Name: Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer ex utero-elektroporatie en organotypische slicecultuur van muizenhippocampusweefsel om genregulatie tijdens hersenontwikkeling te bestuderen. Deze methode maakt manipulatie en volgen van enkele cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft aan SB (BR-2215; SFB 497/A9).

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wet worden uitgevoerd en werden goedgekeurd door de regering kantoren in Tübingen. 1. Bereiding van Micropipetten, oplossingen en Membranen <ol><li> Bereiding van Micropipetten <ol><li> Trek glas micropipetten met behulp van een micropipet trekker met het volgende programma: Hitte: 540, Pull: 125, Snelheid: 20 en Vertraging: 140. De naald lengte bedraagt ​​5,5 cm. </li><li> Bevel naalden met behulp van een microgrinder om een ​​geschikte tip grootte van 4 mm te verkrijgen. Bewaar de naalden in een doos of 15 cm petrischaal beschadiging van de uiteinden te voorkomen. </li></ol></li><li> Voorbereiding van Solutions <ol><li> Plasmide DNA Solution <ol><li> Bereid plasmide DNA dat het gewenste cDNA construct middels endotoxine vrij Maxi-prep kit volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Pas plasmide-DNA-oplossing tot een eindconcentratie van 3 ug / ul (zonder GFP spike vector) of 4 ug /pl (bij 1 ug GFP aar vector) in endotoxine vrij Tris-EDTA-buffer die snel groen (eindconcentratie 0,05%). </li></ol></li><li> Laminin Stock oplossing <ol><li> Los 1 mg laminine in steriel water tot een eindvolume van 1 ml. Bereid 100 ul aliquots en bewaar bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-Lysine voorraadoplossing <ol><li> Los 50 mg van poly-L-lysine in 50 ml steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Bereiden 1 ml porties en bewaar in -20 ° C. </li></ol></li><li> Voltooien Hank&#39;s Balanced Salt Solution (Complete HBSS) <ol><li> Bereid Compleet HBSS door het combineren van 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES buffer (pH 7.4), 30 ml 1 M D-glucose, 10 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100 mM MgSO4 en 4 ml 1 M NaHCO3. Voeg steriel water tot 1 l en bewaar bij 4 ° C. OPMERKING: Autoclaaf alle oplossingen verwachten 1 M HEPES buffer en 1 M D-glucose, die fil zijnter gesteriliseerd. </li></ol></li><li> Slice Cultuur Medium <ol><li> Bereid slice kweekmedium door toevoeging van 35 ml basismedium Eagle 12,9 ml compleet HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-glucose, 250 ul 200 mM L-glutamine, en 500 pl van penicilline-streptomycine op verkrijgen van een eindvolume van 50 ml. Voeg paardenserum tot een eindconcentratie van 5% en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Lage smeltpunt (LMP) Agarose <ol><li> Bereid een 4% LMP agarose door toevoeging van 2 g LMP agarose 50 ml compleet HBSS (1.2.4), gevolgd door verwarmen in een magnetron gedurende 1-2 minuten bij een hoog vermogen. Bewaar deze oplossing in een waterbad bij 37-39 ° C. Bewaar de oplossing bij 4 ° C en hergebruik. </li></ol></li><li> Paraformaldehyde Solution <ol><li> In een zuurkast stelt een 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 4 g paraformaldehyde 100 ml 1x PBS. Verwarm de oplossing tot 60 ° C en enkele druppels van 1 N NaOH totdat de oplossing clear. </li></ol></li><li> Permeabilisatie Solution <ol><li> Oplossen in 300 ml 1X PBS dat 0,3% Triton X-100 en bewaar bij 4 ° C 9 g BSA. Voeg 10% natriumazide voor lange termijn opslag. </li></ol></li></ol></li><li> Coating van Membraan Inserts <ol><li> Verdun een aliquot van laminine stamoplossing (1.2.2) en een aliquot van poly-L-lysine voorraadoplossing (1.2.3) in steriel water tot een eindvolume van 12 ml. </li><li> Plaats membraan inserts in 6 well platen met elk putje dat 2 ml steriel water. Voeg 1 ml bekledingsoplossing bovenop het membraan en geïncubeerd O / N bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Na incubatie was de membraan inserts driemaal met 1 ml steriel water en droog. Gebruik gecoat membraan inserts op dezelfde dag of bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier weken in een droge plaat met 6 putjes. </li></ol></li></ol> 2. DNA-injectie en elektroporatie van E15.5 en E18.5 embryo <ol><li&gt; Verdoven tijd bevruchte muis door het in een verlamming kamer verzadigd met 5% isofluraan en verbonden met een verdamper. Circuleren isofluraan en zuurstof met een snelheid van 1 l / min. Houd het dier in de box voor 2-4 minuten of totdat onbewuste die wordt getest door knijpen tussen de poten van de muis. </li><li> Euthanaseren het onbewuste muis door cervicale dislocatie op embryonale dag (E) 15.5 of 18.5. Prepareer de baarmoeder met de embryo&#39;s 13 en plaats deze in een petrischaal met 15-20 ml koud volledig HBSS. LET OP: Vanaf dit punt, houdt de embryo&#39;s en weefsels op ijs. </li><li> Gebruik een schaar om elk embryo uit de baarmoeder hoorn en plaats te scheiden in een tweede petrischaal met koud compleet HBSS. </li><li> Onder een stereomicroscoop, scheiden de baarmoeder spierwand en de placenta met een paar fijne pincet (# 55) en schaar. Zorgvuldig het embryo uit de dooierzak los. </li><li> Gebruik een paar van Bonn schaar om decapitate het embryo boven de voorpoten bij een hoek van 60 °. Als het experiment vereist genotypering van de embryo&#39;s, het verzamelen van een weefselmonster voor genomische DNA-isolatie (een klein stukje van de staart). </li><li> Breng het hoofd naar een schone en droge petrischaal. Omdat de kop werd onthoofd in een hoek van 60 °, moet het hoofd opzij kantelen wanneer geplaatst dorsale zijde naar boven. </li><li> Plaats een naald voorzichtig in het midden van de halve bol nabij de bregma (Figuur 1A, B). Injecteer ongeveer 2-3 ul (3 of 4 ug / ul) van DNA oplossing voet op het pedaal van de picospritzer III toepassing van 30 kilo druk gedurende de duur van 10-15 msec per puls aanbrengen 5-8 pulsen. De duur en het aantal pulsen afhankelijk van de diameter van