Busulfan als myelosuppressieve Agent voor het genereren van een stabiel hoog niveau beenmergchimerisme in Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om het beenmergcompartiment van ontvanger-muizen te vervangen door beenmergcellen van donor-muizen die overal groen fluorescent eiwit tot expressie brengen. In afwezigheid van bestraling wordt dit bereikt door de ontvanger-muis eerst te conditioneren met opeenvolgende intraperitoneale injecties van de myelosuppressieve verbinding busulfan.

Vervolgens worden beenmergcellen geïsoleerd uit de femura en tibia van een donormuis die ubiquitair groen fluorescent eiwit tot expressie brengt. Ten slotte worden de beenmergcellen van de donor in de geconditioneerde recipientmuis getransplanteerd via een injectie in de staartvene. Tot slot wordt er bloed afgenomen van de getransplanteerde muis, dat via flowcytometrie wordt geanalyseerd om de mate van beenmergchimerisme te schatten.

De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals totale lichaamsbestraling, zijn dat een hoge mate van chimerisme van het beenmerg kan worden bereikt zonder de cytotoxische effecten van totale lichaamsbestraling en zonder de noodzaak van gespecialiseerde faciliteiten en apparatuur. Deze methode biedt niet alleen inzicht in de accumulatie van uit het beenmerg afgeleide cellen in het centrale zenuwstelsel, maar kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van onderzoeksonderwerpen zoals de ontwikkeling van hematopoëtische lineages, immunobiologie en leukemie. Om ontvanger-muizen te conditioneren, dient verdunde busulfan volgens het tekstprotocol te worden bereid en dagelijks 20 mg/kg aan de ontvanger-muizen via IP-injectie te worden toegediend.

Nadat de muizen zijn geëuthanaseerd volgens de institutionele richtlijnen, bespuit u onder een laminaire flowkast een muis met 70% ethanol. Til de huid bij de buik op en maak met een chirurgische schaar een incisie door de huid vanaf de buikholte, langs het been richting de enkel terwijl u de voet vasthoudt. Trek de huid stevig van de enkel richting de heup om het weefsel van het been bloot te leggen.

Verwijder het spier- en vetweefsel van het femur om het heupgewricht bloot te leggen terwijl u voorzichtig aan de voet trekt. Om het been te strekken, drukt u de schaar tegen de bekkenbeenderen en knipt u net boven de femurkop, waarbij u er op let dat u het femur zelf niet doorsnijdt. Om de steriliteit te waarborgen, houdt u het been bij de voet vast en verwijdert u resterend weefsel van het femur met een schaar en door het botoppervlak schoon te wrijven met geautoclaveerd weefsel.

Scheid het femur en de tibia door door het kniegewricht te snijden en plaats het femur in een kweekschaal met PBS en incubeer dit op ijs. Verwijder vervolgens de fibula door te snijden op de punten waar de fibula met de tibia is verbonden en gooi deze weg. Maak daarna de tibia schoon.

Verwijder de voet door de tibia door te snijden waar het rode beenmerg eindigt, en plaats de tibia samen met het femur in de kweekschaal en laat deze op ijs incuberen. Gebruik een pincet om het femur vast te houden en schaaf met een chirurgische schaar voorzichtig de distale uiteinden van het bot af. Verwijder zo min mogelijk bot als nodig is om de mergholte bloot te leggen met drie milliliters steriele PBS.

Vul een spuit en bevestig een naald van 23 gauge. Boor de naald voorzichtig in de mergholte en spoel het beenmerg in een steriele kweekschaal. Gebruik de naaldpunt om de mergholte schoon te schrapen om ervoor te zorgen dat alle gewenste cellen na de extractie zijn verwijderd.

Zorg ervoor dat het rode beenmerg niet meer zichtbaar is en dat het bot nu wit oogt. Gebruik een pincet om de tibia vast te houden en schaaf met een chirurgische schaar voorzichtig het uiteinde af waar de tibia aan de knie was bevestigd. Om de mergholte bloot te leggen, vult u een spuit met 3 mL steriele PBS en bevestigt u een naald van 25 gauge.

Boor de naald voorzichtig in de mergholte en spoel het beenmerg in het schaaltje met verzameld beenmerg van de femurs. Gebruik een pipetteertip van 1 ml om het beenmerg voorzichtig te tritureren om de cellen te dissociëren. Breng de celsuspensie door een basketfilter van 40 micron in een steriele centrifugebuis van 50 ml.

Gebruik PBS om de schaal te spoelen om alle resterende cellen te verkrijgen en breng de buffer via het filter over in de centrifugebuis. Voeg PBS toe aan de buis tot een eindvolume van 30 tot 40 milliliters en centrifugeer bij 450 ×g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg.

