Name: Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4 + CD45RB Hoog T cellen in immunodeficiënte muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer hoe je darmontsteking induceert bij muizen door adoptieve overdracht van CD4+ CD45RBhoge T-cellen naar immuundeficiënte ontvangers. Deze methode bootst inflammatoire darmziekten na.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse Gastroenterological Association (AGA) Onderzoek Scholars Award en de Crohn en Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (tot SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), en de Universiteit van North Carolina Centrum voor Gastro-intestinale Biologie en de ziekte van Grant P30 DK34987 (histologie Core). De UNC flowcytometrie Core Facility wordt gedeeltelijk ondersteund door een NCI Center Core ondersteuning Grant (P30CA016086) aan de UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Wij danken Luke B. Borst uit North Carolina State University College of Veterinary Medicine voor zijn hulp met histopathologische analyse en immunohistochemie.

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle dieren protocollen worden goedgekeurd door en in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) regelgeving en Gids van de National Research Council voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Donormuizen kan mannelijk of vrouwelijk zijn, maar de ontvanger muizen moet mannelijk zijn. Als vrouwelijke ontvangers worden gebruikt, moet de donor muizen vrouwelijke 5 zijn. Onderhouden kolonies met behulp van reguliere, niet-steriele beddengoed en niet-aangezuurd water, omdat deze de darmflora beïnvloeden, en dus de colitis fenotype van de muizen 5,6. 1. Experimentele Voorbereiding <ol><li> Gebruik ijskoude media en buffers. Blijf cellen op ijs gedurende het experiment. </li><li> Voeren het experiment in steriele biohazard kap met behulp van steriele techniek. </li></ol> 2. Isolatie van milt T-cellen <ol><li> Euthanaseren donor muis / muizen in CO 2 kamer gevolgd door cervicale dislocation. Spray buik met 70% ethanol. </li><li> Maak een horizontale snede in de buik en afpellen huid buikvlies bloot. Houd peritoneum uit de interne organen van de tang en een insnijding in de linker buik buikvlies bloot te leggen en uitsnijden van de milt. </li><li> Plaats de milt in 10 ml compleet medium in een petrischaal. Verwijderen en overtollige weefsel gooi uit de milt. </li><li> Gebruik 2 gesteriliseerde glazen dia&#39;s te verpletteren en plagen elkaar milt in single-celsuspensie. Filter celsuspensie door een 70 urn zeef in een 50 ml conische buis en spoel zeef met 5 ml compleet medium. Plaats tot 5 milt in een 50 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of door vacuüm zuigen in afvalcontainer. </li><li> Voorzichtig hersuspenderen cellen in 5 ml per milt lysisbuffer rode bloedcellen lyseren gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Voeg een gelijk volume compleet medium (5 ml per milt) op de buis. </li><li&gt; Centrifugeer cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of door vacuüm zuigen in afvalcontainer. </li><li> Voorzichtig resuspendeer cellen in 10 ml Labeling Buffer. </li><li> Tellen cellen door trypan blauw exclusie. <ol><li> Verwijder 20 ul van celsuspensie en toe te voegen aan 180 ul trypaanblauw een microfugebuis en meng. Na 5 min, voeg 10 ul gelabelde cellen hemocytometer tellen niet blauwe cellen onder de microscoop. Bepaal het totale aantal levensvatbare cellen. Gooi cel / trypaanblauw mix. </li></ol></li><li> Centrifugeer cellen in 10 ml Labeling Buffer bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of door vacuüm zuigen in afvalcontainer. </li></ol> 3. Verrijking van CD4 + T-cellen OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor specifieke producten die gebruikt worden in deze sectie. <ol><li> Voorzichtig resuspendeer cellen om een eencellige suspensie van 20 x 10 6 cellen / ml in koude Labeling Buffer. </li><li> Voeg 5 ul per 1 x 10 6 cellen van gebiotinyleerde CD4 T-cel verrijking antilichamen. Incubeer cellen op ijs gedurende 15 min. </li><li> Voeg 10x volume van Labeling Buffer. Centrifugeer cellen bij 450 x g gedurende 7 min. Zuig al het supernatant met behulp van vacuüm zuigen in afvalcontainer zorgvuldig. </li><li> Grondig vortex streptavidine-geconjugeerde magnetische deeltjes. Voeg 5 ul van deeltjes per 1 x 10 6 cellen. </li><li> Meng grondig, maar voorzichtig. Houd mengsel bij 6-12 ° C gedurende 30 min. </li><li> Voeg Labeling Buffer tot een concentratie van 20-80 x 10 6 cellen / ml. Transfer tot 1,0 ml gelabelde cellen per 12 x 75 mm