2 + -HBSS zonder toevoeging van glucose en bewaar bij 4 ° C; voeg glucose om de oplossing onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Oplosbaar membraan doordringende vormen van de fluorescente Ca2 + indicator Cal-520 (1 mM), ci-IP3 (200 uM) en EGTA (100 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO) met 20% Pluronic F-127. Aliquot deze reagentia in Eppendorf buizen en opslag, afgeschermd van licht en vocht, bij -20 ° C. </li></ol> 3. Laden Cellen met een membraan-permeant Cal-520, ci-IP 3 en EGTA <ol><li> Bereid de &quot;laadbuffer&quot; door verdunning van de voorraadoplossing van membraan-permeant Cal-520 en ci-IP3 tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM en 1 uM, respectievelijk Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspireren culture media en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 + -HBSS driemaal. </li><li> Verwijder Ca2 + -HBSS en incubeer cellen in laadbuffer gedurende 60 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verwijder laadbuffer en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 + -HBSS driemaal. <ol><li> Indien gewenst, bij deze stap, weegcellen met EGTA / AM door verdunning van de voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM in Ca2 + -HBSS en incubeer cellen gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na deze incubatie, spoel cellen drie keer met Ca 2+ -HBSS voordat u verder met stap 3.5. </li></ol></li><li> Incubeer de cellen met Ca2 + -HBSS gedurende 30 min om voor de verestering van geladen reagentia. </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming vervangen Ca2 + -HBSS met &quot;verse&quot; Ca 2+ -HBSS om elke kleurstof die tijdens de laatste incubatie in het bad kan zijn gelekt verwijderen. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Image Acquisition <ol><li> Plaats een kleine druppel immersie olie op de 100X APO TIRF doelstelling (NA 1,49). </li><li> Monteer de beeldvorming schotel op het podium van de omgekeerde microscoop en breng de cellen in beeld met behulp van doorvallend licht. Het is belangrijk de beeldvormende schotel te bewegen tijdens de opname voorkomen beveiligen. </li><li> Verlichten cellen met een 488 nm laser om Cal-520 prikkelen en te verzamelen uitgezonden fluorescentie (λ&gt; 510 nm) met behulp van een high-speed EMCCD camera. Opmerking: Het softwarepakket dat de microscoop werking kan de gebruiker vertaal een focusseerlens waarbij de laserbundel worden ingevoerd hetzij aan de uiterste rand van de doelstelling back opening (voor TIRF excitatie) of meer centraal (voor &quot;WF&quot; excitatie). </li><li> Met behulp van de EMCCD software, verminderen het beeldveld van de volledige 512 x 512 pixels, om gegevens te verzamelen bij de noodzakelijke temporele resolutie aan lokale Ca 2+ gebeurtenissen vast te leggen. OPMERKING: Bijvoorbeeld, centrum quadacquisitie van 256 x 256 pixels versnelt de overname tarief tot 66 fps. Het is ook mogelijk om verdere toename van de frame rate van de EMCCD camera tot 500 fps met behulp van een geïsoleerde Crop Mode functie. </li><li> Configureer de software enkele seconden basislijn activiteit automatisch opnemen geeft een met UV flash om de cellen en blijven opnemen voor een 10-30 sec. OPMERKING: Een UV-flitser wordt geleverd met behulp van een Xenon boog lichtbron geïntroduceerd door middel van een UV-reflecterende dichroïde spiegel in de achterkant haven van de microscoop. De duur en intensiteit van de UV flits empirisch op een gewenste frequentie van lokale Ca2 + gebeurtenissen roepen. </li><li> Bestanden opslaan als image stacks voor off-line analyse. </li></ol> 5. Geautomatiseerde Ca 2+ Image Analysis OPMERKING: Het is mogelijk om te bekijken, te verwerken en te analyseren vastgelegde gegevens met behulp van veel commerciële softwarepakketten. We hebben echter een algoritme snel automatiseren identificatie een ontwikkeldd analyse van lokale Ca2 + signalen. Een gedetailleerde beschrijving van de ruimtelijke en temporele filters in dit algoritme kan genereren van de AF / F 0 en identificatie / analyseroutines gevonden in 11. Dit algoritme is ontwikkeld om te draaien op het open-source software platform Python, en kan verkregen worden, samen met het monster experimentele gegevens en gedetailleerde instructies voor de gebruiker, per e-mailen van de desbetreffende auteur (ismith@uci.edu). <ol><li> Bestanden converteren naar de op maat geschreven algoritme om de multi-plane .tiff bestandsformaat te worden geïmporteerd. </li><li> Zoek de map met de analyse-algoritme en dubbelklik op het run.exe. </li><li> Selecteer de .tiff bestand te analyseren. </li><li> Kies analyse parameters in het dialoogvenster Openen. Zie figuur 2A voor standaard parameters voor de steekproef van gegevens. </li><li> Bepaal het zwartniveau worden gecompenseerd door de afbeeldingsstapel door ofwel de cursor naar een deel van het gezichtsveld dat n doetot bevatten een cel (zie figuur 2B) of door het handmatig invoeren van een zwart-niveau met behulp van de &#39;Set Black Level&#39; prompt. </li><li> Observeren vier vensters op het scherm na analyse door de software (figuur 2C-F). C is een monochroom beeld van rustende fluorescentie van cellen geanalyseerd. Witte vierkantjes bovenop dit beeld zijn eventlocaties, bepaald als het zwaartepunt posities van tweedimensionale Gaussische functies gemonteerd gebeurtenissen. </li><li> Klik op elk evenement locatie of druk op de cursortoetsen om tussen gebeurtenissen. Op deze momenten de-achtergrond afgetrokken, Gauss gladgestreken fluorescentieverhouding veranderingen (AF / F 0) op elk van deze sites update venster D. OPMERKING: Rood gemarkeerd gebeurtenissen zijn vastbesloten om zijn afkomstig uit die bepaalde site en niet uit &#39;doordrukken&#39; van activiteit gelokaliseerd in aangrenzende sites. De onderste blauw spoor geeft aan waar het fluorescentiesignaal op de gekozen plaats boven het detectiedrempel, terwijl de zwarte lijn geeft gebeurtenissen afkomstig uit die plaats (corresponderend met de rode gemarkeerde events). </li><li> Klik op een rode gemarkeerde gebeurtenis bijwerken venster E dat de temporele evolutie van de gebeurtenis weergeeft, en raam F, die toont de ruimtelijke profiel van het evenement gemiddeld over het tijdsverloop, samen met de ruimtelijke profiel van de gemonteerde Gaussische functie. </li><li> Handmatig de gebeurtenissen die zijn geïdentificeerd, zodat artefacten uit de analyse kan worden afgewezen. Wis dergelijke evenementen door rechts te klikken op de rode gemarkeerd evenementen. LET OP: In onze handen, Ca 2+ flux door één IP-3 R-kanalen oproept signalen met AF / F 0 ongeveer 0,11, dus elke gedetecteerde &#39;events&#39; aanzienlijk kleiner dan dit zijn waarschijnlijk valse positieven zijn. </li><li> Exporteer gegevens door te kiezen voor &#39;Save to Excel&#39; of exporteren van gegevens op een per cel basis door het tekenen rond de cel van de rente en het selecteren van &#39;Save CellR17 ;. NB: De gegevens worden opgeslagen in dezelfde map als het originele beeld stapel. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We beschrijven hier protocollen voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen in gekweekte zoogdiercellen met fluorescerende Ca 2+ indicatoren. Verder beschrijven we een algoritme met een intuïtieve gebruikersinterface die de identificatie en analyse van de verkregen data automatiseert. De hier beschreven procedure gebruik maken van de fluorescerende Ca 2+ indicator Cal-520, maar veel andere Ca 2+ gevoelige kleurstoffen zoals Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 en Oregon Green BA...

