Name: Het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie Soort Barrières met een In Vitro Prioneiwit Conversie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer een in vitro prion-eiwitconversie-assay om soortbarrières van overdraagbare spongiforme encefalopathieën te beoordelen zonder dierproeven. Deze methode berekent de conversie-efficiëntieratio voor risicobeoordeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien en Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) en Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) voor de hulp bij het verkrijgen van weefsel. We danken ook het Wisconsin State Laboratory of Hygiene voor diagnostische testservices, en Dr. Tonie Rocke en haar personeel (USGS National Wildlife Health Center) voor het gebruik van apparatuur. Elk gebruik van handels-, product- of bedrijfsnamen is alleen voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

Dierlijke werk uitgevoerd aan de USGS National Wildlife Health Center werd uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare richtlijnen en onder institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie protocol # EP080716. Weefsels uit-jager geoogst dieren waren geschenken van de Wisconsin of Michigan Afdelingen van Natuurlijke Hulpbronnen. 1. Oplossing Voorbereiding OPMERKING: De onderstaande oplossingen zijn nodig voor de voorbereiding van de CER assay substraat in Deel 2 hieronder. Bereid elk van deze oplossingen van hogere concentratie voorraad oplossingen; aanbevolen concentraties voorraadoplossingen worden haakjes na elke respectieve chemische naam vermeld. Bereid alle oplossingen vers na voorbereiding van de ondergrond en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. <ol><li> Voor lysis buffer, een oplossing van de volgende in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 voorraadoplossing aanbevolen): 100 mM sodium chloride (NaCl, 1 M stockoplossing), 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 stockoplossing), 0,5% NP-40 (10% voorraad-oplossing), 0,5% deoxycholaat (DOC, 10% stockoplossing ). </li><li> Voor conversie buffer, een oplossing van 0,05% natriumdodecylsulfaat (SDS, 10% voorraadoplossing) en 0,5% Triton X-100 (10% voorraadoplossing) in 1 fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 10, pH 7,4 stamoplossing). </li><li> Voor chaotropische oplossingen, voor te bereiden twee 3 M oplossingen van guanidinehydrochloride (GdnHCl, 8 M voorraad) in 1x PBS (10x voorraad-oplossing). Stel de pH van een van de oplossingen tot 3,5 ± 0,05 met geconcentreerd zoutzuur (HCl). De pH van de tweede oplossing is bij pH 7,4 ± 0,05 en aanpassen met geconcentreerd zoutzuur of natriumhydroxide (NaOH) indien nodig. </li></ol> 2. Bereid CER Assay Ondergrond Pairs <ol><li> Verkrijgen van gezonde, niet-TSE-geïnfecteerde hersenweefsel van soorten van rente en een 10% gewicht per-volume te bereiden(W / v) homogenaat in lysisbuffer met een van de volgende methoden: dounce, parel molen of vijzel homogeniseren. Verder verfijnen resulterende homogenaten door hen te onderwerpen aan de spuit-en-naald homogenisering, met behulp van naalden van toenemende gauge tot substraat kan worden opgezogen en uitgestoten met gemak door middel van een 27 G naald van de spuit. <ol><li> Voor substraten bereid uit knaagdieren en andere kleine zoogdieren, homogeniseren hele brein (s); voor substraten bereid van grotere zoogdieren, gebruiken OBEX (hersenstam) weefsel homogenaten bereiden. Bij het selecteren van de hoeveelheid hersenhomogenaat, bereid maximaal 50% van de capaciteit van de centrifuge voor proteïneprecipitatie in stap 2.6. </li><li> Als de kwaliteit van de verkregen hersenweefsel twijfelachtig beoordelen PrP C niveaus door SDS-PAGE en immunoblot 16 17 voorafgaand aan substraat preparaat. </li></ol></li><li> Verdeel hersenhomogenaat in twee gelijke volumes in aparte gelabelde plastic conische buizen. Voeg GdnHCl (3 M oplossingen in PBS 1) aan beide pH 3,5 of 7,4 aan elke buis in een 1: 1 volumeverhouding met hersenhomogenaat. </li><li> Controleer de pH-waarden van de twee oplossingen. Stel de pH van de pH 3,5 tot pH substraat ± 0,05 met geconcentreerd