Name: Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en Ex Vivo Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren van huidresidente T-cellen uit menselijke huidbiopten. Deze techniek levert voldoende levensvatbare lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo celkweek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Huid biopten van psoriasis patiënten werden vriendelijk verschaft door Dr. Andreas Koerber (afdeling Dermatologie aan de Universiteit van Essen, Duitsland) na mondeling dan wel schriftelijk toestemming voor wetenschappelijk gebruik. XH wordt ook ondersteund door NSFC 61263039 en NSFC 11.101.321.

LET OP: Huid biopten van gezonde individuen werden verkregen uit buikhuid overgebleven van individuen die een electieve plastische chirurgie na mondelinge of schriftelijke informed consent voor wetenschappelijk gebruik. Het gebruik van menselijke huid werd goedgekeurd en in overeenstemming met de door de Medisch Ethische commissies ingesteld voor menselijke onderzoek van het medisch centrum Radboud Universiteit, Nijmegen, Nederland en Universiteit van Essen, Duitsland regelgeving. 1. Bereiding van suspensies van afzonderlijke cellen van menselijke huid (Werk Steriel in een flow-kast als Latere Cell Cultuur is vereist) <ol><li> Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 + penicilline / streptomycine (eindconcentraties 100 eenheden / ml en 100 ug / ml) + pyruvaat (0,02 mM) en glutamax (0,02 mM), zonder serum toegevoegd. </li><li> Bereid compleet kweekmedium: kweekmedium bereid in stap 1,1 + 10% humaan serum gepoolde (HPS); bewaren bij 4 ° C. Breng medium tot 20 ° C ± 2 voor onsing. </li><li> Het verkrijgen van de huid biopsie met behulp van een 4mm round biopsie punch instrument en bewaar het in RPMI1640 compleet kweekmedium bij 20 ° C ± 2 tot 4 uur of bij 4 ° C ON. Verwerk de biopsie zo snel mogelijk na aankomst in het laboratorium. LET OP: Langere opslag van huid zal invloed hebben op de cel opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> Label een blauw-capped dissociatie buis en voeg 5 ml compleet kweekmedium in de gemerkte buis. </li><li> Voeg 2 ml compleet kweekmedium in elk putje (in totaal 3 wells) van een steriele 6-well cultuur plaat. Gebruik steriele instrumenten om de biopsie te plaatsen in een enkele, goed afspoelen, verplaatsen naar een tweede put en herhaal deze stap nog een keer, dus een totaal van drie spoelingen bereiken. </li><li> Breng de goed gespoeld huidbiopsie een steriele petrischaal, voeg 100 ul compleet cultuurmedium bovenop biopsie en voorzichtig afschrapen het onderhuidse vetweefsel via een roestvrij stalen wegwerp steriel scalpel. LET OP: This is een cruciale stap. </li><li> Snijd elke huidbiopsie in 4 kleinere stukken op een steriele petrischaal. Doorvoermonsters (maximaal vier van 4 mm biopsies per buis) aan de bereide dissociatie buis met 5 ml compleet cultuurmedium. </li><li> Nauw sluit de buizen met de dop en bevestig ondersteboven aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator. Zorg ervoor dat alle monstermateriaal is gelegen in het gebied van de rotor. </li><li> Start het dissociatieproces door uitvoering van de &quot;programma m_spleen _01&quot; (een vooraf bepaald programma door het interne geheugen van het instrument of de begeleiding programmeerkaart) aan de biopsie dissociëren op het geschikte rotatiesnelheid voor 56 sec. </li><li> Na de verwerking, maak de dissociatie buis uit het dissociator en zorg ervoor dat al het gedissocieerde materiaal wordt verzameld op de bodem van de buis. </li><li> Voeg 150 ul collagenase IA (80 mg / ml) in de dissociatie buis en incubeer het monster in een schuddend waterbad bij 37° C gedurende 60 minuten. Voeg 100 ul van DNase I (5 ME / ml) in thedissociation buis, meng goed. LET OP: hogere concentratie van collagenase of langere incubatietijd zal levensvatbaarheid van de cellen te veranderen. </li><li> Bevestig de dissociatie buis aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator en start het programma &quot;m_ milt _01&quot; om de biopsie distantiëren nog een keer. </li><li> Plaats een 70 uM nylon cel zeef bovenop een 50 ml Falcon buis. Solliciteer gedissocieerde monster materialen om deze cel zeef naar cel klonten / weefsel vuil te verwijderen. </li><li> Was cel zeef eenmaal met 5 ml compleet cultuurmedium. