Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits
15 april 2015
Dit manuscript beschrijft een protocol om te groeien in vitro modulaire netwerken bestaande uit ruimtelijk beperkt, functioneel met elkaar verbonden neuronale circuits. Een polymere masker wordt gebruikt voor het patroon van een eiwit laag om cellulaire adhesie op het kweken substraat te bevorderen. Plated neuronen groeien op gecoat gebieden oprichting spontane verbindingen en vertonen elektrofysiologische activiteit.
Het algemene doel van deze procedure is om in vitro modulaire netwerken te laten groeien die bestaan uit ruimtelijk beperkte, functionele, onderling verbonden neuronale circuits. Dit wordt bereikt door eerst de PDMS-stencils voor te bereiden om een eiwitlaag te patrooneren die cellulaire adhesie over het kweeksubstraat bevordert. De tweede stap is het reinigen van de kweeksubstraten.
Specifiek de oppervlakken van petrischalen, dekglasjes en multi-elektrode arrays. Vervolgens worden de PDMS-stencils op het kweeksubstraat gedeponeerd en worden de gewenste patronen van de kleef-eiwitlaag gemaakt. De laatste stap is het plateren van de neuronale gliacellen.
Uiteindelijk worden multi-elektrode array opnames en calciumbeeldvorming gebruikt om de dynamica van de bereikte modulaire neuronale netwerken te laten zien. Deze methode kan helpen om belangrijke open vragen in het neurowetenschappelijk veld te beantwoorden, zoals het onderzoeken van de dynamica van communicatie tussen neuronale assemblages, en er zullen contra-experimentele omstandigheden zijn. Polymethyl soane of PDMS wordt gemaakt door eerst één deel hardende agent met 10 delen basismiddel te mengen.
Na vijf minuten mixen, verplaatst u het mengsel gedurende 15 minuten naar een vacuümkamer. Na 15 minuten controleert u op bellen en brengt u de oplossing nogmaals 15 minuten naar de kamer. Vervolgens bereidt u een wafer op de spincoder voor.
Open de gaskraan voor stikstofgas. Plaats een wafer op de spinner en zet hem vast met de vacuüm. Giet vervolgens een dunne laag PDMS over de wafer.
Spin de wafer met PDMS een minuut bij 1000 RPM om een 100 micron dikke PDMS-coating op de wafer te maken. Breng vervolgens de wafer over naar een hotplate op 100 graden Celsius. Laat het daar 30 minuten bakken.
Nadat de PDMS is uitgehard, gebruikt u een pipet om de stencilranden met meer PDMS te omlijnen. Bak vervolgens het toegevoegde PDMS op de wafer. Zoals eerder, wanneer de PDMS-randen zijn uitgehard, snijdt u de stencil langs de randen en verwijdert u de siliconen stencil van de wafer om met RIN's te beginnen.
23 millimeter vierkante glazen dekglasjes met gedistilleerd water, gevolgd door 70% ethanol, vervolgens aceton, vervolgens isopropanol en ten slotte gedistilleerd water. Droog de vierkanten opnieuw onder een stikstofgasstroom. Druk vervolgens voorzichtig één patroon PDMS-stencil op elk dekglas.
Plaats de dekglasjes met de stencils 15 minuten in een vacuümkamer. Nadat ze zijn gedroogd, laat een milliliter PDL op de stencils vallen en breng de assemblages terug naar de vacuümkamer voor 20 minuten. Herhaal de vacuümcyclus van 20 minuten eenmaal en laat de PDL de volgende dag een nacht drogen.
Bereid de petrischalen voor die de netwerkcellen zullen ondersteunen. Bedek eerst 3,5 centimeter schalen met een milliliter PDL gedurende twee uur. Verwijder later de PDL uit de schaal door aspiratie bij kamertemperatuur.
Was vervolgens de schalen met gedistilleerd water en laat ze drogen. Zodra een schaal is gedroogd, voegt u een kleine hoeveelheid siliconenvet toe aan de schaal volgens de vier hoeken van het dekglas. Plaats de dekglasjes op de schaal met de PDMS naar boven en druk ze voorzichtig naar beneden om er zeker van te zijn dat ze vastzitten.