rondbodem reageerbuis (hierna de &quot;positieve fractie tube&quot;). </li><li> Plaats elke positieve-fractie buis op magneet voor 6-8 min. </li><li> Met de positieve-fractie buizen nog steeds op de magneet, zorgvuldig supernatant overbrengen van positieve-fractie buis met glazen Pasteur pipet om een ​​nieuwe steriele 50 ml conische buis (Referred &quot;de verrijkte fractie&quot;). Deze verrijkte fractie bevat CD4 + T-cellen. Wees voorzichtig dat u de gelabelde cellen aangetrokken door de magneet te verstoren. </li><li> Resuspendeer cellen nog in de positieve fractie buizen dezelfde hoeveelheid Labeling buffer als in stap 3.6 op en neer te pipetteren krachtig. Plaats positieve-fractie buis terug op magneet voor 6-8 min. </li><li> Met positieve-fractie buizen nog steeds op de magneet, zorgvuldig overdragen supernatant (verrijkte fractie, CD4 +) van de positieve-fractie buis met glazen Pasteur pipet 50 ml steriel conische buis vanaf stap 3.8 zonder verstoring van de cellen verbonden aan de magneet. </li><li> Herhaal stap 3,9-3,10 de opbrengst van CD4 + T-cellen verkregen verhogen. Verder protocol met verrijkte fractie (CD4 + cellen). </li></ol> 4. Etikettering en sorteren Cellen 7 <ol><li> Centrifugeer verrijkte cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of vacuum Zuignap Houderion in de afvalcontainer. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml Labeling Buffer. Verwijder monster van cellen te tellen en te beoordelen voor levensvatbaarheid van de cellen door trypanblauwexclusie zoals in stap 2.9. </li><li> Voeg een volume van Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml; Als cellen zijn reeds &lt;10 x 10 6, centrifuge bij 450 xg gedurende 7 minuten, verwijder het supernatant door het gieten uit of vacuüm zuigen in afvalcontainer, en voeg volume van Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml. <ol><li> Het opzetten van aparte porties van ongeveer 5-10 x 10 5 cellen elk voor ongekleurd, isotype- gekleurd, en single-gekleurde controle cellen in microfugebuisjes. </li></ol></li><li> Voeg 5 ug / ml CD4-FITC en 1 ug / ml CD45RB-PE aan cellen. Voeg isotype controle vlekken en enkele vlekken op dezelfde concentratie monsters in microfugebuizen passende. Meng goed maar voorzichtig en incubeer op ijs beschermd tegen licht gedurende 30 min. </li><li> Voeg 10x volume van Labeling Buffer aan cellen en controles. Centrifugeer 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door afzuiging in afvalcontainer. </li><li> Resuspendeer in Labeling Buffer om het volume in stap 4.5. Centrifugeer 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door afzuiging in afvalcontainer. </li><li> Resuspendeer in Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml. Passeren cellen door 70 micrometer zeef in FACS buis. Houd op ijs beschermd tegen licht tot klaar voor FACS. </li><li> Opzetten en bepalen passende vergoeding aan de celsorteerder met ongekleurde cellen en single-gekleurd controles. </li><li> Uitsluiten levensvatbare cellen met forward en side-scatter venstertijd (Figuur 1A). Opgezet venstertijd voor CD4 + en CD45RB + cellen met isotype- gekleurd controles. Gate cellen op CD4 + populatie. </li><li> Sorteer CD4 + cellen in CD45RB hoog en CD45RB lage populaties met een eenvoudige histogram voor PE gekleurde cellen in buisjes met 2 ml compleet medium. De CD45RB hoog </sup&gt; populatie vertegenwoordigt de hoogste 40% van CD4 + CD45RB + cellen (CD45RB hoog), en de CD45RB lage bevolking is de laagste 20% van CD4 + CD45RB + cellen (CD45RB laag Figuur 1B). </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Figuur 1: Representatieve flowcytometrie stukken CD4 + CD45RB T cel populaties in FACS-analyse (A - C) CD4 FITC en PE CD45RB-gekleurde splenocyten van donor C57BL / 6 muizen werden gesorteerd door FACS in CD4 + CD45RB hoog en CD4 +. CD45RB lage T-cel populaties. (A) Doublet evenementen werden uitgesloten op de forward scatter plot. (B) lymfocyten werden gated in de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing plot. (C) CD4 + </sup&gt; T-cellen werden gated, en (D) CD4 + CD45RB + T-cellen werden op een PE versus Events histogram uitgezet. CD4 + CD45RB laag cellen werden beschouwd als de laagste 20% van CD45RB + cellen. CD4 + CD45RB high cellen werden gedefinieerd als de hoogste 40% van CD45RB + cellen. <ol start="11"><li> Voer een aliquot van elke celpopulatie op de FACS machine zuiverheid van de bevolking te schatten. </li><li> Centrifugeer gesorteerde cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Resuspendeer in 1 ml PBS. Verwijder monster van cellen te tellen en te