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 xg gedurende 10 min en zuig supernatant. </li><li> Herhaal de wasstap nog een keer. Resuspendeer celpellets in 300 ul compleet cultuurmedium. Single-celsuspensies zijn klaar voor verdere analyse; verder met protocollen voor ex vivo celkweek of flowcytometrie analyse. </li><li> Bij verdere intracellular cytokine kleuring, stimuleren cellen met PMA (12,5 ng / ml), Ionomycine (500 ng / ml) en Brefeldine A (5 ug / ml) gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 4 uur voordat stroming cytometrie analyse. </li></ol> 2. Polyklonale Activering van Skin-Resident T-cellen (Ex Vivo Cultuur van de Cel) <ol><li> Aliquot 100 pi eencellige suspensies (bereid in stap 1,15) in een rond-bodem 96-well plaat. Opmerking: Voor elk van 4 mm huidbiopsie, kan de verkregen enkelvoudige celsuspensies worden gesplitst in ten minste twee putjes van een 96-wells plaat. </li><li> Add anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beklede microkorrels (parels 25.000 per putje), recombinant humaan cytokine rIL-2 (eindconcentratie 25 U / ml) en rIL-1β (eindconcentratie 50 ng / ml). </li><li> Bedek de cultuur plaat met een goed gelabelde plaat deksel, incubeer in 5% CO 2, 100% vochtigheid, 37 ° C incubator. Verander medium wanneer het medium kleur verandert in geel. <br/&gt; LET OP: A clear cell kolonie kan worden waargenomen vanaf de eerste dag 8 van celkweek. </li></ol> 3. Flowcytometrie Analyse van de Primary / gekweekte huid-resident T-cellen <ol><li> Bereid FACS buffer: PBS + 0,2% BSA. </li><li> Transfer cellen van belang in een v-bodem 96-well plaat. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 pl PBS. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant. </li><li> Vlek cellen met 100 pi bereid eFluorescence780 geconjugeerd fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (1: 1000 verdunning gebruikt PBS) bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant. </li><li> Gewenste celoppervlaktemarker mAbs, bijvoorbeeld: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 01:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), en cd1c-APC (AD5-8E7, 1:10), de voorbereiding van de mAbs-mengsel met behulp van FACS-buffer op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren. </li><li> Voeg 25 ul van bereide mAbs-mengsel in elk putje. Incubeer 20 min bij 20 ° C ± 2, bescherming tegen licht. </li><li> Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant. </li><li> Voor monsters die alleen celoppervlak kleuring vereisen, verder met stap 3.16. </li><li> In het geval van intra-cellulaire Foxp3 kleuring: <ol><li> Bereid fixatie en permeabilisatie buffer door het mengen van één deel concentraat met 3 delen van oplosmiddelen. </li><li> Bereid 1x permeabilisatie buffer: 1 deel 10x permeabilisatie buffer + 9 delen gesteriliseerd H 2 O. </li></ol></li><li> Resuspendeer pellets in 100 ul van fixatie en permeabilinisatie buffer, meng goed, en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 100 ul permeabilisatie buffer aan elk putje centrifugeer bij 450 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en zuig supernatant. </li><li> Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer. </li><li> Selecteer gewenste intracellulaire mAbs bijvoorbeeld Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) en IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereid de mAbs mengsel met behulp van permeabilisatie buffer die 2% normale rat serum op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren. </li><li> Voeg 20 ul van mAb-bereide mengsel in elk putje. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, bescherming tegen licht. </li><li> Na 30 minuten incubatie, voeg 100 ul van permeabilisatie buffer in elk putje. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant. </li><li> Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer. Resuspendeer pellet in 110 ui FACS buffer, en de overdracht celsuspensies in microFACS buis. LET OP: De steekproef is klaar voor de meting met behulp van 10-kleuren flowcytometrie. </li><li> Bij exacte aantal cellen nodig, voeg 10 ul goed gemengd uniforme suspensie van FluoroSpheres in elk monster onmiddellijk voordat metingen met behulp van flowcytometrie. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol om de huid aanwezige T-cellen uit menselijke huid biopten efficiënt isoleren. Het voordeel van dit protocol is de isolatie van relatief grote aantallen levensvatbare lymfocyten en expressie relevant oppervlaktemerkers. De cel subsets geïdentificeerd waren: CD 11 c + DCs, CD4 + en CD8 + T-cellen en CD25 + Foxp3 + cellen. Belangrijk is dat ex vivo cultuur van geïsoleerde huid resident T-cellen was zeer goed haalbaar en liet vo...