HCl. Controleer de pH van het andere substraat blijft bij pH 7,4 ± 0,05 en pH zo nodig met HCl of NaOH indien nodig. Vermijd overschrijding pH door oordeelkundige toevoeging van zuur of base. </li><li> Draai oplossingen op end-over-end mixer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 uur. </li><li> Neerslag eiwit door het toevoegen van vier volumes methanol aan het substraat oplossingen telkens conische buis, vortex goed te mengen en incuberen bij -20 ° C gedurende 16-18 uur. </li><li> Sediment monsters door centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Voorzichtig decanteren en gooi de bovenstaande vloeistoffen en laat methanol verdampen van de pellets. Gebruik wattenstaafje applicators helpt bij het absorberen methanol vast aan de binnenzijde van de buis. Sta niet toe dat pellets te over-dry en eenmaal methanol niet meer zichtbaar, verder met de volgende stap. </li><li> Hersuspendeer eiwit pellets in conversie buffer. Gebruik een hoeveelheid omzetting buffer gelijk is aan de hoeveelheid hersenhomogenaat uitgangsmateriaal verdeeld in elke buis in stap 2.2. LET OP: Het is cruciaal dat de conversie buffer gebruikt om eiwit pellets opnieuw in suspensie van zowel pH 3,5 en 7,4-behandelde substraat voorbereidingen wordt de in stap 1.2 hierboven (die lage niveaus van detergenten en een fysiologische pH bevat) oplossing. </li><li> Kort sonicaat substraat oplossingen in een cuphorn sonicator (10 sec bij ~ 30% maximale vermogen), hoeveelheid in 0,5-1,0 ml volumes in geëtiketteerde 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Voer een kwaliteitscontrole immunoblot (stap 2.9) met een deel van elk substraat. Bewaar andere fracties bij -80 ° C tot klaar om CER test (deel 4) uit te voeren. </li><li> Voer kwaliteitscontrole op CER substraat paren voor gebruik (figuur 2). Deze stappen zorgen ervoor dat CER substraten zal provide een optimaal resultaat van de conversie studies. <ol><li> Zorgen voor vergelijkbare hoeveelheden van PrP C in de twee substraten. Vergelijk PrP ​​niveaus in 10-25 pl van elk substraat door SDS-PAGE en immunoblotting 16 17. Als eiwitniveaus in de pH 7,4 en 3,5 substraten in ~ 10% van elkaar, het substraat paren geschikt zijn voor gebruik in CER studies. OPMERKING: De PrP immunoblots mag geen bewijs uitgebreide PrP C afbraak vertonen. Het PrP immunoreactiviteit dient voornamelijk&gt; 20 kDa. Bands minder dan dit molecuulgewicht kan afbraakproducten. Strepen patronen moet ongeveer gelijk tussen substraat paren zijn. </li><li> Aangezien de PrP C beide substraten PK gevoelig moet zijn, behandelen 10-25 ui van elk substraat met PK bij een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en verteren monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 1 uur in de thermo-shaker. Beoordeelt alle resterende PrP signaal door SDS-PAGE 16 en immunoblotten 17.Ondergronden met PrP res zijn niet geschikt voor gebruik in CER studies. </li></ol></li></ol> 3. Bereid TSE Agent Zaden <ol><li> Verkrijgen TSE geïnfecteerd hersenweefsel van van belang zijnde species en bereiden een 10% (w / v) homogenaat in 1x PBS pH 7,4 met behulp van de in stap 2.1 hierboven genoemde methoden. OPMERKING: zaden kunnen ook worden verkregen uit andere TSE geïnfecteerde weefsels buiten het centrale zenuwstelsel echter omzettingsrendement van hersenen afgeleide substraten door zaden afgeleid van TSE geïnfecteerde perifere weefsels nog niet experimenteel vastgesteld in de gepubliceerde literatuur. </li><li> Aliquot resulterende homogenaat (s) in 100-300 ul volumes in 0,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C tot gebruik CER analyse uit te voeren. </li></ol> 4. CER Assay OPMERKING: De CER bepaling omvat toevoeging van een relatief kleine hoeveelheid PrP TSE (verschaft in de &quot;seed&quot;) van de ene specieseen relatieve overmaat PrP C (verschaft in de geïnfecteerde hersenen &quot;substraat&quot;) van andere species die gedeeltelijk gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4. Na een uitgebreide schudden incubatieperiode wordt sjabloongerichte omzetting van PrP c van PrP TSE in elke reactie vastgesteld door de densitometrische signaal