Name: Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren Toxoplasma gondii Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Ontdek forward genetics om Toxoplasma gondii-genen te identificeren die betrokken zijn bij immuunontwijking in macrofagen. Deze methode onthult nieuwe mechanismen van gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bijzondere dank aan Dr. Peter Bradley voor het antilichaam om de T. gondii mitochondriën te detecteren. Het werk werd ondersteund door de National Institute of Health Grants AI072028 en AI107431 aan D.G.M en een genereuze donatie aan New York Medical College voor de studie van tropische geneeskunde.

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

De beschreven protocol verschaft een onbevooroordeelde benadering dat activatie van muizen beenmerg afgeleide macrofagen en forward genetics isoleren T. gebruikt gondii mutanten met een defect in hun vermogen om activering van geïnfecteerde macrofagen overleven. Het fenotype van de mutanten volgende macrofaag activatie valt gewoonlijk in een van twee categorieën: 1) De parasieten verschijnen intact maar niet repliceren dan 1 parasiet per PV; 2) De parasieten verschijnen afgebroken en kan in ruime, amor...

Toxoplasma gondii (T. gondii) is een obligaat intracellulaire, protozoaal ziekteverwekker. Het is de verwekker van toxoplasmose, een gevaar voor de gezondheid in immuungecompromitteerde personen. Ook is het modelsysteem voor andere apicomplexa pathogenen die personen zoals Cryptosporidium en Cyclospora infecteren. Toxoplasmose wordt meestal verkregen door het eten van voedsel of water besmet met de bradyzoite of oocyst stadium van de parasiet. Bij inname, deze stadia te zetten naar de tachyzoite stadium van de parasiet die repliceert binnen gastheercellen en verspreidt systemisch. T-cellen, IFN-γ en, in mindere mate, stikstofmonoxide 1-4, zijn belangrijk voor de controle van de infectie, maar zijn niet in staat elimineren van de ziekte, als percentage van tachyzoïeten converteren naar het bradyzoite fase die beschermd in weefsel cysten resulterend in een langlevende chronische infectie. In feite zijn er geen therapieën effectief tegen chronische cyste stage van de ziekte. Ernstige toxoplasmose is meestal te wijten aan de reactivering van persisterende infectie, met de bradyzoite stadium van de parasiet het omzetten terug naar de snel repliceren tachyzoite stadium kenmerk van primaire en acute infectie. Overleving in gezicht van de aangeboren immuunrespons is belangrijk dat de parasiet voldoende aantal parasieten te bereiken, alsook distale plaatsen te bereiken, de vestiging van chronische infectie mogelijk. T. gondii geëvolueerd strategieën gastheer afweermechanismen die waarschijnlijk bijdragen aan het vermogen tot replicatie en verspreiding vroeg in infectie tegengaan. Ten eerste, T. gondii vormt een unieke PV tijdens parasiet invasie die grotendeels gescheiden van de endocytische en exocytose proces van de gastheercel in vergelijking met andere intracellulaire pathogenen 5-9. Ook, net als alle succesvolle intracellulaire pathogenen T. gondii wijzigt haar gastheercel om een tolerante omgeving te creëren fof groei. Dit omvat herprogrammering gastheercel genexpressie door het veranderen gastheercel transcriptiefactoren waaronder die belangrijk voor het reguleren celactivering 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20, GRA16 21 en GRA24 22 zijn allemaal aangetoond belangrijk te zijn bij het ​​reguleren van de transcriptionele respons en signaaltransductie cascades gastheercellen geïnfecteerd met T. gondii. Recente studies met behulp van genetische kruisingen tussen parasiet stammen met verschillende fenotypes zijn uiterst productief op het identificeren van de parasiet genen die parasiet genotype-afhankelijke eigenschappen, waaronder ontduiking van de immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 grondslag liggen geweest. Bij muizen immuniteits- GTPases (IRGs) cruciaal zijn voor de bestrijding van type II en III genotypen van de parasiet, terwijl het virulente type I genotypen mechanismen hebben ontwikkeld om de murine IRGs onttrekken. Het is echter ook duidelijk dat de parasiet mechanismen geëvolueerd antimicrobiële media onttrekkentors naast de IRGs en sommige van deze mechanismen kunnen worden bewaard in parasiet genotypen 27,28. Daarnaast, zeer weinig bekend over de kritische mediatoren van cel autonome immuniteit tegen T. gondii tijdens menselijk toxoplasmose. Parasite genen betrokken resistentie tegen bemiddelaars van cel- autonome immuniteit kunnen ook belangrijk zijn voor overleving gedurende tachyzoite conversie die ook kan worden veroorzaakt door gastheer immuunreacties bradyzoite. Zo kan