De huid, als de primaire interface tussen het lichaam en het milieu, biedt de eerste verdedigingslinie tegen externe fysische, chemische en biologische beledigingen zoals verwonding, ultraviolette straling en micro-organismen. Huid bestaat uit twee grote compartimenten, de epidermis en de dermis, en bevat een verscheidenheid van immuuncellen zoals Langerhans cellen, macrofagen, dendritische cellen (DC&#39;s), en ongeveer 20 miljard memory T-cellen bijna tweemaal zoveel in de totale bloedvolume 1 , 2. Een groeiende hoeveelheid gegevens ondersteunen het idee dat de huid essentiële immunologische functies, zowel tijdens weefsel homeostase en in verschillende pathologische aandoeningen. Immuuncellen in normale huid verblijfplaats wordt gedacht dat immunosurveillance 3 voeren en hebben aangetoond dat het een rol in de ontwikkeling van ontstekingsaandoeningen zoals psoriasis 4 spelen. In psoriatische letselhuid, zowel CD4 + als CD8 + T cellen geïnfiltreerd observed en werd aangetoond dat de verhouding van de CD4 en CD8 varieert afhankelijk van de ziektestatus 5. Echter, deze celpopulaties zijn moeilijk te bestuderen omdat de bestaande technieken maken het isoleren van slechts enkele cellen. De momenteel op grote schaal gebruikt technieken voor het T-cel isolatie van de menselijke huid te combineren mechanische huid dissociatie met enzymatische behandeling. De menselijke huid biopten worden uitgebreid gehakt en geïncubeerd met enzymen zoals trypsine, collagenase en / of EDTA 6-8. Aangezien de huid een barrière weefsel dat zeer resistent is tegen trekkrachten en mechanische disaggregatie de gevestigde werkwijzen van T cel isolatie geproduceerd zeer weinig cellen, en zelfs lagere aantallen van levensvatbare cellen, die ex vivo celkweek maakt van deze celpopulaties moeilijk en uitdagend. Hier melden wij een aangepaste methode om lymfocyten van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid te isoleren door het combineren van mechansche dissociatie van de huid met behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator plaats van de gevestigde werkwijze van extensief hakken, met behulp van enzymatische digestie collagenase. Verschillende levensvatbare immuuncelsubklassen zoals DC en T-cellen werden na de bereiding van een enkele-celsuspensie. Vooral de expressie van de oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8 was goed geconserveerd. Aldus bereide cellen, klaar voor gebruik in ex vivo celkweken of flowcytometrische analyse. Dit protocol is met succes toegepast voor de analyse van afzonderlijke huidbiopsies (4 mm) afkomstig van letselhuid van psoriasis. De resultaten toonden aan dat de huid inwoner patiënt T-cellen geproduceerd meer inflammatoire cytokines, zoals IL-17 en IFNy in vergelijking met gezonde vrijwilligers 9.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blauw afgesloten, gebruikt als de dissociatiebuis.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Geautomatiseerde weefseldissociator. Gebruik het "programma spleen_01" voor het dissociëren van de huidbiopsie.</td></tr><tr><td>Cell strainer&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Kleur dode cellen voorafgaand aan celfixatie; verdunnen met PBS op 1:1.000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; verdunningsfactor 1:50 voor oppervlaktekleuring; verdunningsfactor 1:25 voor intracellulaire kleuring.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; verdunningsfactor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; verdunningsfactor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; verdunningsfactor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; verdunningsfactor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Tellingkralen, voor flowcytometrie</td></tr></tbody></table>