beoordelen voor levensvatbaarheid van de cellen door trypanblauwexclusie zoals in stap 2.9. </li></ol> 5. Injectie van cellen in Ontvangers <ol><li> Resuspendeer gesorteerde cellen tot 4 x 10 6 cellen / ml (CD45RB- hoog) of 2 x 10 6 cellen / ml (CD45RB laag) in PBS. </li><li> Transfer 100 ul van CD45RB hoge cellen per ontvanger om nieuwe steriele buis. Voeg 100 ul van PBS perontvanger om deze buis. Zo totale injectie volume per dier is 200 pi, en de totale hoeveelheid cellen per ontvanger is 4 x 10 5 CD4 + CD45RB- hoge naïeve T-cellen. </li><li> Als de experimentele groep die regulatoire T cellen gewenst is, 100 ul van CD45RB hoge cellen per ontvanger om nieuwe steriele buis. Voeg 100 ul van CD45RB laag cellen per ontvanger aan dezelfde buis. Totale injectie volume per dier is 200 pl; verhouding van CD45RB hoog: CD45RB- laag cellen is 2: 1. </li><li> Injecteer 100 ui CD45RB hoog of CD45RB hoog / CD45RB lage CD4 + cellen intraperitoneaal in de rechter en linker zijde van de buik (totaal 200 pl) van elke ontvanger. </li></ol> 6. Toezicht op de progressie van de ziekte in Ontvanger Dieren <ol><li> De klinische toestand van de ontvangende dieren beoordelen toewijzen totale klinische scores voor de volgende parameters 8 op de dag van de injectie, daarna wekelijks, en op het moment van het offer: <ol><li> Bepaal verspillen door het meten van het gewichtsverlies: 0 - geen gewichtsverlies; 1 - 0,1-10% verlies van het oorspronkelijke lichaamsgewicht; 2 - meer dan 10% verlies van de oorspronkelijke lichaamsgewicht (figuur 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Figuur 2: Klinische en bruto pathologische tekenen van ontsteking optreden na overdracht van de wild-type CD4 + CD45RB- hoge T-cellen in RAG1 - / - en NRDKO ontvanger muizen 11 (A) NRDKO ontvangers verloren gemiddeld 10% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht door 5. weken na de overdracht, terwijl RAG1- / - Ontvangers geen klinische ziektesymptomen vertonen op dit moment. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde percentage oorspronkelijke lichaamsgewicht van de cohort ± SEM. **, P &lt;0.005. (B) Een aantal muizen ontwikkelden ernstige intestinale inflammatie, zoals blijkt uit de aanwezigheid van rectale prolaps. Dit is een representatief beeld van rectale prolaps in een NRDKO ontvangende muis. (C) In grote trekken, dubbele punten uit beide RAG1 - / - en NRDKO ontvanger muizen worden ingedikt en verkort in vergelijking met dubbele punten van RAG1 - / - en NRDKO muizen zonder T-cel adoptieve overdracht. Dubbele punten uit NRDKO ontvangende muizen ernstige ontsteking en verhoogde colon gewichten (gegevens niet getoond). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Bepaal de kwaliteit van de ontlasting door het plaatsen van dieren in een schone container, totdat het voorbij iskrukje: 0 - geen; 1 - zachte ontlasting; 2 - waterig en / of bloederige ontlasting. </li><li> Bepaal de algemene gezondheid van de dieren door de aanwezigheid van de volgende symptomen van de ziekte: 0 - geen gebogen houding, haren bont, of huidletsels; 1 - een van de volgende aanwezig: gebogen houding, haren bont, of huidletsels. </li><li> Bepaal aanwezigheid van rectale prolaps: 0 - afwezig; 1 - heden (Figuur 2B). </li></ol></li><li> Offeren dieren door CO 2 inademing, gevolgd door cervicale dislocatie als ze 20% van hun startpositie lichaamsgewicht hebben verloren of op gewenst tijdstip, wat het eerst komt. Klinische ziekte is meestal zichtbaar vanaf week 5 post-repletie. </li><li> Beoordelen voor ernst van de ziekte, zoals eerder beschreven 5,7. <ol><li> Wijs klinische scores als in stap 6.1 8. </li><li> Meet colon lengte en gewicht (Figuur 2C). </li><li> Voer histologische analyse van ontsteking5. </li><li> Bepaal spontane cytokine expressie in darmweefsel explantkweken 9, mesenteriale lymfeklieren 10 en / of 11 serum. <ol><li> Kortom, voor explantkweken 9, verwijder dubbele punten na offer, geopend in de lengte, en schoon met PBS. Incubeer zuilen op een orbitale schudder bij 250 rpm in compleet medium gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Hak weefsel in kleine stukjes en geïncubeerd bij 37 ° C in compleet medium gedurende 24 uur. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gebruik voor kwantificering van cytokines per 100 mg weefsel door ELISA. </li></ol></li><li> Voer ex vivo karakterisering van T cel fenotypes en / of functie 10. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H., Brant, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+genetics+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypically+distinct+subsets+of+CD4%2B+T+cells+induce+or+protect+from+chronic+intestinal+inflammation+in+C.+B-17+scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice.</a> Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).</li>