Verwijder nu voorzichtig A-P-D-M-S van de dekglasjes en laat het PDL-patroon achter. Steriliseer ten slotte de schalen door ze zeven minuten aan UV bloot te stellen. Reinig eerst de multi-elektrode array door deze onder lopend water te wassen en soniceer hem vervolgens in een geconcentreerde enzymatische detergent.
Herhaal deze stappen drie keer. Soniceer vervolgens de MEA in puur gedistilleerd water drie keer waarna u hem onder de kap wast. Was de MEA eerst met gedistilleerd water.
Steriliseer het met UV-licht gedurende 30 minuten. Bereid vervolgens het ondersteunende netwerk voor. Giet PDMS in een 12 of 24 well plate.
Zodra de PDMS is uitgehard, verwijdert u deze met een naald. Snijd nu gaten in het midden van de schijven om ringen te maken, die als malondersteuning werken. Plaats nu een malondersteuning in het midden van de MEA en bedek het buitenste blootgestelde oppervlak van de MEA.
Laat dit twee uur op kamertemperatuur bezinken. Aspireer vervolgens de PDL-was, het buitenste blootgestelde oppervlak van de MEA met gedistilleerd water en verwijder de malondersteuning zodat de MEA kan drogen. Bevestig nu een stencil aan een voorbereide micromanipulator onder een omgekeerde microscoop.
Inspecteer en lijn de gepatroneerde structuur uit om overeen te komen met de elektroden van de MEA. Gebruik vervolgens de micromanipulator om de stencil naar het MEA-oppervlak te laten zakken. Zodra deze is bevestigd, heft u de microm manipulator op en gebruikt u eventueel pincetten om een kleine hoeveelheid druk uit te oefenen om te voorkomen dat de PDMS loslaat.
Breng nu de MEA over naar de vacuümkamer gedurende 15 minuten. Breng vervolgens een druppel van een milliliter PDL aan op de stencil en breng terug naar de vacuümkamer voor twee cycli van 20 minuten. Laat de PDL de volgende dag een nacht drogen.
Verwijder de P DM S stencils uit de meas met behulp van pincetten. Steriliseer tenslotte de meas gedurende zeven minuten met UV. Ze zijn dan klaar voor de cellen in de voorbereiding van kweekcellen en het bereiden van suspensies zoals in het tekstprotocol.
Nadat Resus het vereiste aantal cellen heeft gesuspendeerd, plateert u ze in het midden van het gepatroneerde gebied op de MEA of het dekglas. Een MEA moet worden geladen met volumes van 100 microliter en een dekglas. Biedt plaats aan 1000 microliter.
Incubeer de plaatcellen gedurende 40 minuten, voeg vervolgens plateermedium toe om de cellen elke vier dagen te onderhouden. Voeg vers gesupplementeerd groeimedium toe. Na de zesde of zevende dag zouden neuronale verbindingen tussen de modules op dat moment moeten beginnen te vormen.
Verdun het kweekmedium met een anti-mitotisch middel om overmatige groei van gli
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een protocol om in vitro modulaire netwerken te kweken die bestaan uit ruimtelijk beperkte, functioneel onderling verbonden neuronale circuits. Dit wordt bereikt door PDMS-sjablonen voor te bereiden om een eiwitlaag te patroneren die cellulaire adhesie op het kweeksubstraat bevordert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- In vitro neuronale netwerken zijn essentieel voor het bestuderen van neuronale connectiviteit.
- Ruimtelijke begrenzing van neuronale circuits kan de functionele interconnectiviteit verbeteren.
- Cellulaire adhesie is cruciaal voor een succesvolle neuronale groei.
- PDMS-stencils worden veelvuldig gebruikt voor het patroonvormen in celculturen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het creëren van modulaire neuronale netwerken in vitro.
- Om de elektrofysiologische eigenschappen van deze netwerken te onderzoeken.
- Om spontane verbindingen tussen geplaatste neuronen te vestigen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van PDMS-stencils voor eiwitpatronering.
- Reinigen van kweeksubstraten zoals petrischalen en dekglasjes.
- Aanbrengen van PDMS-stencils op het substraat om adhesiepatronen te creëren.
- Uitplaten van neuronale gliacellen op het gepatroneerde substraat.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van ruimtelijk beperkte neuronale circuits.
