Name: Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer modulaire neuronale netwerken kweken met PDMS-stencils voor patroonvorming van eiwitlagen en celadhesie. Deze methode ondersteunt elektrofysiologisch onderzoek naar neurale connectiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Europese Project BRIANBOW (FP7 Young Explorers, zou De auteurs willen dr Jacopo Tessadori bedanken voor nuttig commentaar op het manuscript, en Silvia Chiappalone voor haar hulp bij het produceren van de graphics gebruikt in de video.

De procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de NIH normen voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werd goedgekeurd door de Universiteit van Tel Aviv Animal Care en gebruik Comite (nummer van de vergunning - L-14-019). 1. Voorbereiding van Instrumenten en PDMS <ol><li> Bereid de wafel (Table of Materials, of bestel de wafel vanaf een microfabricage lab), een scalpel en pincet - sterilisatie niet noodzakelijk. </li><li> Maak poly-D-lysine (PDL) oplossing volgens de volgende voorwaarden: 4 mg / ml in 0,1 M boraatbuffer, pH 8, en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid PDMS stencils volgens de volgende procedure: <ol><li> Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS, silicone-elastomeer) door mengen van de basis en het hardingsmiddel met een verhouding van 10: 1, roer de 2 stoffen gedurende ongeveer 5 min. </li><li> Plaatsen in vacuümkamer tweemaal gedurende 15 min elke keer en controleer belletjes zijn verdwenen. </li><li> Wanneerhet PDMS is klaar, bereiden spinbekleder: geopend stikstof knoppen om het gebruik van gas mogelijk te maken, plaatst u de silicium wafer (Figuur 1A) op de spinner, en gebruik het vacuüm te verhinderen dat ze. </li><li> Giet PDMS dan wafer en activeert de spinner gedurende 1 min bij 1000 rpm (creëert ongeveer 100 urn hoogte). </li><li> Plaats wafer op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 30 min. </li><li> Wanneer het PDMS is uitgehard overzicht grenzen het sjabloon met PDMS, met Pasteur pipet. Plaats wafer op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 30 min. </li><li> Wanneer de PDMS grenzen hebben verhard, gebruik dan een scalpel om stencils gesneden volgens de grenzen en trek het silicium stencil van de wafer (een kwadraat PDMS die een enkele patroon). </li></ol></li></ol> 2. petrischaaltje en Cover Slip Voorbereiding <ol><li> Bereid 23 mm vierkante glazen dekglaasjes en reinig ze volgens de volgende volgorde: <ol><li> Wassen met gedestilleerd water, 70% ethanol en aceton. </li><html><li> Wassen met isopropanol en snel droog met stikstof. </li></ol></li><li> Plaats patroon PDMS stencils op dekglaasje, en drukt u voorzichtig om te controleren of ze stevig zijn bevestigd aan het glasoppervlak. Plaats in vacuümkamer 15 min. </li><li> Drop 1 ml van PDL op stencil. Plaats het dekglaasje in de vacuümkamer tweemaal 20 minuten per keer, en laat PDL O / N drogen. </li><li> Bereid petrischaal een ondersteunende cel netwerk te creëren: <ol><li> Bedek het oppervlak van de schaal (3,5 cm) met 1 ml van PDL 2 uur bij RT. Verwijder de PDL druppel met een pipet. </li><li> Wassen met gedestilleerd water en laten drogen. Plaats een klein druppeltje siliconenvet op elke hoek van het dekglaasje. </li></ol></li><li> Plaats het dekglaasje op het midden van de petrischaal (dat wil zeggen, moet het PDMS worden naar boven) en druk zachtjes om bevestiging te controleren. </li><li> Verwijder voorzichtig PDMS van dekglaasje met een pincet. Voor sterilisatie, blootstellen aan UV-verlichting voor 7 min. </li></ol>le &quot;&gt; 3. Multi-Electrode Array (MEA) Voorbereiding <ol><li> Schoon MEA in deze volgorde (tabel van Materialen): <ol><li> Wassen met water onder de kraan en ultrasone trillingen in een geconcentreerde, enzymatische detergent 3 keer. </li><li> Ultrasone trillingen in gedestilleerd water 3 keer. </li><li> Wassen met gedestilleerd water (in kap, 1.000 III tip) 3 keer en plaats onder UV gedurende 30 min. </li></ol></li><li> Ondersteunende netwerk voorbereiding: <ol><li> Bereid de ontworpen ondersteunend netwerk schimmel. <ol><li> Giet PDMS in een 12-well plaat (22 mm diameter). </li><li> Wanneer de PDMS is uitgehard nemen uit de mal en met behulp van een scalpel, een gat in het midden om een ​​ring vorm te maken. </li><li> Plaats een ontworpen ondersteuningsnetwerk schimmel op het midden van het MEA (figuur 2A) en bestrijken de rest van het oppervlak met PDL gedurende 2 uur bij KT. </li></ol></li><li> Verwijder PDL behulp van een pipet en wassen met gedestilleerd water. </li><li> Verwijder de mal en laat het drogen (Figuur 2A). &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Lijn stencil naar MEA op de volgende manier: <ol><li> Plaats stencil op aangewezen micro manipulator. Gebruik een omgekeerde microscoop om nauwkeurig uitlijnen patroon structuur elektroden en laat het stencil totdat op het MEA oppervlak (figuur 2B) geplaatst. Opmerking: Neem contact op met een goed schoongemaakt MEA biedt concurrerende hechting tussen de PDMS en de MEA zelf. </li><li> Til de micromanipulator en gebruik indien nodig pincet een kleine hoeveelheid druk toegepast boven de PDMS te voorkomen dat het loskomen van de MEA. </li><li> Druk voorzichtig op stencil te MEA oppervlak, en gebruik microscoop om te controleren of hij stevig bevestigd is, en goed uitgelijnd. (Figuur 2C-D). </li></ol></li><li> Plaats MEA in vacuümkamer voor 15 min; zet een 1 ml druppel PDL op stencil. </li><li> Invoegen in vacuümkamer 2 keer voor 20 minuten elk. Laat PDL drogen O / N in de