PrP res overblijft na PK digestie en immunoblot detectie. Vergelijking PrP res niveaus in de substraten eerder gedenatureerd bij pH 3,5 vs. 7,4 geeft een maat van de soort barrière. Een experimentele overzicht van deze assay procedure wordt in figuur 1. <ol><li> Langzaam ontdooien geïnfecteerde CER substraat paren (test vereist gelijke volumina substraten eerder gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4) en TSE geïnfecteerde zaad oplossingen door ze op een bed van ijs (ongeveer 1 uur ontdooien tijd). </li><li> Eenmaal volledig ontdooid, aspireren en vervolgens verdrijven elk substraat oplossing door een27 G naald meerdere malen opnieuw te homogeniseren het. Kort ultrasone trillingen elke TSE besmette zaad oplossing voor 10 sec bij ~ 30% maximale kracht. Houd alle oplossingen op het ijs, terwijl de voorbereiding conversie reacties. </li><li> Label 5 individuele lage binding, dunwandige PCR-buisjes per TSE-agens wordt getest. </li><li> Bereid omzettingsreacties in deze buizen door toevoeging van 5 ui 10% TSE-geïnfecteerde zaadoplossing 95 gl (a) CER substraat bereid bij pH 7,4 en (b) CER substraat bereid bij pH 3,5. <ol><li> Voor elke experimentele monster, bereiden parallelle reacties in CER substraat paren eerder gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4. </li><li> Optimaliseer verhoudingen van TSE-agens zaad tot niet-geïnfecteerde hersenen substraat door middel van empirische bepaling. Vaak zaad: substraat verhoudingen in dienst te houden in totaal reactie volume van 100 ul en omvatten 1:99 ui, 2:98 ui en 5:95 pi. Voor de meeste toepassingen is de 5:95 ul zaad: substraat volume verhouding passend is en wordt wat wordt gepresenteerd in this protocol. </li></ol></li><li> Bereid drie controlemonsters per TSE agens wordt als volgt getest: (a) voeg 5 ui 10% TSE-geïnfecteerde zaadoplossing 95 gl conversie buffer als controle voor invoer PrP res; voeg 5 ul omzetting buffer 95 gl substraat bereid in (b) pH 3,5 en (c) pH 7,4 als controles voor niet-specifieke niet-matrijs conversie. </li><li> Elk monster kort vortex in de gesloten PCR-buis om zaad en de ondergrond goed mengen. Volg met een kortstondige puls in een langzame bench top mini-centrifuge één volume van het reactiemengsel gevangen in de PCR-buis deksel te verwijderen. </li><li> Monsters lading in individueel-gelabelde PCR-buizen in een bench top thermo-shaker uitgerust om PCR-buisjes te accepteren. Schud de monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Na schudden toevoegen sarkosyl tot een eindconcentratie van 2% (w / v) en PK tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml. Digest monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 1 uur in de thermo-shaker. NOTE: Toevoeging van sarkosyl om monsters na de conversie helpt bij PK vertering van PrP C. Vals positieve signalen in ongeplaatste monsters (Stap 4.5) zijn vrijwel geëlimineerd door toevoeging van sarkosyl. </li><li> Voeg SDS-PAGE monsterbuffer, warmte monsters tot 95 ° C gedurende 5 minuten en lossen resterende PrP res in elk monster door SDS-PAGE 16 gevolgd door immunoblotting 17. Opmerking: na toevoeging van monsterbuffer en verwarming monsters worden onmiddellijk verwerkt of monsters bij -20 ° C worden opgeslagen of -80 ° C voorafgaand aan immunoblotting. Alle hier gepresenteerde gegevens werden gegenereerd met behulp van de Novex NuPAGE gel en overdracht systemen. Afzonderlijke monsters van de CER assay werden behandeld met monsterbuffer en reductiemiddel volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden vervolgens bij 95 ° C gedurende 5 minuten verwarmd en 30 pl van elk monster werd in een 12% bis-tris voorgegoten gels geladen. </li><li> Bereken de conversie efficiency ratio (CER) als een maatregelvan soorten barrière. Meet niveaus van PrP res met densitometrie 17 en verdeel de totale dichtheid van het pH 7,4 monster dat van het pH 3,5 monster. Vermenigvuldigen met 100 om een ​​percentage te produceren. </li><li> Gegevens te verzamelen van onafhankelijke experimentele herhalingen tot een gemiddelde CER ± standaarddeviatie voor een soort met een bepaalde TSE-agens te genereren. </li></ol>