- Demonstratie van spontane verbindingen tussen neuronen.
- Elektrofysiologische activiteit waargenomen in de gecultiveerde netwerken.
- Validatie van het protocol voor toekomstige studies naar neuronale connectiviteit.
Conclusies
- Het protocol creëert effectief modulaire neuronale netwerken in vitro.
- Ruimtelijke beperking verbetert de functionele interconnectiviteit.
- Deze methode kan worden gebruikt voor verdere elektrofysiologische studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze in vitro modulaire methode voor neurale netwerken maakt nauwkeurige ruimtelijke controle over neuronale assemblages mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij de validatie van targets voor geneesmiddelenonderzoek in de neurowetenschappen. Door functioneel onderling verbonden circuits te vestigen met kwantificeerbare elektrofysiologische en calcium-imaging read-outs, biedt deze aanpak voorspellende zekerheid bij assays voor neuronale connectiviteit. Het adresseert een cruciale uitdaging in de ontdekkingsfase: het modelleren van de dynamiek van hersencircuits om de effecten van verbindingen op netwerksynchronisatie en communicatie te evalueren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de afstand tussen compartimenten te moduleren om de synchronisatie tussen modules te reguleren.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het beoordelen van target engagement via spontane vorming van neurale circuits en de vestiging van functionele netwerken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele via multi-elektrode array-registraties en calcium-imaging om de dynamiek van de netwerkactiviteit te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door reproduceerbare PDMS-sjabloonpatronering en depositie van eiwitlagen voor een consistente cellulaire adhesie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt afstemming van translationele biomarkers door de connectiedichtheid te correleren met het voorkomen van synchronisatie, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Faciliteert de continuïteit van preklinische modellen door observatie mogelijk te maken van neurale verbindingen die zich na 6-7 dagen in vitro vormen en stabiliseren tegen dag 14.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothesetesten van neuronale communicatiedynamiek mogelijk te maken, waarbij de resultaten direct bijdragen aan lead-identificatie via netwerkactiviteitsprofielering.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door gecontroleerd onderzoek mogelijk te maken naar hoe verbindingsdichtheid de inter-modulaire synchronisatie in modulaire netwerken reguleert.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde oppervlaktebehandelings- en cellenplaatprotocollen die een reproduceerbare neuronale aanhechting aan PDL-gepatroneerde gebieden garanderen.
- Analytics: Biedt elektrofysiologische spike-detectie en metingen van het begin van calciumgebeurtenissen, waardoor kwantitatieve vergelijking van intra- en inter-cluster synchronie onder verschillende experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische validatie door de spontane vorming van functionele netwerken aan te tonen die de principes van in vivo circuitcommunicatie weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor het patroneren van neuronale netwerken over diverse substraten (dekglaasjes, MEA's) ter ondersteuning van herhaalde screeningscampagnes en target-validatiestudies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neuronale targets door een controleerbaar systeem te bieden om te bestuderen hoe structurele topologie de functionele connectiviteit beïnvloedt.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via vacuüm-ondersteunde PDL-coating en UV-sterilisatiestappen die een consistente oppervlaktepreparatie over verschillende experimenten waarborgen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door dosis-responstests van verbindingen op netwerksynchronisatie mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium van CNS-medicijnontwikkeling worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door connectiviteitsafhankelijke synchronisatiedrempels te kwantificeren, wat bijdraagt aan het mechanistische de-risking van neuronale targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van microfluïdische stencils, neurale celkweek en elektrofysiologische/optische registratietechnieken.
- Is afhankelijk van toegang tot spin-coatingapparatuur, vacuümkamers, UV-sterilisatoren, multi-elektrode arrays en calcium-imaging-systemen.
- Maakt cross-team standaardisatie van stencilontwerp, eiwitcoatingsprotocollen en plating-dichtheden noodzakelijk om interlaboratorium reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Omvat aanpassingen voor verschillende neuronale subtypen of gliale co-kweekverhoudingen om netwerkstabiliteit te behouden en overgroei te voorkomen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van een nauwkeurige uitlijning van het stencil op de MEA-elektroden en de afhankelijkheid van de PDMS-kenmerkmaat voor het definiëren van de dimensies van het circuit (bijv. 300 micron vierkante modules).