de naald opening met kleinere openingen meer tijd nodig. Het interval tussen elke puls bedraagt ​​1 sec. </li><li> Voor het plaatsen van de elektroden, enkele druppels volledig HBSS op het hoofd van de embryo. Plaats de elektroden zodanig dat de &quot;negatieve&quot; terminal aan dezelfde kant als het geïnjecteerde ventrikel en de &quot;positieve&quot; elektrode aan de tegenoverliggende zijde van de geïnjecteerde ventrikel onder het oor van het hoofd van de embryo&#39;s (Figuur 1C, D). Solliciteer 5 pulsen van 50 V. <ol><li> Gebruik 3 mm elektroden voor E 15,5 en 5 mm elektroden voor E 18,5. </li></ol></li></ol> 3. Dissectie van de hersenen <ol><li> Na de elektroporatie, loslaten van de huid van het hoofd met behulp van een paar fijne pincet. Met een paar veer schaar een kleine incisie in het midden van het cerebellum op de middenlijn van de schedel. </li><li> Plaats de veer schaar in de incisie en snijd in de lengte langs de pijlnaad. Schil van de schedel en verwijder de hersenen uit de schedel door het gebruik van fijne pincet. Breng de hele brein in 15-20 ml koud volledige HBSS oplossing. </li><li> Ondertussen giet 4% LMP agarose,bij 37-39 ° C bewaard in een waterbad, in een peel-away schimmel. </li><li> Neem de hersenen uit de volledige HBSS door een klein bolletje spatel en afvoer van overtollig HBSS met behulp van fijne papieren zakdoekje of Kimwipes. </li><li> Plaats het hele brein voorzichtig in de agarose en zijn positie met een fijne naald aan te passen. Houd de mal op ijs tot de agarose is gestold en het blok is verdeeld (voor coronale secties de olfactorische bollen omhoog wijzen). </li></ol> 4. Vibratome Sectioning en Slice Cultuur <ol><li> Trim de LMP agarose blokken en lijm ze met het model podium met behulp van &#39;super lijm&#39;. Nadat de lijm is droog overdracht het monster etappe naar de buffer lade van de vibratome en vul met ijskoud voltooien HBSS totdat het blok wordt ondergedompeld in de oplossing. OPMERKING: Steriliseer alle instrumenten en apparatuur oppervlakken met 70% ethanol voor het snijden. </li><li> Bereid 250 micrometer dik vibratoomcoupes behulp van een nieuw blad zoals gevolgd. <ol><li> Trim het blok wiste de volgende instellingen; frequentie - 60 Hz, amplitude - 0,7 micrometer, snelheid 16-18 mm / sec. Snijd de gedeelten met het gewenste weefsel met bovenstaande hier op lage snelheid (9 mm / sec). Vanaf het snijden van de achterhersenen, het verzamelen van 5-7 secties van de grote hersenen. </li><li> Breng de sectie om een schone 6 putjes schotel met 5 ml ijskoud compleet HBSS met behulp van een gebogen spatel en op ijs bewaren totdat alle secties verzameld (figuur 1E). </li></ol></li><li> Bevochtig de membraan in een kruis wijze met 100 pl volledig HBSS alvorens de onderdelen over de membraan, de oriëntatie van de delen te vergemakkelijken. </li><li> Breng de secties met behulp van een gebogen spatel op het membraan (pick-up een hoek van de sectie met een pincet en trek op de spatel en vervolgens met de tang om de sectie te duwen op het membraan). Plaats maximaal vijf secties op een membraan en regelen met behulp van een pincet (Figuur 1F). Niet overlappen de secties met elkaar. <ol><li> Neem het overtollige van HBSS uit het membraan met behulp van een pipet. De specifieke membranen hier gebruikt zijn bevestigd aan een frame en ingebracht in het weefsel kweekplaat, waardoor het weefsel in contact, maar niet in het medium. </li></ol></li><li> Plaats het membraan inserts in een 6-wells plaat met 1,8 ml slice kweekmedium (1.2.5) (figuur 1 G, H). Incubeer de kweekschaal bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 11 DIV of 14 DIV. Wijzig de helft van het medium (0,9 ml) om de dag. Opmerking: In dit stadium reagentia wil toevoegen Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 uM eindconcentratie) etikettering prolifererende cellen aan de media voor de eerste 20 uur van de kweekperiode. </li></ol> 5. Bevestiging van de secties Gevolgd door immunofluorescentiekleuring <ol><li> Gebruik een schone en scherpe scalpel te snijden en trimmen van de membranen, afhankelijk van de oriëntatie vande secties. </li><li> Breng de delen samen met het membraan van een 24 wells plaat met 1 ml 4% PFA (1.2.7). Incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met 1x PBS gedurende 15 minuten elk. Incubeer de secties O / N met permeabilisatie oplossing bij 4 ° C onder zacht schudden. </li><li> De volgende dag, incubeer de gedeelten met geschikte primaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing, O / N of gedurende 48 uur bij 4 ° C onder zacht schudden. </li><li> Was de secties 3 keer voor 15 minuten met 1x PBS en incubeer O / N bij 4 ° C met de juiste secundaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing. </li><li> Na de incubatie met secundaire antilichamen, was de secties eenmaal met 1x PBS gedurende 15 minuten gevolgd door DAPI kleuring gedurende 10 min. </li><li> Was de secties 3 keer met 1x PBS gedurende 15 minuten elk en over te dragen aan dia microscoop. Voeg ImmunoMount en voorzichtig plaats een dekglaasje op de top van de secties. Droog de glaasjes aan O / N bij 4 ° C en seal met nagellak. OPMERKING: Houd de dia&#39;s altijd bij 4 ° C. <ol><li> Analyseer de slice culturen door confocale microscopie (Figuur 1I). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
<li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hippocampus is een belangrijke functie bij het leren en het geheugen. De dentate gyrus is één van twee hersengebieden waar neurogenese treedt niet alleen tijdens de ontwikkeling, maar ook op volwassen leeftijd. Postnatale en volwassen hippocampale neurogenese verloopt op soortgelijke wijze waarbij veel gemeenschappelijke kenmerken. Het definiëren van de regulerende mechanismen van deze factoren zal zeer nuttig zijn bij het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten, die op zijn beurt zal leiden tot nieuwe therapieën en...

