Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Het algemene doel van deze procedure is om enkele cellen van de dentate gyrus te labelen en te wijzigen en hun ontwikkeling te volgen. Dit wordt bereikt door eerst DNA te injecteren in één hemisfeer van de hersenen op embryonale dag 15,5 of 18,5. De tweede stap is het electroporeren van het geïnjecteerde DNA in het zich ontwikkelende dentate gyrus-gebied.

Vervolgens worden hersensecties voorbereid met behulp van een vibrator, en de hersensneden worden maximaal 14 dagen in cultuur bewaard. De laatste stap is het immunofluorescente kleuring van de hersensneden met behulp van geschikte antilichamen. Uiteindelijk wordt confocale immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om veranderingen van de gemodificeerde granulecellen van de zich ontwikkelende dentate gyrus te tonen.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de neurobiologievelden te beantwoorden, zoals de rol van specifieke genen in de ontwikkeling van specifieke neuronale cellen in verschillende hersengebieden. In ons geval, BC 11 B transcriptiefactor in de ontwikkeling van de gyrus. Begin de procedure door de baarmoeder van een geëuthanaseerd muis te dissecteren, die de embryo's bevat.

Plaats deze in een petrischaal met 15 tot 20 milliliter koude complete HBSS op ijs. Gebruik vervolgens een paar schaar om elk embryo van de baarmoederhoorn te scheiden. Plaats het vervolgens in een tweede petrischaal met koud compleet HBSS onder een dissectiescoop en snijd de baarmoederwand los.

Bevrijden het embryo voorzichtig van de dooierzak en de placenta. Gebruik vervolgens een paar bond schaar om de embryo's net boven de voorpoot te onthoofden in een hoek van 60 graden.

Als het experiment genotypering van de embryo's vereist, verzamel een weefselmonster voor genomische DNA-isolatie. Breng vervolgens het hoofd over naar een schone en droge petrischaal. Omdat het hoofd onthoofd is in een hoek van 60 graden, moet het kantelen naar één kant wanneer het met de dorsale kant omhoog wordt geplaatst.

Plaats nu voorzichtig een naald in het midden van het hemisfeer, dicht bij de bgma. Injecteer ongeveer twee tot drie microliter DNA-oplossing door op het pedaal van de pico spritzer te trappen. Drie, met behulp van 30 pond druk gedurende de duur van 10 tot 15 milliseconden per puls.

Gebruik vijf tot acht pulsen met een seconde tussen de pulsen. Voordat u de elektroden plaatst, brengt u een paar druppels complete HBSS aan op het hoofd van het embryo O.Plaats vervolgens de elektroden zodanig dat de negatieve kant aan dezelfde kant is als de geïnjecteerde ventrikel en de positieve elektrode aan de tegenovergestelde kant van de geïnjecteerde ventrikel onder de oor van het hoofd van het embryo. Vervolgens worden vijf pulsen van 50 volt toegepast.

Na electroporatie. Plaats het hoofd van het embryo in een schaal met 15 tot 20 milliliter koude complete HBSS-oplossing. Schil de huid van het hoofd van het embryo af.

Maak vervolgens een kleine incisie in het midden van de cerebellum op de middellijn van de schedel. Voer de veerscharen in de incisie in en snijd longitudinaal langs de sagittale sutuur. Schil de schedel af en los de hersenen ervan los.

Ondertussen giet u 4% LMP aros in een peel away mal en pel deze op kamertemperatuur. Neem de hersenen uit de complete HBSS met een kleine lepelspatel en laat het overtollige HBSS weglopen met fijn weefselpapier of chemische doek. Plaats de hele hersenen voorzichtig in de agarrozen en pas de positie aan met een fijne naald.

Houd de mal op ijs tot de agar rozen gestold is en het blok is gesneden. Trim nu het LMP agros blok en lijm het vast aan het monsterstuk met superlijm. Nadat de lijm droog is, brengt u het monsterstuk over naar de bufferlade van de vibrator.

Vul het met ijskoud compleet HBSS totdat het blok in de oplossing is ondergedompeld. Om voor te bereiden op het snijden, stelt u de vibrator in op de juiste instellingen. Snijd de secties met het gewenste weefsel met een langzame snelheid, beginnend vanaf de achterhersenen, en verzamel vijf tot zeven secties van de cerebrum.

Breng vervolgens de secties over naar een schone zes-putten kweekschaal met vijf milliliter ijskoud, compleet HBSS en bewaar het op ijs tot alle secties zijn verzameld. Plaats vervolgens de membraaninzetstukken in een zes-putten plaat met 1,8 milliliter slice kweekmedium. Bevochtig het membraan in een kruisvorm met 100 microliter compleet HBSS voordat u de secties op het membraan plaatst om de oriëntatie van de secties te vergemakkelijken.

Breng vervolgens de secties over op het membraan. Plaats maximaal vijf secties op één membraan en overlap de secties niet met elkaar. Verwijder het overtollige HBSS van het membraan met behulp van een pipette.

Incubeer de kweekschaal gedurende 11 of 14 dagen in vitro bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en ververs de helft van het medium om de dag. In dit stadium voegt u reagentia zoals bromodeoxyuridine toe aan het medium voor de eerste 20 uur van de kweektijd om proliferatieve cellen te labelen. Gebruik in deze stap een schone en scherpe scalpel om het membraan te trimmen volgens de oriëntatie van de secties.

Breng de secties samen met het membraan over naar een 24-putten plaat met één milliliter 4% PFA en incubeer de secties gedurende één uur op kamertemperatuur. Was ze vervolgens drie keer met één XPBS gedurende 15 minuten per wasbeurt. Incubeer de secties vervolgens een nacht lang met permeabele oplossing bij vier graden Celsius met zachte agitatie. De volgende dag, incubeer de secties met de geschikte primaire antilichamen, verdund en permeabele oplossing, gedurende een nacht of 48 uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie.

Was vervolgens de secties drie keer gedurende 15 minuten met één XPBS en incubeer een nacht lang bij vier graden Celsius met de geschikte secundaire antilichamen, verdund en permeabele oplossing. Na de incubatie, was de secties eenmaal met één