incubator. </li><li> Voordat plating, verwijder de PDMS stencils van MMO&#39;s en wassen met steriele water. Plaats onder UV-belichting gedurende 7 min. </li></ol> 4. Dissection en Cultuur <ol><li> Bereid culturen zoals beschreven Herzog et al. 2011 21. </li></ol> 5. Plating <ol><li> Bereken aantal cellen nodig voor plateren met behulp van een hemocytometer (optimale dichtheid volgens de grootte van de schakeling beschreven in het resultaat). <ol><li> Zorg ervoor dat de telkamer (hemocytometer) is schoon en plaats een deksel slip op het (gebruik van alcohol schoon te maken). </li><li> Verdun 10 pi van de celsuspensie in 190 pl plaatmedium (verdunning 1:20). </li><li> Plaats 10 gl van de verdunde cellen op de rand van de telkamer en langzaam pipet cellen uit waardoor de kamer zich vult. </li><li> Met behulp van een omgekeerde microscoop, visualiseer de haemocytometer net. Bepaal het aantal cellen in de kamer door directe telling (gezonde cellen zou ronde). Tel de cellen in het grote plein without die het oversteken van de randen. </li><li> Bereken de concentratie van cellen: Totaal aantal cellen / 1000 ul = totaal getelde cellen x verdunningsfactor x 10 4 (gebied van de hemocytometer). Opmerking: Als bijvoorbeeld de verdunningsfactor was 20 en de totale cellen geteld werden 100: 100 x 20 x 10 4 = 0,1 x 10 7 cellen / 1000 ul of 1 x 10 6/100 ul. Om 0.75 x 10 6 cellen plaat, neem 75 pi uit de cellen. </li></ol></li><li> Neem het aantal cellen nodig voor plateren per enkelvoudige MEA of petrischaal, resuspendeer de cellen om aggregatie te voorkomen en plaat ze in het midden bovenop het patternate gebied (indien nodig, het mogelijk om de cellen te verdunnen in het medium) . Voor de MEA, plaats een 100 ul druppel in het midden. Voor dekglas, plaats een 1.000 III daling in het midden. </li><li> Incubeer de cellen uitgeplaat bij 37 ° C gedurende 40 min. Voeg plating medium om de geplateerde cellen tot 1ml per MEA en 2 ml per dekglas. </li><li> Houd bij 37 ° C en elke 4 dagen, verdund met vers groeimedium verrijkt met 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 en 0,75% glutamax. </li><li> Van 07/06 DIV, na het zien van verbindingen tussen de eilanden, verdunnen medium met 10 ul / ml FUDR (25 mg deoxyuridine + 62,5 mg uridine in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) of een andere anti-mitotische middel aan gliale voorkomen begroeiing. </li></ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+syntax%3A+cell+assemblies%2C+synapsembles%2C+and+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li>
<li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).</li>
<li>Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li>
<li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microelectrode+array+%28MEA%29+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li>
<li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400(2014).</li>
<li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443(2010).</li>
<li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+neuronal+circuits%3A+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10(2011).</li>
<li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40(2013).</li>
<li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays%3A+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li>
<li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648(2012).</li>
<li>Taylor, A. M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+and+compartmentalized+platforms+for+neurobiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).</li>
<li>Sorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+self-wiring+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Compact self-wiring in cultured neural networks.</a> J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+properties+for+biomedical+micro%2Fnanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li>
<li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8%3A+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+MicroengineeringEmail+alert+RSS+feed%22%5BJournal%5D)">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li>
<li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+Technologies%22%5BJournal%5D)">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li>
<li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).</li>
<li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).</li>
<li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li>
<li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li>
<li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li>
<li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008(2011).</li>
<li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li>
<li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li>
<li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li>
<li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li>
<li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).</li>
<li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li>
<li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een protocol 2D modulaire neuronale netwerken groeien in vitro samengesteld functioneel onderling verbonden circuits beschreven. De procedure is gebaseerd op een cellulair patroon brengen kleeflaag. Patroonvorming wordt bereikt met PDMS mallen reproduceren negatieve eigenschap van het gewenste netwerkarchitectuur. PDMS stencils bepalen de gebieden waar de cellulaire lijmlaag wordt afgezet. Zodra cellen worden verzilverd, ze spontaan verzamelen om de gecoate eilanden en zichzelf organiseren in actieve onderling ...