De hippocampus speelt een belangrijke rol in het geheugen en het leren evenals emotioneel gedrag. Een hoofdfunctie bestaat uit de consolidatie van kortetermijngeheugen in lange termijn geheugen, die een hoge plasticiteit van het zenuwstelsel vereist. De dentate gyrus van de hippocampus treedt op als eerste gateway voor ingangsinformatie en is één van twee hersengebieden met voortdurende neurogenese volwassen leeftijd 1,2. De ontwikkeling van de hippocampus constructie optreedt tijdens de late embryogenese en vooral tijdens de eerste 3-4 weken postnatale 3. Tijdens de vroege ontwikkeling van de gyrus dentatus een stamcel zwembad gevestigd is, is vereist voor postnatale evenals volwassen neurogenese 4. Het ontwikkelen van neuronen passeren verschillende stadia, van de stamcel door verschillende stadia van voorlopercellen naar het onvolwassen en tenslotte de volwassen neuron tijdens postnatale evenals volwassen neurogenese. In verschillende stadia van de expressie van neurogenesespecifieke genen is vereist om de rijping en integratie van nieuwe neuronen in de hippocampus circuits 5,6 toe. Met muisgenetica en fenotype analyse met immunohistochemie en moleculaire methoden toegestaan ​​definieert het expressiepatroon en functie van vele van deze genen. Daarnaast microarray analyse als chromatine immunoprecipitatie (chip) verstrekt informatie over mogelijke directe en indirecte targetgenen 7,8. Echter, er zijn nog veel open vragen met betrekking tot de regulerende mechanismen van de hippocampus ontwikkeling, met name de ontwikkeling van de dentate gyrus. Om verder inzicht hoe specifieke genen worden gereguleerd een systeem nodig waarmee de manipulatie van een klein aantal cellen krijgen door neerwaartse of opwaartse regulatie van het gen van interesse en / of de doelwitgenen en volgen hun lot tijdens de ontwikkeling. In utero elektroporatie van shRNAs, cDNA van genen van belang of Cre recombinase biedt een dergelijk instrument. Om de aanwezigheid van het gewenste DNA of kleine RNA expressie plasmiden worden gebruikt voor elektroporatie waarborgen. Deze benadering is zeer succesvol geïmplementeerd bestuderen Corticale 9,10, maar is moeilijker benadering waarin de ontwikkeling van de dentate gyrus door de positie van de hippocampale structuren in diepere lagen hersenen. Ex utero elektroporatie gevolgd door organotypische slice cultuur is een aanpak van dit probleem 11,12 omzeilen. In tegenstelling tot in de baarmoeder elektroporatie niet het hele embryo, maar alleen het hoofd wordt gebruikt waardoor dus de elektroden te plaatsen in een gunstiger manier om direct de shRNA / DNA in de richting van de hippocampus en dentate gyrus. Onze groep succes toegepast ex utero elektroporatie om de rol van de transcriptiefactor Bcl11b bestuderen tijdens dentate gyrus ontwikkeling 8. Bcl11b heeft een dubbele rol in de gyrus dentatus ontwikkeling door regulating voorlopercellen celproliferatie evenals differentiatie zoals werd aangetoond door immunohistochemie. Een mechanisme voor Bcl11b betrokkenheid bij deze processen verder te definiëren, werden protocollen van de Polleux groep 11,12 aangepast aan de dentate gyrus zoals hieronder beschreven in de paragraaf protocol bestuderen. In een eerste benadering werd de vraag aan bod of Bcl11b is het reguleren van neuronale celdifferentiatie cel autonoom. Een tweede benadering onderzocht of Desmoplakine een direct doelwit gen Bcl11b, is voldoende om de Bcl11b fenotype te redden.