lymfocyt isolatie van human skin voor fenotypische analyse en<em&gt; ex vivo</em&gt; cell culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Menselijke huid een belangrijke barrière functie en bevat diverse immuuncellen die bijdragen aan weefsel homeostase en bescherming tegen pathogenen. Aangezien de huid is relatief gemakkelijk te bereiken, biedt een ideaal platform perifere immuun regulerende mechanismen te bestuderen. Immune resident cellen in gezonde huid gedrag immunosurveillance, maar spelen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van inflammatoire huidaandoeningen, zoals psoriasis. Ondanks nieuwe inzichten, is ons begrip van de biologie onderliggende verschillende inflammatoire huidaandoeningen nog beperkt. Er is behoefte aan goede kwaliteit (interne) celpopulaties geïsoleerd uit biopsie huidmonsters. Tot dusver isolatieprocedures zijn ernstig gehinderd door het ontbreken van het verkrijgen van een voldoende aantal levensvatbare cellen. Isolatie en daaropvolgende analyse zijn ook beïnvloed door het verlies van immune cellijn markers, vanwege de mechanische en chemische stress veroorzaakt door de huidige dissociatie procedures ter verkrijgingenkele celsuspensie. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode om T-cellen van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid isoleren combineren mechanische dissociatie huid behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator en collagenase behandeling. Deze methode behoudt expressie van de meeste immune lineage markers zoals CD4, CD8, CD 11 c Foxp3 en op de bereiding van enkelvoudige celsuspensies. Voorbeelden van succesvolle CD4 + T cel isolatie en vervolgens fenotypische en functionele analyse getoond.

Het protocol hier gepresenteerde zal opleveren tussen 2200 ± 615 (gemiddelde ± SEM, huid van gezonde vrijwilligers) tot 178.000 ± 760 (gemiddelde ± SEM, letselhuid van psoriasis patiënten) levensvatbare lymfocyten van menselijke huid bij het gebruik van een enkele 4 mm huid biopsie. Verschillende typen CD45 + cellen werden in enkel-celsuspensies afgeleid van huid van gezonde personen, waaronder CD4 + T-cellen (~ 45%), CD8 + T-cellen (~ 30%) en CD11c +</s...

We beschrijven een protocol om efficiënt huidresidente T-cellen te isoleren uit humane huidbiopsieën. Dit protocol levert voldoende aantallen vitale humane huidresidente lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo kweek.