Calciumionen (Ca 2+) alomtegenwoordig reguleren een divers aanbod van biologische processen, met inbegrip van genexpressie, secretie en langdurige veranderingen in de synaptische plasticiteit 1. Een manier waardoor Ca 2+ kan handelen in zo&#39;n diverse manier is door middel van de verschillende ruimtelijke en temporele patronen van Ca 2+ signaleert een cel kan genereren. Bijvoorbeeld wereldwijde verhogingen in cytosolisch [Ca 2+] trekker contractie van glad spierweefsel 2 terwijl kleinere, plaatselijke voorbijgaande verhogingen (lokale Ca 2+ microdomeinen) stimuleren genexpressie essentieel voor leren en geheugen 3. Vrije cytosolische [Ca 2+] wordt op ~ 100 nM in rust, maar snel oplopen tot verscheidene micro-molaire na de instroom van Ca2 + in het cytosol door Ca2 + -doorlaatbare ionenkanalen in het plasmamembraan en de bevrijding van Ca 2+ uit intracellulaire stores. Ons laboratorium richt zich op de inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor (IP 3R) dat een Ca2 + afgifte kanaal in het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vormt. Na binding van beide IP-3 en Ca 2+ naar het cytosol activeren van websites van de receptor, de IP 3 R-kanaal opent bevrijden Ca 2+ afgezonderd binnen het ER lumen. De afgifte van Ca2 + kan ruimtelijk beperkt blijven tot een klein cluster van IP3 Rs een lokale microdomein cytosolische Ca 2+ genereren (Ca2 + bladerdeeg 4) of, afhankelijk van de nabijheid van naburige clusters van IP3 Rs, kan propageren gedurende een cel door het aantrekken van meerdere bladerdeeg sites door middel van een proces van Ca 2+ geïnduceerde Ca 2+ -release (CKP) 5,6. De invoering van fluorescerende klein molecuul Ca 2+ indicatorkleurstoffen ontwikkeld door Roger Tsien 7, in combinatie met geavanceerde microscopie Imaging technieken sterk vergemakkelijkt ons begrip van Ca2 + signalering. Recente ontwikkelingen in de camera&#39;s gebruikt voor microscopie nu toe voor de beeldvorming van voorbijgaande lokale Ca 2+ evenementen zoals soesjes met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Momenteel beschikbare EMCCD camera mogelijk beeldvorming met 128 x 128 pixels bij&gt; 500 frames sec -1 (fps) en de nieuwe generatie Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) camera&#39;s hogere pixelresolutie, en zelfs hogere snelheid ten koste van iets hoger geluidsniveaus. In combinatie met de totale interne reflectie (TIRF) microscopie is het nu mogelijk om het beeld enkele Ca 2+ kanaal gebeurtenissen 8,9. Deze benadering maakt de beeldvorming van honderden kanalen / gebeurtenissen gelijktijdig, terwijl het genereren van grote datasets (ca. 1 GB per minuut) dat automatische verwerking visuele identificatie en analyse onuitvoerbaar maken en plaats een last op de ontwikkeling van geautomatiseerde algoritmen. + signalen in intacte zoogdiercellen behulp van fluorescente Ca2 + indicatoren. We verder aan te tonen een algoritme ontwikkeld in de open-source omgeving Python dat identificatie en analyse van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen afgebeeld door zowel TIRF en conventionele brede veld epi-fluorescentie (WF) microscopie automatiseert. Hoewel we beschrijven deze benaderingen in de context van IP3 -generated Ca2 + signalen, die zich gemakkelijk lenen om lokale wijzigingen in cytosolisch [Ca 2+] afkomstig van verschillende Ca2 + -doorlaatbare ionenkanalen in ofwel de oppervlaktestudie membraan of intracellulaire organellen 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfaat-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodem beeldvorming schalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging lokale ca<sup&gt; 2+</sup&gt; signalen in gekweekte zoogdiercellen