<li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis%3A+concepts%2C+considerations%2C+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).</li>
<li>Ma, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+habitat+change%3A+a+source+of+unrecognized+transient+alteration+of+intestinal+microbiota+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice.</a> PLoS One. 7 (10), e47416(2012).</li>
<li>Read, S., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+inflammatory+bowel+disease+in+immunodeficient+mice+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).</li>
<li>Maillard, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wiskott-Aldrich+syndrome+protein+is+required+for+the+function+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells.</a> J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).</li>
<li>Hegazi, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+ameliorates+chronic+murine+colitis+through+a+heme+oxygenase+1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway.</a> J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).</li>
<li>Kole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+regulate+effector+and+regulatory+T+cell+accumulation+and+anti-inflammatory+cytokine+production+during+T+cell-mediated+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis.</a> J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3-deficient+mice+develop+microbiota-dependent%2C+IL-12%2F23-driven+spontaneous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis.</a> J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).</li>
<li>Steinbach, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+PI3K+p110delta+Regulates+Th1%2FTh17+Development+and+Microbiota-Dependent+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis.</a> J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3+is+a+regulator+of+IL-12+p40+in+macrophages+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity.</a> J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).</li>
<li>Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease+in+C.B-17+scid+mice+reconstituted+with+the+CD45RBhigh+subset+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells.</a> Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).</li>
<li>Powrie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Th1+responses+prevents+inflammatory+bowel+disease+in+scid+mice+reconstituted+with+CD45RBhi+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4.</a> T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).</li>
<li>Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4+plays+an+essential+role+in+the+function+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+cells+that+control+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation.</a> J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).</li>
<li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+divergence+in+gastrointestinal+microbiota+in+physically-separated+genetically+identical+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice.</a> Sci Rep. 4, 5437(2014).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+differentiation+factor+88+%28MyD88%29+is+required+for+CD4%2B+T+cell+effector+function+in+a+murine+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease.</a> J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).</li>
<li>Kurtz, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+regulates+colitis+through+effects+on+lymphoid+and+nonlymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li>
<li>Ranatunga, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+role+for+human+IL-10-expressing+CD4%2B+T+cells+in+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis.</a> J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).</li>
<li>Srikrishna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylated+glycans+mediate+colitis+through+activation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa.</a> B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol inducerende darm ontsteking bij muizen door adoptieve overdracht van CD4 + CD45RB + T-cellen in immuun deficiënte muizen. We gebruikten C57BL / 6 donor milt en syngene RAG1 - / - ontvangende muizen, hoewel andere stammen (zoals BALB / c, 129S6 / SvEv, non-obese diabetische (NOD)) en genetische modellen van immunodeficiëntie (bijvoorbeeld SCID, RAG2 - / -) kan ook worden gebruikt 4,14-16.</...