Experimentele en theoretische bewijzen ondersteunen de mogelijkheid dat de hersenen werken door gecoördineerde activatie van celsamenstellen 1-5, waarbij dynamische functionele eenheden die tijdelijk met elkaar, vormen en onderliggende verschillende hersengebieden toestanden kunnen worden beschouwd. Functionele modulariteit is ook afhankelijk en verbonden aan de structurele modulaire organisatie van de hersenen circuits 6,7. Hoe de functie en structuur van de hersenen circuits elkaar wederzijds vorm is nog steeds één van de belangrijkste open vragen in de neurowetenschappen. Om een ​​dieper inzicht in deze vraag te voorzien, is het belangrijk om een ​​optimale experimentele kaders identificeren waar het mogelijk is om aan te pakken, ten minste gedeeltelijk, die kwesties. Sinds gecontroleerde manipulatie van de ruimtelijke en temporele dynamiek van neuronale netwerken in in vivo-experimenten is uitdagend, de ontwikkeling van in vitro neuronale netwerken modellen is van groot belang vanwege hun gemakkelijke accessibility, controle, manipulatie en het modelleren van 8,9. In de afgelopen jaren, in vitro technieken met geavanceerde substraat patroonvorming werkwijzen maken neuronale netwerken bewegen een reeks vooraf gedefinieerde modulaire structuren 3 ontwikkelen en de functionele eigenschappen van netwerken bestuderen met opgelegde topologieën 10. In het bijzonder werden methoden onlangs gebruikt om netwerken te organiseren door het opleggen van fysieke beperkingen 4,11. Inderdaad, het verband tussen structuur en functie in neuronale netwerken te bestuderen en om een vereenvoudigde maar plausibele voorstelling van interactie neuronale assemblages bieden, dient in vitro systemen onderling verbonden neuronale subpopulaties bieden. Uitgebreid bestudeerd 2D homogene neuronale culturen geen ruimtelijke beperkingen op te leggen aan de zelf-georganiseerde emergent bedrading van de circuits. Daarom is een mogelijke aanpak om kunstmatig verbonden celsamenstellen vorm is om de verschillende neuronale populaties spuugde positionerenially verschillende gebieden. De afstand tussen deze gebieden niet voorkomen dat de inter assemblages aansluitingen. Deze benadering, waarbij een aanzienlijke controle over netwerkcomplexiteit, is aangetoond dat een rijkere repertoire synchronisatie modellen 6,7,12 verschaffen. Om een ​​reproduceerbare kweken van neuronale modulaire samenstellen vergemakkelijken, een protocol voor de zelf-organisatie van neuronale netwerken in clusters toegevoegd door axonen en dendrieten assembleren wordt voorgesteld en beschreven. De polymere structuur voor de fysieke opsluiting van neuronale culturen is ontstaan ​​uit polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS is een elastomeer veel gebruikt voor biomedische applicaties vanwege de biologische verenigbaarheid ervan, transparantie en permeabiliteit voor gassen 13. De PDMS wordt bereid en uitgesloten van de micromachine SU8 2075 14,15 structuren door spin coaten van een vloeibare PDMS op een &quot;master&quot; zoals eerder beschreven in Jackman et al. 16 THij bereikte gevormde neuronale netwerken bestaan ​​uit onderling verbonden modules van verschillende grootte en ze werden met succes verkregen zowel dekglaasjes en Micro Electrode Arrays (MEA) 17-20. De dichtheid van de verbindingen tussen de modules kunnen de eigenschappen van het netwerk synchronisatie tussen modules wijzigen van een volledig gesynchroniseerde netwerk, typisch uniform culturen, voorbijgaande toestanden van synchronisatie.