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolische Ca 2+ -ionen reguleren talrijke aspecten van de cellulaire activiteit in bijna alle celtypen, beheersen van processen zo breed als gen-transcriptie, elektrische prikkelbaarheid en celproliferatie. De diversiteit en specificiteit van Ca 2+ signalering is afgeleid van mechanismen die Ca2 + signalen worden gegenereerd om te handelen over verschillende tijd en ruimtelijke schalen, gaande van cel-brede trillingen en golven die zich over de perioden van minuten tot lokale voorbijgaande Ca 2+ microdomeinen (Ca 2+ pufjes) blijvende milliseconden. Recente ontwikkelingen in de elektron vermenigvuldigd CCD (EMCCD) camera&#39;s nu mogelijk voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ signalen met een 128 x 128 pixel ruimtelijke resolutie met een snelheid van&gt; 500 frames sec -1 (fps). Deze aanpak is zeer parallel en maakt de gelijktijdige bewaking van honderden kanalen of bladerdeeg sites in een enkel experiment. Echter, de enorme hoeveelheden gegevens die worden gegenereerd (ca. 1 Gb per min) maken visuele identificatie en analyse van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen onuitvoerbaar. Hier beschrijven we en demonstreren van de procedures voor de verwerving, detectie en analyse van de lokale IP-3-gemedieerde Ca2 + signalen in intacte zoogdiercellen geladen met Ca 2+ indicatoren met behulp van zowel wide-field epi-fluorescentie (WF) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Verder beschrijven we een algoritme ontwikkeld binnen de open-source software-omgeving Python dat de identificatie en analyse van deze lokale Ca 2+ signalen automatiseert. Het algoritme lokaliseert websites van Ca 2+ release met sub-pixel resolutie; kan de gebruiker van de gegevens; en uitgangen tijd sequenties van fluorescentieverhouding signalen samen met amplitude en kinetische gegevens in een Excel-compatibele tafel.