<ol><li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).</li>
<li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strains+and+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li>
<li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li>
<li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li>
<li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li>
<li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li>
<li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722(2014).</li>
<li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32(2008).</li>
<li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li>
<li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms%3A+a+model+for+the+scrapie+species+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li>
<li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans%2C+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li>
<li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li>
<li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li>
<li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li>
<li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+%28Ovis+canadensis%29+to+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157(2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2014).</li>
<li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li>
<li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li>
<li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li>
<li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li>
<li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quaking-induced+conversion%3A+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li>
<li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753(2014).</li>
<li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li>
<li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li>
<li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623(2012).</li>
<li>Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor een succesvolle afronding van dit protocol, moet aandacht worden besteed aan PrP C niveaus in niet-geïnfecteerde hersenweefsel gebruikt voor voorbereiding van de ondergrond (stap 2.1.2) en het zaad tot ratio voor conversie reacties (stap 4.4.2) substraat. In onze ervaring, kunnen de hersenen worden gewonnen voor gebruik als CER substraat na een aanzienlijke periode post-mortem, zolang PrP C aanwezig door immunoblotting (figuur 4) is. In feite werd enige autolyse waargenomen in...

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE&#39;s, prionziekten) zijn een groep van fatale neurodegeneratieve ziekten met uitgebreide incubatie periodes die een verscheidenheid aan dieren en mensen beïnvloeden. De vermeende etiologische agens van TSE bestaat uit een verkeerd gevouwen isomeer van de gastheer prioneiwit (PrP), dat in staat is zichzelf voortplant sjabloongerichte omzetting van de normale cellulaire vorm van PrP (PrP C) in een besmettelijke, ziekte-geassocieerde vorm (PrP TSE) dat zich ophoopt in het centrale zenuwstelsel weefsels van de geïnfecteerde gastheer 1. Besmettelijke zoogdieren prionen algemeen uitzenden van host-to-host in een soort-specifieke manier, die aanleiding heeft gegeven tot het concept van de &quot;TSE soort barrière&quot; het beperken van interspecies transmissie gebeurtenissen 2. De biologische determinanten van het prion soort barrière zijn niet goed begrepen. Aminozuurvolgorde gelijkenis tussen de besmettelijke PrP TSE en de gastheer PrP C ceen sterke invloed op de vraag of conversie plaatsvindt 3-5, maar blijft onvoldoende om alle prion transmissie gebeurtenissen waargenomen in vivo 6,7 verklaren. Zo heeft de karakterisering van TSE soorten barrières grotendeels ingeroepen dier challenge studies: blootstellen naïeve dieren van een bepaalde soort te prionen van een ander en het meten van de resulterende incubatietijd van de ziekte ontstaan ​​en de attack rate als indicatoren van de transmissie-efficiëntie. Muizen die PrP C van heterologe species worden ook gebruikt voor dit type onderzoek 8. De kosten in verband met transgene muis productie en langdurige prion bioassays, evenals ethische overwegingen van het gebruik van dieren, zijn belemmeringen voor experimenteel onderzoek van TSE soorten barrières. Beoordeling van de menselijke soort barrière voor TSE&#39;s is gebaseerd op gemanipuleerde muizen met menselijke PrP C te drukken. Deze muizen vereisen lange incubatieperiode te bezwijken voor de menselijke TSE of aanpassingen aan tHet menselijke PrP C molecule voor snelle ziektebegin 9. Incubatieperiode van de niet-menselijke TSE&#39;s bij deze muizen kunnen buiten de normale muis levensduur waardoor interpretatie van negatieve resultaten uitdagend. Niet-menselijke primaten zijn ook gebruikt als proxies voor het bestuderen soortbarrières mens, maar deze studies zijn beladen met dezelfde problemen als andere soorten dierproeven en niet-menselijke primaten niet precies ziekte herhalen terwijl het zich in de menselijke gastheer. Animal bioassays blijven de &quot;gouden standaard&quot; methode voor het meten van de gevoeligheid van een soort van een TSE, maar de obstakels, kosten en ethische deze levende dierstudies onderzoek naar alternatieven