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene vacuum chamber</td><td>Thermo</td><td>5305-0609</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine PDL</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Silicone grease - SILICAID 1010</td><td>aidchim Ltd</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell - Technologies Corporation</td><td>WS-650-23</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3336</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&rsquo;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>Multi Channel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC02</td><td>Multi Channel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>03-033-1c</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>glutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>01-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Micro Electrode Arrays 4Q</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td><td>cleaning manual: <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">http://www.multichannelsystems.com</a></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>microchem</td><td>SU8-2075</td><td>Preparation protocol: <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">http://www.microchem.com</a></td></tr></tbody></table>

ontwerp, oppervlaktebehandeling, cellular plating, en het kweken van modulair neuronale netwerken samengesteld uit functioneel inter-verbonden circuits

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Het brein werkt via de gecoördineerde activering en de dynamische communicatie van neuronale assemblages. Een grote open vraag is hoe een uitgebreid repertoire van dynamische motieven, die meest uiteenlopende hersenfuncties ten grondslag liggen, kunnen voortkomen uit een vaste topologische en modulaire organisatie van de hersenen circuits. In vergelijking met in vivo studies van neuronale circuits die intrinsieke experimentele moeilijkheden opleveren, in vitro preparaten bieden een veel grotere mogelijkheid te manipuleren en sonde de structurele, dynamische en chemische eigenschappen van experimentele neuronale systemen. Dit werk beschrijft een in vitro experimentele methode die het mogelijk maakt het groeien van modulaire netwerken samengesteld door ruimtelijk onderscheiden, functioneel met elkaar verbonden neuronale assemblages. Het protocol maakt het regelen van de tweedimensionale (2D) architectuur van het neuronale netwerk op verschillende topologische complexiteit. Een gewenste netwerk patroonvorming kan zijnbereikte zowel op reguliere dekglaasjes en substraat ingesloten micro-elektrode arrays. Micromachine structuren reliëf op een silicium wafer en gebruikt om biocompatibele polymere stencils, die de negatieve kenmerken van het gewenste netwerkarchitectuur nemen creëren. De sjablonen worden tijdens de oppervlaktelaag procedure met een moleculaire laag voor het bevorderen van cellulaire adhesie aan het kweken substraten geplaatst. Na verwijdering van de stencils worden neuronen uitgeplaat en zij spontaan doorgestuurd naar de beklede gebieden. Door het verlagen van de inter-compartiment afstand, is het mogelijk om ofwel geïsoleerde of onderling verbonden neuronale circuits te verkrijgen. Celoverleving bevorderen, cellen samen gekweekt met een ondersteunend neuronale netwerk dat zich aan de rand van de kweekschaal. Elektrofysiologische en optische opnames van de activiteit van modulaire netwerken respectievelijk verkregen door substraat ingesloten micro-elektrode arrays en calcium imaging gepresenteerd. Terwijl elke module toont Spontaneous wereldwijde synchronisaties, wordt het optreden van de inter-module synchronisatie gereguleerd door de dichtheid van de verbinding tussen de circuits.

