Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4 + CD45RB Hoog T cellen in immunodeficiënte muizen
21 april 2015
Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om darmontsteking te induceren door de adoptieve overdracht van naïeve T-cellen naar immuungecompromitteerde muizen. Dit wordt bereikt door eerst cellen uit muizenmilten te isoleren, de bloedcellen te lyseren en vervolgens de populatie te verrijken met CD vier positieve T-cellen. De tweede stap is om deze cellen te labelen met fluorescente DI-geconjugeerde CD vier en CD 45 RB-antilichamen.
Vervolgens worden de gelabelde cellen gesorteerd met behulp van FACS naar CD 45 RB lage en CD 45 RB hoge populaties. De laatste stap is om de CD 45 RB hoge cellen over te brengen naar immuungecompromitteerde muizen door middel van intraperitoneale injectie. Uiteindelijk worden de overgebrachte cellen geactiveerd en veroorzaken ze lokaal weefselschade bij afwezigheid van T-regulatorcellen, wat resulteert in experimentele colitis.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de studie van inflammatoire darmziekten, zoals de rol van specifieke celpopulaties en de gastro-intestinale microbiota in ziektepathogenese. Na het euthanaseren van de donormuis, besproeit u de buik met 70% ethanol om het gebied te steriliseren. Maak vervolgens een horizontale incisie over de buik en pel de huid terug om het peritoneum bloot te leggen met behulp van forceps.
Houd het peritoneum uit de buurt van de inwendige organen en maak een incisie in het linkerbuikperitoneum. Vervolgens verwijdert u de milt van de muis en plaatst u deze in een petrischaaltje met 10 milliliter ijskoudig compleet medium. Plet de milt met twee steriele glazen platen om een enkele celsuspensie te maken.
Filter de cellen door een 70 micron zeef in een 50 milliliter conische buis en spoel vervolgens de zeef met vijf milliliter compleet medium. Spoel tot vijf milten in één conische buis. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 450 keer G gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius. Zuig de supernatant op in een afvalinaire en resuspendeer de cellen vervolgens voorzichtig in 10 milliliter ijskoudig labelbuffer.
Combineer 20 microliters van de celsuspensie met 180 microliters van een 0,4% trianblauw oplossing en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 microliters van de celsuspensie toe aan een hemo cytometer en tel het aantal niet-blauwe cellen onder de microscoop om te beginnen met de verrijking van de pellet en resuspendeer de cellen voorzichtig in ijskoudig labelbuffer met een concentratie van 20 keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Voeg vijf microliters gebiotineerde CD vier T-cel verrijkingsantilichaam toe per een keer 10 tot de zes cellen, en incubeer vervolgens de cellen op ijs met het antilichaam gedurende 15 minuten.
Voeg tien keer het volume labelbuffer toe aan de celsuspensie en centrifugeer vervolgens de cellen bij 450 keer G gedurende zeven minuten. Zuig voorzichtig het supernatant op zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de streptavidine-geconjugeerde magnetische deeltjes door ze te vortexen en voeg vijf microliters deeltjes toe per een keer 10 tot de zes cellen aan de cellen.
Meng de deeltjes met de cellen door voorzichtig te schudden en incubeer vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten bij zes tot 12 graden Celsius. Resuspendeer de cellen tot een concentratie van 20 tot 80 keer 10 tot de zes cellen per milliliter met labelbuffer. Breng vervolgens één milliliter van de gelabelde cellen over in een 12 millimeter bij 75 millimeter ronde bodem testbuis en plaats deze positieve fractiebuis gedurende zes tot acht minuten op een magneet.
Met de buis op de magneet, verwijder voorzichtig het supernatant met een glazen pasteurpipet zonder de gelabelde cellen te verstoren en breng het over in een nieuwe steriele 50 milliliter conische buis. Deze fractie bevat de CD vier positieve T-cellen. Verwijder de positieve fractiebuis van de magneet en resuspendeer de cellen in labelbuffer door krachtig te pipetten.
Breng de buis terug naar de magneet voor nog eens zes tot acht minuten. Breng opnieuw voorzichtig het supernatant over naar de verrijkte fractiebuis. Verhoog de opbrengst van CD vier positieve T-cellen door de verrijking zo nodig te herhalen om de cellen voor te bereiden op labelen. Centrifugeer eerst de verrijkte fractie bij 450 keer G gedurende zeven minuten en gooi het supernatant weg.
Resuspendeer vervolgens de cellen in labelbuffer tot een concentratie van 10 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Deel vijf keer 10 van de vijfde cellen in afzonderlijke micro centrifugebuisjes voor ongekleurde isotoopgekleurde en enkelgekleurde controlecellen. Voeg vervolgens vijf microgram per milliliter CD vier, FE en één microgram per milliliter CD 45 RB PE-antilichamen toe aan de buis met de oorspronkelijke celsuspensie.
Voeg de isotoopcontrolekleuren en de enkele kleuren toe in dezelfde concentratie aan de juiste celaliquots. Meng voorzichtig de cellen met de antilichamen en incubeer vervolgens de buizen op ijs gedurende 30 minuten. Bedek de buizen om ze tegen licht te beschermen.
Was vervolgens de cellen twee keer in labelbuffer zoals aangegeven in het tekstprotocol en resuspendeer de cellen op 10 keer 10 van de zesde cellen per milliliter in labelbuffer. Breng vervolgens de celsuspensie door een 70 micron zeef in een faxbuis. Plaats de buis op ijs en dek hem af om fotobleking van de kleuren te voorkomen.
Gebruik de ongekleurde en enkelgekleurde controlecellen om de compensatie op de celsorteerder te kalibreren. Sluit niet-levensvatbare cellen uit met behulp van forward en side scattered gating. En stel vervolgens de gating in voor CD vier positieve en CD vier RB positieve cellen met de isotoopgekleurde controles.