gedwongen. Een aantal in vitro assays, gebaseerd op de beoordeling van de omzetting van PrP c gastheer een proteïnase K (PK) resistente toestand (PrP res) na enting van PrP TSE, ontwikkeld en gebruikt om TSE species barrières 10-12. Voorbeelden van in vitro assays omvatten celvrije conversie testen eiwit misfolding cyclische amplificatie (PMCA) en de conversie efficiency ratio (CER) test 10-14. Hoewel geen van deze tests rekening worden gehouden met betrokken bij soorten barrières na natuurlijke infectie perifere factoren, kan alle nuttige om potentieel gevoelig hosts identificeren voor TSE&#39;s zijn. Hier presenteren we het protocol voor de CER assay, waarbij twee gedenatureerd PrP C substraten afgeleid van normaal hersenweefsel homogenaten worden in tafelmodel prion omzettingsreacties (figuur 1) 13. PrP c in het substraat gedenatureerd bij pH 7,4 kan alleen PrP res worden omgezet PrP TSE gezaaid in de reactie in de afwezigheid van een soort barrière 14. Daarentegen denaturatie van PrP c in het andere substraat bij pH 3,5 het geschikt maakt omgezet PrP res na incubatiemet PrP TSE van elke soort en dient als controle voor conversie. De verhouding van de omzetting van PrP c naar PrP res in pH 7.4 substraat ten opzichte van die van de pH 3,5 substraat een maat van de soort barrière. Wij hebben gevonden dat de CER test voorspelt bekende species barrières van laboratoriummuizen verschillende TSE en de assay gebruikt in pogingen om de soort dam van vele zoogdiersoorten, waaronder bighornschapen, chronische wasting disease (CWD) en andere TSE 14 voorspellen, 15. Onderzoekers geïnteresseerd in een tool waardoor een snelle screening van TSE soorten barrières of beoordeling van PrP C to-PrP-res conversie zal deze methodiek nuttig vindt.

```html
<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm Zirconium oxide beads</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Andere variëteiten van kralen zijn ook effectief</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td>Selecteer geschikte primaire en secundaire antilichamen voor immunoblot-detectie van PrPres uit soorten van belang</td></tr><tr><td>Bead homogenisator</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>Hoge snelheid met temperatuurregeling</td></tr><tr><td>Conische buizen</td><td>elke merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafje met katoenen punt</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn sonicator</td><td>Heat Systems-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is nu Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometrie softwareprogramma</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td><td>Andere programma's, zoals NIH ImageJ, werken ook</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end menger</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetra acetaatzuur</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Gevaarlijke chemische stof: irritatie van de ogen</td></tr><tr><td>Guanidinehydrochloride, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit, irritatie van de huid, irritatie van de ogen</td></tr><tr><td>Verwarmingsblok</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Gevaarlijke chemische stof: sterk zuur</td></tr><tr><td>Lithiumdodecylsulfaat monsterbuffer, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Gevaarlijke chemische stof: irritatie van de huid en ademhalingswegen, ernstige oogbeschadiging, ontvlambare vaste stof</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit, ontvlambare vloeistof</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>elke merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit, irritatie van de huid, oogbeschadiging</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Gevaarlijke chemische stof: irritatie van de huid, oogbeschadiging</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gelsysteem</td><td>Life Technologies</td><td>NuPAGE elektroforesesysteem</td><td>Andere SDS-PAGE-systemen werken ook</td></tr><tr><td>PCR-buisjes (lage binding)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Pistool homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyldifluoride membraan</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Gevaarlijke chemische stof: irritatie van de huid en ogen, respiratoire gevoeligheid, orgaantoxiciteit</td></tr><tr><td>Reductiemiddel voor SDS-PAGE-monsters, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit, irritatie van de huid, oogbeschadiging, ontvlambare vaste stof</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Gevaarlijke chemische stof; sterke base</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>diverse</td><td>Gebruik een spuitgrootte die geschikt is voor de volumes van het substraat die moeten worden gehomogeniseerd</td></tr><tr><td>Spuitnaalden</td><td>BD Biosciences</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (PCR-buisjesschudder)</td><td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Gevaarlijke chemische stof: irritatie van de huid, ogen en ademhalingswegen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Gevaarlijke chemische stof: acute toxiciteit, irritatie van de ogen</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>
```