Een SU8-2075 schimmel op een silicium wafer met een functie dikte van ongeveer 100 urn werd gebruikt om de PDMS vormen. Het patroon werd uit vierkanten van verschillende afmetingen, met een zijlengte en afstand variërend tussen 200 en 700 urn (Figuur 1B). De afmeting van het vierkant werd gekozen om het gezichtsveld van een 10X passen (voor eilanden met een zijlengte &lt;800 pm) en een 20X objectief (voor eilanden met een zijlengte &lt;400 pm). Drie parameters, namelijk cel plating dichtheid, afstand tu...

Dit manuscript beschrijft een protocol om te groeien in vitro modulaire netwerken bestaande uit ruimtelijk beperkt, functioneel met elkaar verbonden neuronale circuits. Een polymere masker wordt gebruikt voor het patroon van een eiwit laag om cellulaire adhesie op het kweken substraat te bevorderen. Plated neuronen groeien op gecoat gebieden oprichting spontane verbindingen en vertonen elektrofysiologische activiteit.

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Het algemene doel van deze procedure is het in vitro kweken van modulaire netwerken die bestaan uit ruimtelijk begrensde, functionele en onderling verbonden neuronale circuits. Dit wordt bereikt door eerst de PDMS-sjablonen voor te bereiden om een eiwitlaag te patroneren die de cellulaire adhesie op het kweeksubstraat bevordert. De tweede stap is het reinigen van de kweeksubstraten.In het bijzonder de oppervlakken van petrischalen, dekglasjes en multi-elektrode-arrays. Vervolgens worden de PDMS-stencils op het kweeksubstraat geplaatst en worden de gewenste patronen van de adhesieve eiwitlaag aangebracht. De laatste stap is het uitplaten van de neuronaal-gliale cellen.Uiteindelijk worden opnames met multi-elektrode-arrays en calcium-imaging gebruikt om de dynamiek van de gerealiseerde modulaire neuronale netwerken aan te tonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke openstaande vragen binnen de neurowetenschappen, zoals het onderzoeken van de communicatiedynamiek tussen neuronale ensembles, waarbij er tegenovergestelde experimentele condities zullen zijn. Polymethylsiloxaan of PDMS wordt gemaakt door eerst één deel hardingsmiddel te mengen met 10 delen basisreagens.Na vijf minuten mengen wordt het mengsel gedurende 15 minuten in een vacuümkamer geplaatst. Controleer na 15 minuten op luchtbellen en plaats de oplossing nogmaals 15 minuten in de kamer. Bereid vervolgens een wafer voor op de spin-coater.Open de gaskranen voor stikstofgas. Plaats een wafer op de spinner en zet deze vast met het vacuüm. Giet vervolgens een dunne laag PDMS over de wafer.Centrifugeer de wafer met PDMS gedurende één minuut bij 1000 RPM om een PDMS-coating van 100 micron dik op de wafer aan te brengen. Plaats de wafer vervolgens op een warmteplaat bij 100 °C. Laat deze daar 30 minuten bakken.Nadat de PDMS is uitgehard, gebruikt u een pipet om de randen van de sjabloon te omlijnen met meer PDMS. Bak vervolgens de toegevoegde PDMS op de wafer. Zoals voorheen, wanneer de PDMS-randen zijn uitgehard, snijdt u de sjabloon langs de randen en pelt u de siliconen sjabloon van de wafer om te beginnen met RINs.Vierkante glazen dekglasjes van 23 millimeter met gedestilleerd water, gevolgd door 70% ethanol, daarna aceton, vervolgens isopropanol en tot slot gedestilleerd water. Droog de vierkantjes opnieuw onder een stroom nitrogengas. Druk vervolgens voorzichtig één PDMS-sjabloon met patroon op elk dekglasje.Plaats de dekglasjes met de sjablonen gedurende 15 minuten in een vacuümkamer. Nadat het vacuüm is getrokken, wordt er een milliliter PDL op de sjablonen gedruppeld en worden de assemblages gedurende 20 minuten teruggeplaatst in de vacuümkamer. Herhaal de vacuümcyclus van 20 minuten één keer en laat het PDL vervolgens de volgende dag gedurende de nacht drogen.Bereid de petrischalen voor die de netwerkcellen zullen ondersteunen. Bedek eerst schalen van 3,5 centimeter gedurende twee uur met één milliliter PDL bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de PDL uit de schaal door middel van aspiratie.Was de schaaltjes vervolgens met gedestilleerd water en laat ze drogen. Zodra een schaaltje droog is, brengt u een kleine hoeveelheid siliconenvet aan in het schaaltje, overeenkomend met de vier hoeken van het dekglas. Plaats de dekglazen met de PDMS-zijde naar boven op het schaaltje en druk ze voorzichtig aan om er zeker van te zijn dat ze goed vastzitten.Verwijder nu voorzichtig de A-P-D-M-S met een pincet van de dekglasjes, zodat het PDL-patroon achterblijft. Steriliseer tot slot