De inflammatoire darmziekten (IBD) Crohn’s ziekte en colitis ulcerosa ontstaan door een niet volledig gedefinieerde en complexe interactie tussen gastheer immuunreacties, genetische vatbaarheid, omgevingsfactoren en de enterische luminale inhoud1. Recente genoombrede associatiestudies rapporteren associaties tussen immuuncel regulerende genen en IBD-gevoeligheid2,3. Zowel intrinsieke genen van aangeboren als adaptieve immuuncellen zijn vertegenwoordigd in deze studies, wat wijst op een centrale rol voor deze celpopulaties in IBD-pathogenese.
Er bestaan momenteel meer dan 50 diermodellen van menselijke IBD. Hoewel geen enkel model de menselijke IBD perfect fenokopyeert, zijn veel nuttig voor het bestuderen van verschillende aspecten van de menselijke ziekte, inclusief ziekte-onset en progressie en de wondgenezingsrespons. In de hier beschreven methode wordt intestinale ontsteking geïnitieerd met syngeneïsche splenische CD4+CD45RBhigh T-cel adoptieve overdracht in T- en B-cel-deficiënte ontvangermuizen4. De CD4+CD45RBhigh T-celpopulatie bevat voornamelijk naïeve T-cellen geprimed voor activering die in staat zijn om chronische ontsteking van de dunne darm en dikke darm te induceren. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om belangrijke experimentele variabelen te wijzigen, inclusief zowel aangeboren als adaptieve immuuncelpopulaties, om biologisch relevante vragen met betrekking tot ziekte-pathogenese te beantwoorden. Bovendien biedt deze methode een nauwkeurige initiatie van ziekte-onset en een goed gekarakteriseerd experimenteel tijdsverloop. Dit maakt de kinetische studie van klinische kenmerken van ziekteprogressie bij muizen mogelijk. Intestinale ontsteking geïnduceerd door deze methode vertoont veel kenmerken van menselijke IBD, inclusief chronische transmurale ontsteking van dikke en dunne darm, pathogenese aangedreven door cytokinen zoals TNF en IL-12, en systemische symptomen zoals vermagering5. Daarom is het een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van de pathogenese van menselijke IBD.
De methode hier beschrijft in detail het protocol voor het induceren van experimentele colitis door adoptieve overdracht van CD4+CD45RBhigh T-cellen in Rag1-/- muizen. We bespreken belangrijke technische stappen, verwachte resultaten, optimalisatie en probleemoplossing. We behandelen de vereiste elementen voor de succesvolle ontwikkeling van dit muismodel van intestinale ontsteking voor onderzoeksdoeleinden.