stikstofmonoxide hoog niveau parasiet replicatie in geïnfecteerde macrofagen onderdrukken maar kan ook tachyzoite stimuleren omzetting resulteert in cystenproduktie 30-32 bradyzoite. ToxoDB is een functionele genomische databank voor T. gondii, dat functioneert als een belangrijk hulpmiddel voor het gebied in termen van het verstrekken van sequentie-informatie voor de parasiet genoom en de toegang tot gepubliceerde en ongepubliceerde genomische schaal gegevens inclusief gemeenschap annotaties, gen exp<html> ression en proteomics data 33. Net als vele protozoaire pathogenen, het merendeel van het genoom bestaat hypothetische genen zonder informatie gebaseerd op gen homologie inzicht verschaffen in de mogelijke functies. Dus vooruit genetica is een krachtig instrument om nieuwe parasiet genen belangrijk zijn voor het immuunsysteem fraude, cyste conversie en andere functies van cruciaal belang voor parasiet pathogenese, alsook voor de omrekening tussen verschillende ontwikkelingsstadia te identificeren. Een extra sterke forward genetics is dat het kan worden gebruikt als een relatief niet-voorgespannen benadering van de parasiet ondervragen om de genen die belangrijk zijn voor specifieke taken in pathogenese, waaronder immuun fraude en vorming van cysten zijn. Recente verbeteringen in next generation sequencing voor mutatie-profilering hebben het tot een methode van keuze voor de identificatie van de verantwoordelijke parasiet genen van forward genetics studies met behulp van zowel chemische als insertiemutagenese 34-37 gemaakt. ntent &quot;&gt; Het is belangrijk om kwetsbaarheden T. gondii die kunnen worden benut om de doeltreffendheid van cel autonome afweermechanismen tegen de parasiet name die ook actief tegen de resistente cyste fase zijn. Tegen dit doel een in vitro muizen kan worden verbeterd macrofaag infectie en activering model ontwikkeld om mutaties in de parasiet die specifiek beïnvloeden T. gondii conditie na activering van geïnfecteerde macrofagen maar niet in naïeve macrofagen herkennen. Deze macrofaag scherm werd toegepast om een bibliotheek van T. gondii insertie mutanten ondervragen om uiteindelijk identificeren T. gondii genen betrokken resistentie tegen stikstofoxide 27,28. De isolatie van een panel van T. gondii mutanten met verminderde weerstand activering van geïnfecteerde macrofagen, in het bijzonder een duidelijke gevoeligheid voor stikstofoxide, bleek het nut van het scherm te identificeren parasiet genen die belangrijk zijn voor de weerstandbemiddelaars van cel- autonome immuniteit dan de resistentiemechanismen beschreven voor muizen IRGs 28. Mutagenese heeft voordelen boven chemische mutagenese in termen van het genereren van een beperkt aantal willekeurige mutaties in elke kloon en parasieten, in theorie, snellere identificatie van de plaats van mutatie. Het identificeren van de genomische plaats van plasmide invoeging in T. gondii insertie mutanten, in de praktijk is verrassenderwijs moeilijk in veel gevallen 37. Het inbrengen van een plasmide in een gen waarschijnlijk ook de functie van een gen te verstoren in tegenstelling tot chemische mutagenese die resulteert gewoonlijk in enkele nucleotide veranderingen. Echter, chemische mutagenese met ofwel N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethylmethaansulfonaat (EMS) een versterkt vermogen om een ​​groter deel van de parasiet genoom analyse bieden, vergeleken mutagenese, zoals maakt meerdere single nucleotide polymorphisms ( geschat op 10 -100) per mutant 34, 38. Bovendien recente vooruitgang geheel genoom profilering heeft het mogelijk gemaakt de volgende generatie sequencing gebruiken om de meest waarschijnlijke kandidaat genen voor de geïdentificeerde fenotype van een gemuteerde parasiet 34,38 identificeren. Ongeacht de mutagenesebenadering bevestiging van de rol van de parasiet gen resistentie tegen macrofaag activatie uiteindelijk vereist gendeletie en complementatie moleculaire Koch&#39;s postulaten voldoen. De mogelijkheid om de functie van een gen door genetische manipulatie van zowel de parasiet en de macrofaag ontleden is belangrijk omdat vele genen geïdentificeerd via forward genetics T. gondii, evenals andere pathogenen, nog steeds sprake als hypothetisch genen met weinig tot geen sequentie homologie met andere eiwitten met bekende functies. Het huidige document wordt een algemene aanpak die kan worden gebruikt voor het identificeren of het verstoorde gen in een mutant is belangrijk voor resistentie tegen bekende ofonbekend mediator van cel autonome immuniteit. De eerste analyse van gastheer antimicrobiële factoren wordt uitgevoerd door het evalueren van de overleving van wild-type en mutante parasieten in macrofagen van wild-type muizen