Gat vervolgens de CD vier positieve populatie en sorteer de cellen vervolgens in CD 45, RB hoge en CD 45 RB lage populaties. Verzamel de cellen in buizen met twee milliliter compleet medium en voer vervolgens een aliquot van ongeveer 10 keer 10 tot de derde cellen van elke fractie af op de celsorteerder om de steekproefzuiverheid
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de inductie van colitische ontsteking bij muizen via de adoptieve transfer van syngene CD4 + CD45RB high T-cellen naar T- en B-cel-deficiënte ontvangers. De resulterende klinische en histopathologische kenmerken vertonen een sterke gelijkenis met menselijke inflammatoire darmziekten, waardoor de initiatie van colitische ontsteking en de progressie van de ziekte kunnen worden bestudeerd.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Inflammatoire darmziekte
- Muismodellen
Achtergrond
- Colonontsteking is een kenmerkend aspect van inflammatoire darmziekten.
- Inzicht in de mechanismen achter ontsteking kan helpen bij de ontwikkeling van behandelingen.
- Adoptieve transfermodellen zijn nuttig voor het bestuderen van immuunresponsen.
- Deze methode maakt het mogelijk om het gedrag van T-cellen in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar model vast te stellen voor het bestuderen van colontische ontsteking.
- Om menselijke inflammatoire darmziekten in muizen na te bootsen.
- Om de rol van CD4 + T-cellen in de initiatie en progressie van colontische ontsteking te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van miltcellen uit muizen.
- Lysis van bloedcellen om CD4-positieve T-cellen te verrijken.
- Labeling van cellen met fluorescerende antilichamen voor sortering.
- Overdracht van CD45RB-high cellen naar immunodeficiënte muizen via intraperitoneale injectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van colitis bij ontvanger-muizen.
- Activatie van overgedragen T-cellen leidend tot lokale weefselschade.
- Ontwikkeling van klinische en histopathologische kenmerken vergelijkbaar met menselijke ziekten.
- De afwezigheid van regulatoire T-cellen draagt bij aan de ernst van de ontsteking.
Conclusies
- Dit model biedt inzicht in de mechanismen van colontische ontsteking.
- Het kan worden gebruikt om potentiële therapeutische interventies te testen.
- Verdere studies kunnen de rol van verschillende T-cel-subsets bij ontsteking onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit muismodel voor colitis maakt mechanistische analyse van T-cel-gestuurde intestinale ontsteking mogelijk, wat targetvalidatie in ontdekkingsprogramma's gericht op immunologie ondersteunt. Door belangrijke histopathologische en klinische kenmerken van humane IBD na te bootsen, biedt het een ziekte-relevant systeem voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen voorafgaand aan de leadidentificatie. Het model faciliteert de beoordeling van bijdragen van aangeboren, adaptieve en regulatoire immuuncellen, waardoor het voorspellende vertrouwen bij de preklinische selectie van targets wordt verhoogd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van effector CD4+ T-cel subsets bij het stimuleren van intestinale pathologie.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem om pathogene T-celpopulaties te isoleren en te karakteriseren.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het onderzoek naar deficiëntie van regulatoire T-cellen als mechanisme voor inflammatoire derepressie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare ontstekingsparameters, waaronder colonlengte, gewicht en histopathologische scoring.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor celisolatie en -overdracht ondersteunen de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende laboratoria.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt evaluatie mogelijk van microbiota en omgevingsmodificatoren in ziektepenetrantie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert chronische intestinale ontsteking met epitheliale hyperplasie en cryptabcessen die relevant zijn voor humane IBD.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van ziekteprogressie mogelijk via klinische parameters en weefselanalyse.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert het testen van immunomodulerende interventies in een T-cel-afhankelijke ontstekingcontext.
Integratie van pipeline en workflow
Het model integreert in discovery-workflows door een biologisch gevalideerd systeem te bieden voor hypothesetesten binnen target-gebieden in de immunologie en gastroenterologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanische risicoreductie van T-cel-gemedieerde paden bij intestinale inflammatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten voor de evaluatie van verbindingen of genetische perturbaties.
- Analytics: Maakt histopathologische en fenotypische scoring mogelijk om de ernst van de inflammatie tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt immuunceltransfer met pathologie op weefselniveau met relevantie voor humane IBD-fenotypen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van immuuncelfuncties bij inflammatie van barrièreweefsel.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in ontstekingsmodellen aangestuurd door T-cellen.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbare, gestandaardiseerde aanpak om colitis te induceren bij immuundeficiënte gastheren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door target engagement te valideren in een pathofysiologisch relevante context.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van het potentieel voor ziektemodificatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in murine celisolatie, antilichaamlabeling en flowcytometrie-sortering.
- Afhankelijk van toegang tot immunodeficiënte muizenstammen en een steriele celkweekinfrastructuur.
- Necessiteert gestandaardiseerde protocollen voor celverrijking en validatie van CD45RBhigh-zuiverheid.
- Omvat bioveiligheidsoverwegingen voor intraperitonele celinjectie en het hanteren van muizen.
- Beperkt tot het bestuderen van T-cel-afhankelijke ontsteking; modelleert mogelijk geen IBD-subtypes die uitsluitend door aangeboren immuniteit worden aangestuurd.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Isolation of Splenic T Cells from Donor Mice
2:41
Enrichment of CD4+ T Cells
4:34
Labeling and Sorting the CD4+ T Cells
6:31
Injection of Cells into Recipient Mice and Monitoring of Disease Progression
7:22
Results: Colitis Progression After Adoptive T Cell Transfer into Recipient Mice
8:15
Conclusion