het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie soort barrières met een<em&gt; in vitro</em&gt; prioneiwit conversie assay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies om interspecifieke overdracht van overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's, prionziekten) te begrijpen zijn uitdagend omdat ze doorgaans afhankelijk zijn van langdurige en dure in vivo uitdagingen bij dieren. Er zijn een aantal in vitro testen ontwikkeld om te helpen bij het meten van prion soorten barrières, waardoor het gebruik van dieren wordt verminderd en sneller resultaten worden verkregen dan bij dierproeven. Hier presenteren we het protocol voor een snel in vitro prion conversie test genaamd de conversie-efficiëntie verhouding (CER) test. Bij deze test wordt cellulair prion eiwit (PrPC) uit een niet-geïnfecteerde gastheer hersenen gedenatureerd bij zowel pH 7,4 als 3,5 om twee substraten te produceren. Wanneer het pH 7,4 substraat wordt geïncubeerd met TSE-agens, wordt de hoeveelheid PrPC die zich omzet in een proteinase K (PK)-resistente toestand gemoduleerd door de soorten barrière van de oorspronkelijke gastheer voor het TSE-agens. In tegenstelling, PrPC in het pH 3,5 substraat wordt verkeerd gevouwen door elke TSE-agens. Door de hoeveelheid PK-resistente prioneiwit in de twee substraten te vergelijken, kan een beoordeling van de soorten barrière van de gastheer worden gemaakt. We tonen aan dat de CER-test correct bekende prion soorten barrières voor laboratoriummuizen voorspelt en, als voorbeeld, tonen we enkele voorlopige resultaten die suggereren dat rode lynxen (Lynx rufus) mogelijk vatbaar zijn voor de ziekte van chronisch vermagering bij witte staartherten (Odocoileus virginianus).