Figuur 1A toont een WF beeld van rust Cal-520 fluorescentie in menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen ook geladen met ci-IP-3. Blootstelling van deze cellen om een 100 msec UV flits van de foto-versie i-IP 3 uitgelokt voorbijgaande Ca 2+ soesjes op discrete sites (opgemerkt door de witte cirkels in figuur 1A). Fluorescentie sporen gemeten in situ vond snelle stijgende fase wegens tijdelijke openingen van IP3 Rs, gevolgd door een veel langzame...

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de acquisitie, detectie en analyse van lokale IP three-gemedieerde calciumsignalen in intacte zoogdiercellen met behulp van cameragebaseerde beeldvorming. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te kweken op glazen dekglasplaatjes en deze te laden met celmembraan-permeabele vormen van de fluorescente calciumindicator CAL five 20 en caged IP three.De tweede stap is het positioneren van het dekglas op de tafel van een omgekeerde microscoop en het belichten van het monster met 488 nanometer licht om de calciumsensitieve fluorescerende kleurstof Cal five 20 te exciteren. Vervolgens worden lokale calciumsignalen geïnduceerd door de cellen bloot te stellen aan een korte puls UV-licht. Dit zorgt voor de fotoliberatie van IP three uit een gecaged precursor, zodat het nu kan binden aan de acetol trisphosphate receptor en de calciumvrijgave uit het endoplasmatisch reticulum kan mediëren.De laatste stap is het importeren van de beeldstapel in het op maat geschreven algoritme om de geautomatiseerde analyse van de geregistreerde gegevens te starten. Uiteindelijk lokaliseert het algoritme snel locaties van calciumvrijgave met sub-pixelr

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

De eigenschappen en functies van astrocytenintracellulaire Ca2+ signalen in het striatum blijven onvolledig onderzocht. We beschrijven methoden om genetisch gecodeerde calciumindicatoren in striatale astrocyten tot expressie te brengen met behulp van adeno-geassocieerde virussen van serotype 2/5 (AAV2/5), evenals procedures om Ca2+ signalen binnen striatale astrocyten in situ betrouwbaar te beeldhouwen.

Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca2 + imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca2 + signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Hier bieden we een uitgebreid protocol om initiële lokale Ca2+- signalen, bekend als Ca2+- microdomeinen, in primaire muizen- en menselijke T-cellen op te lossen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers die Ca2+- signaleringsroutes in immuuncellen onderzoeken en hun functie verder ontrafelen.

Beeldvorming van initiële Ca2+ microdomeinen in primaire T-cellen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer lokale Ca2+ signalen in zoogdiercellen beelden met fluorescentiemicroscopie en geautomatiseerde analyse. Deze methode detecteert IP3-gemedieerde calciumdynamica met hoge resolutie voor celbiologisch onderzoek.

Imaging Lokale Ca

Meer video's verkennen