<table><tbody><tr><td>Naam van Reagens/Apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm rondbodembuis</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml kegelvormig</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml kegelvormig</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956;m Cel Zeef</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Volledig Media</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0,0004% &beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS buis + zeef</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Microscoopglazen</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmd ingeactiveerd FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Labeling Buffer</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis CD4 T-lymfocyt Verrijkingsset - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>Muis IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>Muis IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Was Media</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0,0004% &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

inductie van muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; hoog</sup&gt; t cellen in immunodeficiënte muizen

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Er zijn veel verschillende dierlijke modellen voor het bestuderen van de pathogenese van menselijke inflammatoire darmziekten (IBD), elk met zijn eigen voor- en nadelen. We beschrijven hier een experimentele colitis model dat wordt geïnitieerd door adoptieve overdracht van syngenetische milt CD4 + CD45RB- hoge T-cellen in de T- en B-cel deficiënte muizen ontvanger. De CD4 + CD45RB high T-celpopulatie die grotendeels uit naïeve effectorcellen kan induceren chronische darmontsteking, sterk lijken belangrijke aspecten van menselijke IBD. Deze methode kan worden gemanipuleerd om aspecten van de ziekte ontstaan ​​en de progressie bestuderen. Daarnaast kan het worden gebruikt om de functie van aangeboren, adaptief en regelgevende immuuncel populaties en de rol van milieurisico&#39;s, dwz de microbiota in intestinale inflammatie bestuderen. In dit artikel tonen we de methode voor het induceren van colitis met een stap-voor-stap protocol. Dit includes een video demonstratie van de belangrijkste technische aspecten die nodig zijn om succesvol te ontwikkelen dit muizenmodel van experimentele colitis voor onderzoeksdoeleinden.

Ongeveer 10 x 10 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen van 10 milt van volwassen C57BL / 6 donormuizen zijn betrouwbaar geïsoleerd. Dit aantal zal variëren afhankelijk van de leeftijd en het type van de donor muis en de vaardigheid van de onderzoeker. Wanneer 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen worden overgebracht naar C57BL / 6 RAG1 - / - ontvanger muizen, klinische ziekteverschijnselen ontstaan ​​rond week 5 post-repletie of eerde...

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Het algemene doel van deze procedure is het opwekken van darmontsteking door de adoptieve overdracht van naïeve T-cellen in immuundeficiënte muizen. Dit wordt bereikt door eerst cellen uit milten van muizen te isoleren, de bloedcellen te lyseren en vervolgens de populatie te verrijken met CD4-positieve T-cellen. De tweede stap bestaat uit het labelen van deze cellen met fluorescent DI-geconjugeerde CD4- en CD45RB-antilichamen.Vervolgens worden de gelabelde cellen met behulp van FACS gesorteerd in CD 45, RB laag en CD 45 RB hoog populaties. De laatste stap is het overbrengen van de CD 45 RB hoog cellen naar immuundeficiënte muizen via intraperitoneale injectie. Uiteindelijk worden de overgebrachte cellen geactiveerd en veroorzaken zij lokale weefselschade bij afwezigheid van T-regulerende cellen, wat resulteert in experimentele colitis.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar inflammatoire darmziekten, zoals de rol van specifieke celpopulaties en het gastro-intestinale microbiota bij de pathogenese van de ziekte. Bespuit na het euthanaseren van de donormuis de buik met 70%ethanol om het gebied te steriliseren. Maak vervolgens een horizontale

induction-murine-intestinal-inflammation-adoptive-transfer-effector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

De interactie van genetische gevoeligheid, mucosale immuniteit en intestinale micro-ecologische omgeving is betrokken bij de pathogenese van inflammatoire darmziekte (IBD). In deze studie pasten we fecale microbiota-transplantatie toe op IL-10-deficiënte muizen en onderzochten we de impact ervan op darmontsteking en hartfunctie.

Therapeutische evaluatie van fecale microbiotatransplantatie in een interleukine 10-deficiënt muismodel

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Hier rapporteren we een protocol dat een muismodel voor reumatoïde artritis (RA) tot stand brengt door adoptieve overdracht van CD4+ T-cellen van SKG-muizen, wat een snel en betrouwbaar experimenteel hulpmiddel biedt voor het onderzoeken van de immunologische mechanismen, pathologische progressie en ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor RA.

Een adoptief overdrachtsmodel van reumatoïde artritis bij muizen

Leer hoe je darmontsteking induceert bij muizen door adoptieve overdracht van CD4+ CD45RBhoge T-cellen naar immuundeficiënte ontvangers. Deze methode bootst inflammatoire darmziekten na.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4 + CD45RB Hoog T cellen in immunodeficiënte muizen (Video) | JoVE Journal

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4

Meer video's verkennen