de schaaltjes door ze zeven minuten lang bloot te stellen aan UV-straling. Reinig eerst de multi-elektrode-array door deze af te spoelen onder kraanwater en vervolgens te soniceren in een geconcentreerd enzymatisch reinigingsmiddel.Herhaal deze stappen drie keer. Sonicate vervolgens de MEA drie keer in puur gedestilleerd water onder een afzuigkap. Was de MEA vooraf met gedestilleerd water.Steriliseer dit gedurende 30 minuten met UV-licht. Bereid vervolgens eerst het ondersteunende netwerk voor. Giet PDMS in een 12- of 24-wellplaat.Zodra het PDMS is uitgehard, verwijdert u het met een naald. Snijd nu gaten in het midden van de schijven om ringen te maken, die dienen als malondersteuning. Plaats nu een malondersteuning in het midden van de MEA en bedek het extern blootgestelde oppervlak van de MEA.Laat dit twee uur rusten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens de PDL-was, spoel het externe blootgestelde oppervlak van de MEA met gedestilleerd water en verwijder de malondersteuning zodat de MEA kan drogen. Bevestig nu een stencil aan een voorbereide micromanipulator onder een omgekeerde microscoop.Inspecteer de gestructureerde laag en lijn deze uit met de elektroden van de MEA. Gebruik vervolgens de micromanipulator om het stencil op het MEA-oppervlak te laten zakken. Zodra het is bevestigd, tilt u de micromanipulator op en gebruikt u, indien nodig, een pincet om een kleine hoeveelheid druk uit te oefenen om te voorkomen dat de PDMS loslaat.Plaats de MEA nu gedurende 15 minuten in de vacuümkamer. Breng vervolgens een druppel van 1 milliliter PDL aan op de stencil en plaats deze opnieuw in de vacuümkamer voor twee cycli van 20 minuten. Laat de PDL de volgende dag gedurende de nacht drogen.Verwijder de P DM S-sjablonen uit de meeteenheden met een pincet. Steriliseer de meeteenheden tot slot zeven minuten met UV-licht. Ze zijn vervolgens klaar voor de cellen; bereid de cellen in preparatiecultuur en de suspensies voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Nadat de benodigde hoeveelheid cellen in Resus is gesuspendeerd, worden deze in het midden van het gepatroonde gebied op de MEA of het dekglas geplaatst. Een MEA moet worden geladen met volumes van 100 microliter en een dekglas kan 1000 microliters accommoderen.Incubeer de cellen op de plaat gedurende 40 minuten en voeg vervolgens elke vier dagen platingmedium toe om de cellen in stand te houden. Voeg vers aangevuld groeimedium toe. Na de zesde of zevende dag zouden de neuronale verbindingen tussen de modules zich op dat moment moeten beginnen te vormen.Verdun het kweekmedium met een anti-mitotisch middel om overgroei van glia te voorkomen. Na vier dagen in vitro is het mogelijk om te observeren dat neuronen gehecht zijn binnen de PD DL-gecodeerde spots van 600 microns vierkant na 14 dagen. In kweek vestigden neuronen spontaan verbindingen binnen de modules en tussen de modules, waardoor actieve functionele netwerken werden gevormd.Neurale circuits van 300 micron vierkant werden waargenomen door de PDMS-kenmerkmaat aan te passen terwijl dezelfde uitplaatconcentratie werd behouden. Calcium-imaging werd uitgevoerd met een Forex-objectief om de activiteit in de gekweekte netwerken breed in kaart te brengen. Tussen de groene en roze modules is een groter aantal verbindingen zichtbaar, terwijl de blauwe en rode modules minder verbonden zijn met de andere modules.Een rosterplot van de beginpunten van de calciumgebeurtenissen wordt getoond voor een film die is opgenomen met 30 hertz met een afbeelding van 1 miljoen pixels. De groene en roze modules waren sterk gesynchroniseerd, terwijl de blauwe en rode modules dat minder waren. Zo werd een corticaal modulair netwerk, bestaande uit drie verschillende circuits, geregistreerd na 21 dagen in vitro.Met behulp van een MEA werd vastgesteld dat neuronale circuits die ongeveer 600 microns van elkaar verwijderd waren, onderling verbonden waren. Hun elektrofysiologische activiteit werd gereconstrueerd. Met behulp van een algoritme voor spike-detectie met precieze timing werd een rosterplot van vijf minuten van deze gegevens gemaakt, met kleurgecodeerde clustergegevens.Dit biedt een vergelijking van de activiteit van het volledige netwerk en van een enkel cluster en geeft inzicht in de synchronie binnen clusters. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u PDM-stencils voorbereidt en deze gebruikt om de adhesie van neurogliale cellen te patroonvormen, wat leidt tot de vestiging van een functioneel modaal netwerk.