<table><tbody><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fine Glass Pipettes</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japan</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic Bracket unit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetizing Chamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>3 mm electrodes for E15.5</td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>5 mm electrodes for E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero electroporatie en organotypische slice cultuur van de muis hippocampus tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Muisgenetica biedt een krachtig hulpmiddel om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling te bepalen. Het analyseren van de resulterende fenotypes door immunohistochemische en moleculaire methoden levert informatie op over potentiële doelgenen en signaalroutes. Om specifieke regulerende mechanismen verder te verduidelijken, is een systeem nodig dat de manipulatie van slechts een klein aantal cellen van een specifiek weefsel mogelijk maakt door middel van overexpressie, ablatie of herintroductie van specifieke genen en het volgen van hun lot tijdens de ontwikkeling. Om dit te bereiken, biedt ex utero elektroporatie van hippocampale structuren, met name de dentate gyrus, gevolgd door organotypische plakcultuur, een dergelijk hulpmiddel. Het gebruik van dit systeem om mozaïekdeletiën te genereren, maakt het mogelijk om te bepalen of het gen van belang celautonoom ontwikkelingsprocessen reguleert, zoals proliferatie van voorlopercellen of neuronale differentiatie. Bovendien vergemakkelijkt het het redden van fenotypes door de herintroductie van het verwijderde gen of zijn doelgenen. In tegenstelling tot in utero elektroporatie verbetert de ex utero benadering de snelheid van succesvol targeten van diepere hersenlagen zoals de dentate gyrus. Over het algemeen bieden ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur een krachtig hulpmiddel om regulerende mechanismen te bestuderen in een semi-natuurlijke omgeving die endogene omstandigheden weerspiegelt.