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Het algemene doel van deze procedure is om op efficiënte wijze huidresidente T-cellen te isoleren uit menselijke huidbiopten. Dit wordt bereikt door eerst menselijke huidbiopten te verkrijgen met behulp van een ronde biopsietang. Vervolgens wordt elk huidbiopt in een petrischaal in vier kleinere stukjes gesneden.Vervolgens wordt het huidweefsel mechanisch en enzymatisch gedissocieerd om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. Ten slotte worden de huidresidente lymfocyten geanalyseerd via flowcytometrie en ex vivo gekweekt. Uiteindelijk kunnen voldoende aantallen levensvatbare menselijke huidresidente lymfocyten worden geïsoleerd en geanalyseerd middels immunokleuring en FACS-analyse.Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in de dermatologie en de immunologie van huidtumoren. Zo bijvoorbeeld hoe residente T-cellen in de huid bijdragen aan de ziekte. De procedure wordt gedemonstreerd door Xuehui He, een PhD-student uit ons laboratorium.Nadat het kweekmedium volgens het tekstprotocol is bereid, voegt u twee milliliter compleet medium toe aan drie putjes van een steriele zes-putjes kweekplaat. Gebruik vervolgens een ronde biopsietang van vier millimeter om een huidbiopt te verkrijgen. Plaats dit in RPMI 1640 compleet kweekmedium en laat deze tot vier uur op het werkblad liggen, of overnacht bij vier graden Celsius.Terwijl het biopsaat incubeert, labelt u een dissociatiebuis met blauwe dop en voegt u vijf milliliters volledig cultuurmedium toe. Plaats vervolgens het biopsaat met steriele instrumenten in de eerste well om het te spoelen. Verplaats het weefsel naar de tweede well, spoel het, en herhaal dit proces nogmaals in de derde well.Breng het goed gespoelde huidbiopt over naar een steriele petrischaal en pipetteer 100 µL compleet kweekmedium op het monster. Gebruik vervolgens een steriel wegwerpscalpel van roestvrij staal om het subcutane vetweefsel voorzichtig af te schrapen. Snijd elk huidbiopt in een nieuwe steriele petrischaal in vier kleinere stukjes.Breng de monsters vervolgens over naar de voorbereide dissociatiebuis die vijf milliliter volledig medium bevat. Sluit de buis stevig af en bevestig deze ondersteboven aan de huls van de automatische weefseldissociator. Zorg ervoor dat al het monstermateriaal zich in het gebied van de rotor bevindt.Start vervolgens het dissociatieproces door programma M spleen zero one uit te voeren. Dissocieer het biopsaat met de juiste rotatiesnelheid gedurende 56 seconden. Koppel na verwerking de dissociatiebuis los van de dissociator en zorg ervoor dat al het gedissocieerde materiaal zich onderin de buis bevindt.Voeg 150 µL collagenase A toe aan de dissociatiebuis en incubeer het monster in een schuddend waterbad bij 37 °C gedurende 60 minuten. Voeg vervolgens 100 µL DNase toe aan de dissociatiebuis en meng dit goed. Bevestig de dissociatiebuis aan de huls van de automatische weefseldissociator en voer programma M spleen 01 uit om het biopsaat nogmaals te dissociëren.Plaats vervolgens een nylon cellstrainer van 70 µm op een 50 mL falconbuis en breng de gedissocieerde monstermaterialen aan op de cellstrainer om celklonten en weefselresten te verwijderen. Gebruik vijf mL volledig medium om de cellstrainer eenmaal te wassen. Centrifugeer daarna het filtraat bij 450 ×g en 20 °C ± 2 °C gedurende 10 minuten voordat het supernatant wordt geaspireerd.Nadat de wasstap nogmaals is herhaald, gebruik je 300 µL compleet kweekmedium om de celpellets opnieuw te suspenderen. De enkelcel-suspensies zijn nu klaar voor verdere analyse. Om intracellulaire cytokinestaining uit te voeren, gebruik je PMA, ionomycine en brefeldine A om de cellen te stimuleren en incubeer je deze gedurende vier uur bij 37 °C en 5% CO2 voordat de flowcytometrie-analyse wordt uitgevoerd.Om polyklonale activatie van huidresidente T-cellen uit te voeren, verdeelt u 100 µL van de enkelcel-suspensie over een rondbodem 96-wells plaat. Voeg anti-CD3, anti-CD28 met antilichamen gecoate microbeads en de recombinante humane cytokinen IL-2 en IL-1B toe. Dek de kweekplaat af met een gelabeld, gewogen deksel en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid.Vervang vervolgens het medium wanneer de kleur geel wordt. Op dag acht in de celkweek kan een heldere celkolonie worden waargenomen. Draag voor de FACS-analyse de cellen van belang over naar een 96-well plaat met V-bodem.Centrifugeer bij 450 G en 20 °C, plus of min twee graden, gedurende twee minuten. Aspireer vervolgens het supernatant. Gebruik 100 µL van de bereide fluorescente 780-geconjugeerde fixeerbare levensvatbaarheids kleurstof om de