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

This video demonstrates the development of a 3D neuronal culture coupled to a planar microelectrode array with hippocampal neurons. The isolated neurons form a 2D network on the microelectrode array's active area and adhere to glass microbeads in a multi-well plate with a membrane insert. Upon transferring these neuron-coated microbeads to the electrode, they organize into an interconnected 3D neural network.

Building Three-Dimensional Neuronal Networks Coupled to Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates the process of culturing neuronal cells on a patterned multi-electrode array (MEA) to establish modular neuronal networks. This method allows the study of neural signal transmission and cellular interactions.

Constructing Patterned Neuronal Circuits on a Multi-Electrode Array

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van plastic fiches om cultuur en grendelen primaire lymfkliertest neuronen. Deze chips zijn voorgemonteerd, gebruiksvriendelijke en compatibel met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol wordt beschreven hoe plaat rat hippocampal neuronen binnen deze chips en uitvoeren van fluidic isolatie, axotomy en immunokleuring.

Gebruik van vooraf geassembleerde kunststof Microfluidic Chips voor primaire lymfkliertest neuronen compartimentering

Dit protocol demonstreert het gebruik van gecompartimenteerde microfluïdische chips, injectie gegoten in een cyclisch olefine copolymeer aan gekweekte neuronen die worden onderscheiden van menselijke stamcellen. Deze chips zijn voorgeassembleerd en gemakkelijker te gebruiken dan traditionele gecompartimentaliseerde poly (dimethylsiloxaan) apparaten. Meerdere gemeenschappelijke experimentele paradigma's worden hier beschreven, met inbegrip van virale labeling, fluidic isolatie, axotomie, en...

Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.

Twee-foton polymerisatie 3D-printen van neuronale celkweekapparaten op microschaal

Leer modulaire neuronale netwerken kweken met PDMS-stencils voor patroonvorming van eiwitlagen en celadhesie. Deze methode ondersteunt elektrofysiologisch onderzoek naar neurale connectiviteit.

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits (Video) | JoVE Journal

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits

Meer video's verkennen