versus die met een specifiek gen deleties in induceerbare stikstofmonoxide synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidase), en specifieke immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs). Dit bepaalt of de geïdentificeerde parasiet genen belangrijk voor resistentie stikstofoxide, reactieve zuurstofintermediairen respectievelijk of een onbekend immuun mechanisme betrokken immuniteit gerelateerde GTPases 28. Activering van geïnfecteerde macrofagen zowel IFN-γ en LPS in het huidige protocol beschreven, resulteert voornamelijk in de isolatie van genen betrokken parasiet resistentie tegen stikstofmonoxide 28. Het gebruik van farmacologische middelen die stikstofoxide induceren in de afwezigheid van activering van macrofagen (stikstofoxide donoren) bevestigden dat de meerderheid van de genen die belangrijk waren voor hergebruikresistentie tegen stikstofoxide in plaats van stikstofmonoxide in overleg met extra mediators in verband met macrofaagactivering 28. Stap één en twee beschrijven een forward genetics scherm ontworpen om parasiet mutanten te isoleren met een fitness defect na activering van geïnfecteerde beenmerg-afgeleide macrofagen in vitro. Stap één beschrijft een dosistitratie analyse een dosis van IFN-γ en LPS empirisch bepaald moet worden voor macrofaag activatie parasiet replicatie vermindert maar niet volledig replicatie van de wildtype T. remmen gondii ouderlijke stam die wordt gebruikt voor het maken van de bibliotheek van mutanten parasiet. Stap twee beschrijft de voorwaartse genetische screen van de mutante klonen in macrofagen in 96-well platen. Stap drie schetst een aanpak die het fenotype van elke mutant die in het scherm van de 96 putjes en beoordelen of het defect in elke mutant beïnvloedt parasiet overleving, replicatie bevestigenof cyste productie in respons op macrofaag activatie. Stap vier beschrijft het gebruik van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met deleties specifieke antimicrobiële routes naar de immuunmediatoren waarop het parasiet mutant specifiek gevoelig identificeren. Stap vijf schetst een benadering te bepalen of een parasiet mutant ook gecompromitteerd in vivo pathogenese geëvalueerd door cystenproduktie in de hersenen van geïnfecteerde muizen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29101&amp;productId=3255471&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=11737973&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>Thermo</td><td>SH3002802&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=2434305&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType =PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>SH3003401&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=3311957&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType =PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Pen strep</td><td>Thermo</td><td>SV30010&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&amp;productId=1309668 6&amp;catalogId=29104&amp;matchedCat No=SV30010&amp;fromSearch=1&amp; searchKey=SV30010&amp;highlightPro ductsItemsFlag=Y&amp;endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&amp;xrefPartType=From&amp;savings= 0.0&amp;xrefEvent=1407777949003_0 &amp;searchType=PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Thermo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=3064595&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>LPS</td><td>LIST biologicals</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&amp;product_id=81&amp;keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td></tr><tr><td>IFN-&#947;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&amp;storeId=10652&amp; productId=2988494&amp;catalogId=29 104&amp;matchedCatNo=50813664&amp; fromSearch=1&amp;searchKey=murine+ifn+pepro+tech&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&amp;xrefPartType=From&amp;savings =0.0&amp;xrefEvent=1407778210608_ 12&amp;searchType=PROD&amp;hasPromo =0</td></tr><tr><td>Chamber slides</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=2164545&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>96-well optical plates</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=3010670&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;langId=-1&amp;catalog Id=29104&amp;productId=3158736&amp;dis type=0&amp;highlightProductsItemsFlag =Y&amp;fromSearch=1&amp;searchType= PROD&amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Tissue culture flast T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&amp;productId=127039 67&amp;catalogId=29104&amp;matchedCat No=12565351&amp;fromSearch=1&amp; searchKey=156367&amp;highlightProdu ctsItemsFlag=Y&amp;endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%