Resuspendeer het pellet in drie milliliter erytrocyten-lysebuffer en incubeer dit 8,5 minuten op ijs. Voeg vervolgens ongeveer 30 milliliter steriele PBS toe om de lysebuffer te neutraliseren, centrifugeer en verwijder het supernatant. Gebruik één milliliter steriele PBS om het pellet opnieuw te resuspenderen en bewaar dit op ijs.

Verdun een kleine hoeveelheid celhomogenaat met PBS en gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Verdun de celsuspensie tot 8 × 10⁶ cellen per milliliter en bewaar deze op ijs tot de injectie. Voeg voor het uitvoeren van de beenmergtransplantatie 300 µL van de verdunde celsuspensie toe aan een spuit van 0,5 milliliter.

Verwijder bij elke muis die geïnjecteerd moet worden zorgvuldig alle luchtbellen. Plaats de kooi met de geconditioneerde recipientmuizen op een warmtemat en laat de laterale staartvenen dilateren. Plaats een recipientmuis in een passend fixatieapparaat en veeg de staart af met chirurgisch gaas gedrenkt in 70% ethanol; houd de staart stevig vast en voer de naald met de schuine zijde naar boven voorzichtig in een van de laterale staartvenen om de celsuspensie te injecteren.

Houd chirurgisch gaas op de injectieplaats tot de bloeding is gestopt. Voordat de muis ongeveer twee tot drie weken na de beenmergtransplantatie in een nieuwe schone kooi wordt geplaatst, wordt de muis in een fixatiebuis geplaatst en wordt de vacht op het achterpootje geschoren om de vena saphena lateralis bloot te leggen. Breng vervolgens een dunne laag vaseline aan op het pootje en gebruik een naald van 25 gauge om met een heparine-gecoate capillaire buis in de vena saphena te prikken.

Verzamel ongeveer 50 µL bloed en gebruik vervolgens chirurgisch gaas om het bloeden te stelpen. Zodra het bloeden is gestopt, wordt de muis teruggeplaatst in de kooi. Voeg het bloed toe aan een microcentrifugebuisje met one milliliter fax-buffer.

Meng de buis door deze om te keren en bewaar op ijs; centrifugeer de bloedmonsters bij 900 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder en gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 µL erytrocytenlysebuffer en incubeer op ijs gedurende 8,5 minuten. Voeg vervolgens één milliliter FACS-buffer toe om de lysebuffer te neutraliseren en centrifugeer bij 900 ×g gedurende vijf minuten.

Na het lyseren en een tweede keer centrifugeren, volgens het tekstprotocol, dient te worden gecontroleerd of de pellet nu wit is. Als deze rood is, herhaal dan de lyseringsstap voor een derde maal. Suspendeer de pellet in fax-buffer en gebruik flowcytometrie om het aandeel GFP-positieve cellen te kwantificeren.

Deze grafiek toont de wekelijks gekwantificeerde chimerismeniveaus in het perifere bloed van muizen die zijn geconditioneerd met 100 mg/kg busalfan en een succesvolle syngene botoemergt transplantatie hebben ondergaan, en muizen die zijn geconditioneerd met 80 mg/kg busalfan en een onsuccesvolle allogene botmergtransplantatie hebben ondergaan. Chimerismeniveaus hoger dan 80% worden doorgaans drie tot vier weken na de botmergtransplantatie bereikt; hier worden representatieve data van perifeer bloed getoond die een succesvolle en een onsuccesvolle botmergtransplantatie illustreren drie weken na de procedure. Deze flowcytometrie-data laten zien dat een hoge graad van chimerisme gedurende ten minste één jaar behouden blijft in het botmerg, en dat conditionering met het vehikel onvoldoende is om botmergchimerisme te induceren.

Hoewel er geen significante verschillen zijn in de bereikte niveaus van chimerisme in het beenmerg bij het gebruik van doses busulfan van 60 tot 100 milligram per kilogram, hopen GFP-positieve cellen zich op een dosisafhankelijke manier op binnen het centraal zenuwstelsel. Deze figuur illustreert de ophoping van GFP-positieve cellen afkomstig uit het beenmerg binnen de lumbale regio van het ruggenmerg bij een wild-type muis, en in grotere mate bij een muismodel voor de neurodegeneratieve ziekte amyotrofische laterale sclerose. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om syngene recipient- en donormuizen van hetzelfde geslacht te gebruiken om de mogelijkheid van transplantafstoting na deze procedure te minimaliseren.

Andere methoden, zoals flowcytometrie en immunohistochemie, kunnen worden gebruikt om de mechanismen te bestuderen waarlangs cellen uit het beenmerg het centrale zenuwstelsel binnendringen.