Succesvol gebruik van de CER test is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van het substraat paren in omzettingsreacties. Daarom volgende procedures CER substraat paren bereiden, kwaliteitscontrole immunoblot worden uitgevoerd (figuur 2). Voor beide substraten assay 10-25 pl door immunoblotting. PrP C moet gemakkelijk detecteerbaar in elk substraat en PrP C niveaus moet ongeveer gelijk tussen de twee. Immunoreactiviteit zal voornamelijk zichtbaar boven 20 kDa, maar kleinere band...

Het meten van de barrière voor de overdracht van prionziekten tussen soorten is een uitdaging en omvat meestal dierproeven of biochemische analyses. Hier presenteren we een in vitro prion-eiwitconversietest met de mogelijkheid om soortenbarrières te voorspellen.

Het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie Soort Barrières met een<em&gt; In Vitro</em&gt; Prioneiwit Conversie Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Het algemene doel van deze procedure is om de soortbarrière van overdraagbare spongiforme encefalopathieën, bekend als TSE, voor een bepaalde soort te beoordelen zonder levende dieren te hoeven blootstellen. Dit wordt bereikt door eerst twee substraten voor conversie-assays voor te bereiden voor gebruik in een in vitro-assay. De tweede stap is om deze substraten te incuberen met de TSE-agentia die u vervolgens wilt testen.Na digestie met Proteinase K worden de monsters onderworpen aan SDS-PAGE en immunoblotting. De laatste stap is het meten van de hoeveelheid proteinase K-resistent PreOn-eiwit in elk substraat met behulp van doorstroomcytometrie en het vergelijken van deze hoeveelheden door de berekening van een conversie-efficiëntieratio of CER. Uiteindelijk biedt de CER een maat voor de soortbarrière van de geteste TSE voor de gastheersoort waarvan het substraat is bereid.De voordelen van deze assay zijn de lage kosten, de korte experimentele doorlooptijd en de vervanging van levende dieren door weefselmonsters. Hoewel deze methode zeer geschikt is voor het verkrijgen van inzicht in de soortbarrières bij prionziekten in wilde dieren, kan deze worden toegepast op elke andere relev

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we een nieuwe test voor het toezicht op prion opname en-handel door immuuncellen onmiddellijk na intraperitoneale inoculatie door het zuiveren en fluorescent etikettering geaggregeerde prion staven van geïnfecteerde hersenen materiaal dan het toezicht op hun opname en beweging van de injectieplaats en het karakteriseren van de cellen te bemiddelen deze gebeurtenissen.

Monitoring immuuncellen Trafficking TL-Prion Rods uur na intraperitoneale infectie

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Aaseters hebben potentieel om besmettelijke overdraagbare spongiforme encefalopathie prionen translokeren in hun uitwerpselen te ziektevrije gebieden. We detail methoden die worden gebruikt om te bepalen of de muis aangepast scrapie prionen infectieus blijven na passage al is het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke consument van dode dieren.

Procedures voor het identificeren van Besmettelijke Prions na passage door het spijsverteringsstelsel van een vogelsoort

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van een eenvoudige, snelle en efficiënte prion amplificatie techniek, de real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) methode.

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

Immunolabeling van abnormaal prioneiwit met behulp van immunohistochemieprotocollen vereist specifieke monster- en anti-PrP-antilichaamvoorbereidingsmethoden. Het huidige protocol beschrijft de belangrijkste stappen in epitoopontmaskering om te zorgen voor een goede PrP-immunolabeling en om niet-specifieke achtergrondkleuring te minimaliseren. Ook houdt deze benadering rekening met bioveiligheidsmaatregelen bij het uitvoeren van immunohistochemische studies met de prion-geïnfecteerde weefsels.

Detectie van abnormaal prioneiwit door immunohistochemie

Een methode om veelgebruikte gebieden in laboratoriumomgevingen te beoordelen op prionverontreiniging en effectieve ontsmetting ontbreekt. Het hier beschreven protocol biedt de belangrijkste basisprincipes voor het implementeren van een prionveiligheidstest in het laboratorium die eenvoudig kan worden aangepast aan de individuele behoeften van specifieke laboratoria.

Prion Veiligheid Laboratorium Swipe-test

We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

Leer een in vitro prion-eiwitconversie-assay om soortbarrières van overdraagbare spongiforme encefalopathieën te beoordelen zonder dierproeven. Deze methode berekent de conversie-efficiëntieratio voor risicobeoordeling.

Het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie Soort Barrières met een

Meer video's verkennen