forward genetica schermen met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; toxoplasma gondii</em&gt; genen belangrijk voor weerstand tegen ifn-γ-dependent cell autonome immuniteit

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, de veroorzaker van toxoplasmose, is een obligate intracellulaire protozoaire ziekteverwekker. De parasiet dringt binnen en repliceert zich in vrijwel elk warmbloedig werveldierceltype. Tijdens het binnendringen van de parasiet in een gastheercel, creëert de parasiet een parasitoforous vacuoole (PV) die afkomstig is van het gastheercelmembraan, onafhankelijk van fagocytose, waarin de parasiet zich repliceert. Terwijl IFN-afhankelijke aangeboren en celgemedieerde immuniteit belangrijk is voor uiteindelijke controle van de infectie, kunnen aangeboren immuuncellen, inclusief neutrofielen, monocyten en dendritische cellen, ook dienen als voertuigen voor systemische verspreiding van de parasiet vroeg in de infectie. Er wordt een aanpak beschreven die het aangeboren immuunrespons van de gastheer, in dit geval macrofagen, gebruikt in een forward genetische screen om parasietmutanten te identificeren met een fitnessdefect in geïnfecteerde macrofagen na activering, maar normale invasie en replicatie in naïeve macrofagen. Dus, de screen isoleert parasietmutanten die een specifiek defect hebben in hun vermogen om de effecten van macrofaagactivering te weerstaan. Het artikel beschrijft twee brede fenotypes van muterende parasieten na activering van geïnfecteerde macrofagen: parasietstasis versus parasietdegradatie, vaak in amorfe vacuolen. De parasietmutanten worden vervolgens geanalyseerd om de verantwoordelijke parasietgenen te identificeren die specifiek belangrijk zijn voor resistentie tegen geïnduceerde bemiddelaars van celautonome immuniteit. Het artikel presenteert een algemene aanpak voor de forward genetic screen die, in theorie, kan worden aangepast om parasietgenen te targeten die belangrijk zijn voor resistentie tegen specifieke antimicrobiële bemiddelaars. Het beschrijft ook een aanpak om de specifieke macrofaagantimicrobiële bemiddelaars waarvoor de parasietmutant vatbaar is, te evalueren. Activering van geïnfecteerde macrofagen kan ook parasietdifferentiatie bevorderen van de tachyzoite naar de bradyzoite fase die chronische infectie onderhoudt. Daarom wordt methodologie gepresenteerd om de belangrijkheid van het geïdentificeerde parasietgen voor het vestigen van chronische infectie te evalueren.

Toxoplasma gondii repliceert vrij in naïeve macrofagen en een verdubbelingstijd tussen 6-12 uur afhankelijk van de stam van de parasiet. Figuur 1 toont representatieve parasieten in naïeve versus geactiveerde beenmerg afgeleide macrofagen. Figuur 2 toont de algemene morfologie van parasieten in HFF gastheercellen aan 2, 4, 8, 16 en 32 parasieten / PV. In het huidige protocol, wordt de parasiet mag naïef macrofagen binnen te vallen en stellen een ontluikende parasitophorous vacu...

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

forward-genetics-screens-using-macrophages-to-identify-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Een parasiet-rescue en transformatie test met geïnfecteerde cellen...

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende reporters en celsortering om knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen. Twee plasmiden worden gebruikt voor deze vereenvoudigde knock-in experimenten, namelijk een CRISPR/Cas9- en DsRed2-tot expressie brengend plasmide en een homoloog recombinatiedonorplasmide dat EBFP2 tot expressie brengt, dat permanent is geïntegreerd op de Rosa26-locus in immuuncellen.

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Ontdek forward genetics om Toxoplasma gondii-genen te identificeren die betrokken zijn bij immuunontwijking in macrofagen. Deze methode onthult nieuwe mechanismen van gastheer-pathogeen interacties.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren Toxoplasma gondii Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit (Video) | JoVE Journal

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren

Meer video's verkennen