Ablatie van de transcriptiefactor Bcl11b veroorzaakt aantasting van voorlopercellen celproliferatie en neuronale differentiatie hetgeen afbreuk dentate gyrus grootte en aantal cellen. Verder mutant neuronen niet te integreren in de hippocampus circuits waardoor leren en geheugen impairment 8. Om vragen over de regulerende mechanisme (s) van Bcl11b in deze processen ex utero elektroporatie werd tewerkgesteld beantwoorden. Het aanpakken van de vraag of Bcl11b cel-autonoom r...

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Het algemene doel van deze procedure is om individuele cellen van de gyrus dentatus te labelen en te modificeren en hun ontwikkeling te volgen. Dit wordt bereikt door eerst DNA in één hersenhelft te injecteren op embryonale dag 15,5 of 18,5. De tweede stap is het electroporeren van het geïnjecteerde DNA in het ontwikkelingsgebied van de gyrus dentatus.Vervolgens worden er hersensecties voorbereid met behulp van een vibrator, en de hersenplakken worden tot 14 dagen in cultuur gehouden. De laatste stap is de immunofluorescente kleuring van de hersenplakken met behulp van geschikte antilichamen. Tot slot wordt confocale immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om veranderingen in de gemodificeerde korrelcellen van de ontwikkelende gyrus dentatus aan te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurobiologie, zoals de rol van specifieke genen bij de ontwikkeling van specifieke neuronale cellen in verschillende hersengebieden. In ons geval betreft dit de transcriptiefactor BC 11 B bij de ontwikkeling van de gyrus. Begin de procedure door de baarmoeder van een geëuthanaseerde muis, waarin de embryo's zich bevinden, te dissekeren.Plaats dit in een petrisch

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Source: Keener, D. G., et al. Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the process of single-cell electroporation to introduce plasmid DNA into neurons within mouse hippocampal slice cultures. The procedure involves precise pipette positioning, pressure adjustments, and electroporation pulses to transiently permeabilize the neuronal membrane,...

Gene Expression via Single-Cell Electroporation in Mouse Hippocampal Slice Cultures

This video demonstrates the protocol for single-cell electroporation of genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice cultures. The technique is useful to examine specific molecular and physiological functions of neurons, including cell autonomous mechanisms and transsynaptic protein interactions.

Single Cell Electroporation in Organotypic Brain Slice Cultures: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids Inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Leer ex utero-elektroporatie en organotypische slicecultuur van muizenhippocampusweefsel om genregulatie tijdens hersenontwikkeling te bestuderen. Deze methode maakt manipulatie en volgen van enkele cellen mogelijk.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Meer video's verkennen