cellen te kleuren door deze 30 minuten te incuberen bij 4 °C.Voeg vervolgens 100 µL FACS-buffer toe en centrifugeer voordat het supernatant wordt afgezogen. Selecteer daarna de monoklonale antilichamen voor de celoppervlaktemarkers uit de lijst in het tekstprotocol en bereid de antilichaamoplossingen in FACS-buffer. Gebruik isotypecontroles van de antilichamen samen met een niet-gekleurd monster om de gate-instellingen te definiëren.Voeg nu 25 µL van het bereide mengsel van muizantilichamen toe aan elke put en bescherm deze tegen licht. Incubeer gedurende 20 minuten bij 20 °C. Voeg 100 µL FACS-buffer toe, centrifugeer en aspireer het supernatant.Gebruik de buffers die volgens het tekstprotocol zijn bereid voor foxp3-kleuring en voeg 100 µL fixatie- en permeabilisatiebuffer toe om de pellets opnieuw te suspenderen. Meng goed en incubeer 30 minuten bij 4 °C. Voeg vervolgens 100 µL permeabilisatiebuffer toe aan elke well en centrifugeer voordat het supernatant wordt geaspireerd.Nadat de cellen nogmaals zijn gewassen en de juiste antilichamen zijn gekozen, voegt u 20 µL van het bereide monoklonale antilichamenmengsel toe aan elke well en beschermt u deze tegen licht voor incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten. Was de cellen nogmaals met permeabilisatiebuffer. Gebruik vervolgens 110 µL FACS-buffer om de pellets opnieuw te suspenderen en breng de celsuspensies over in micro-FACS-buisjes.Ten slotte, indien het exacte celgetal vereist is, voeg dan vlak voor het uitvoeren van de FACS-metingen 10 µL van een goed gemengde, uniforme suspensie van fluorescerende bolletjes toe aan elk monster. Zoals hier getoond, werden verschillende typen CD45-positieve leukocyten geïdentificeerd in enkelcel-suspensies afgeleid van de huid van gezonde individuen, waaronder CD4-positieve T-cellen, CD8-positieve T-cellen en CD11c-positieve dendritische cellen.Daarentegen werden er weinig B-cellen, NK-cellen of macrofagen waargenomen. Bovendien maakt de methodologie de analyse van CD4-positieve CD25-positieve foxp3-positieve cellen in menselijke huidbiopten mogelijk. Door bijvoorbeeld intracellulaire kleuring na fixatie en permeabilisatie toe te passen, is het mogelijk om de expressie van de transcriptiefactor foxp3 in CD25-positieve T-cellen aan te tonen.Zoals hier wordt aangetoond, wordt voor het gatingsproces van de lymfocytenpopulatie het anti-menselijke CD45 muisantilichaam geconjugeerd aan een brilliant violet 421 fluorochroom aanbevolen om achtergrondautofluorescentie en de autofluorescerende celpopulatie te vermijden. Deze figuur illustreert dat de meerderheid van de residente cellen in de menselijke huid CD3-positieve T-cellen waren. Voor de analyse van de celviabiliteit wordt een fixeerbare viabiliteitskleurstof aanbevolen om levensvatbare cellen te onderscheiden van dode of stervende cellen.Voor verdere functionele analyse werd, middels een enkele huidbiopsie van vier millimeter van lesionele huid van psoriasispatiënten, aangetoond dat de uit de biopsie afgeleide T-cellen IL-17a en interferon gamma produceerden. Dit volgde op een stimulatie van vier uur met PMA ionomycin in aanwezigheid van brefeldine A. Tot slot laat deze figuur zien dat T-cellen van personen met psoriasis een veel hogere capaciteit hebben om de met psoriasis geassocieerde cytokinen IL-17a en interferon gamma te produceren. Vergeet niet dat het werken met menselijk weefsel en laboratoriumreagentia gevaarlijk kan zijn.Houd altijd rekening met de veiligheidsmaatregelen.

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

T-lymfocyt migratie vindt plaats tijdens homing aan lymfoïde organen, het verlaten van het vaatstelsel en het aangaan van perifere weefsels. We beschrijven hier een protocol dat gebruikt kan worden om T-lymfocyten migratie te...

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

De huid is de thuisbasis van een complex netwerk van immuuncellen. We beschrijven een efficiënte methodologie voor het verteren van muizenhuid, uit verschillende delen van het lichaam van het dier, om een enkele celsuspensie te verkrijgen en de verschillende leukocytenpopulaties die in de huid aanwezig zijn te analyseren door middel van flowcytometrie.

Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio

Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.

Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Leer een efficiënte methode voor het isoleren van huidresidente T-cellen uit menselijke huidbiopten. Deze techniek levert voldoende levensvatbare lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo celkweek.

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en

Meer video's verkennen