Name: Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een driedimensionaal volledig dikte huidequivalent genereren met een geautomatiseerd wondapparaat voor huidbiologie. Deze methode maakt gestandaardiseerde wonden in een steriele omgeving mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken het Fraunhofer ISC voor de samenwerking met betrekking tot de constructie van het geautomatiseerde verwondingsapparaat. Het project werd opgericht door het interne Fraunhofer-project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).

OPMERKING: Het protocol is ontworpen voor de productie van 24 volledige dikte huid equivalenten. Humane dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten werden geïsoleerd uit huidbiopsies volgens een eerder gepubliceerde protocol. 21,22 Informed consent werd vooraf verkregen en de studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie op de menselijke onderzoek van het Julius-Maximilians-Universität Würzburg (182 stemmen / 10). 1. De productie van Dermal Component <ol><li> Los collageen met 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van 6 mg / ml. Voor de gel neutralisatieoplossing, meng 232,5 2x ml DMEM, 7,5 ml foetaal kalfsserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml chondroïtinesulfaat (5 mg / ml). Houd gel neutralisatieoplossing en collageen oplossing op ijs. Bereken 500 pi gel per insert / huid equivalent. OPMERKING: Als de gel neutralisatie oplossing zal worden gemengd met twee delen van collageen oplossing preparre dubbele hoeveelheid collageen. </li><li> Plaats 24 inserts in een 24 well plaat. </li><li> Resuspendeer humane dermale fibroblasten (HDF) in 10 ml DMEM, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 270 xg en tel de cellen. Extraheer de benodigde hoeveelheid HDF (5 x 10 4 cellen per 500 ul collageen gel) en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 270 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de HDF voorzichtig in 4 ml gekoelde gel neutralisatieoplossing zonder dat luchtbellen. Vanaf deze stap zorg ervoor om zo snel mogelijk te werken om voortijdig stollen van de collageengels voorkomen. </li><li> Resuspendeer de oplossing met 8 ml collageenoplossing. </li><li> Neem de collageen-cel-mengsel met een multistep-pipet en vul snel 500 pi van mengsel in elke insert. Incubeer de gels gedurende 20 minuten in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om de gels opstijven. </li><li> Dompel de gels in 2 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) per putjeen incubeer het voor 24 uur in een incubator (37 ° C, 5% CO2). </li></ol> 2. Toevoeging van humane epidermale keratinocyten (HEK) <ol><li> Verwijder medium na 24 uur. Los fibronectine humaan eiwit met ultrazuiver water tot een eindconcentratie van 50 ug / ml. Bedek elk dermale equivalent ten 25 pl fibronectine oplossing. Incubeer de gels gedurende 30 minuten in een incubator (37 ° C, 5% CO2). </li><li> Ondertussen resuspendeer de Hek 10 ml KGM-2 en zet celconcentratie 1 x 10 6 cellen / ml met KGM-2 klaar + 5% FCS. Zaad 1 x 10 5 hek op elke gel. Incubeer gels gedurende 45 min in de incubator (37 ° C, 5% CO2) om cellen te hechten. </li><li> Onderdompelen de gels met KGM-2 klaar + 5% FCS en kweken ervan in de incubator (37 ° C, 5% CO2). </li></ol> 3. Cultuur van de volledige dikte van de huid equivalenten (FTSE) <ol><li> Cultuur FTSE voor 6-7 dagenaflopend FCS-concentratie (5%, 2% en 0% FCS). Verander het medium om de 2-3 dagen met de volgende lagere FCS concentratie. Voor deze, volledig te verwijderen het medium en voeg 1,6 ml vers medium. </li><li> Op dag 7, verwijder medium volledig. OPMERKING: Sluit de FTSE oppervlak niet aan met de punt van de pipet terwijl doen. </li><li> Plaats elke voegen in 1 put van een 6 wells plaat met een steriel pincet. Voeg 1,5 ml luchtbrug medium per well, ervoor te zorgen dat u de FTSE oppervlak nat. Veranderen medium om de 2-3 dagen voor een extra 14 dagen. Opmerking: Het niveau van het medium aan de meniscus van de FTSE. </li></ol> 4. Histologische analyse <ol><li> Vaststelling en paraffine-inbedding van de FTSE <ol><li> Verwijder kweekmedium overdragen inzetstukken verse platen met 24 putjes en vast weefsel door toevoeging van 1,6 ml van 4% paraformaldehyde aan elk putje en incubeer de weefsels gedurende 2 uur bij KT. Let op! Paraformaldehyd is giftig, te bewerken onder zuurkast. Overdrachtde FTSE een weefselverwerkingsproces cassette. Verwijder resterende fixatief door wassen met water en uitdrogen van het weefsel met behulp van oplopende ethanolconcentraties. </li><li> Verdeel de huid gelijk door een verticale snede in het midden. Leg de twee stukken in een paraffine gevulde metalen voet vorm met snijvlakken naar beneden. Voeg de weefselcassette bovenop de mal als rug. </li><li> Snijd 3-5 micrometer plakjes en drijven ze op een 40 ° C waterbad voor straighten, monteren op geschikte microscoop dia dia&#39;s. Droge plakjes grondig. </li></ol></li><li> Hematoxyline &amp; eosine (H &amp; E) en immunohistochemische (IHC) kleuring <ol><li> Plaats glijdt in rek en incubeer 1 uur bij 60 ° C. Zorg ervoor dat paraffine gesmolten. Vlek gerehydrateerde plakjes met H &amp; E als een gestandaardiseerd overzicht vlekken. </li><li> Voor H &amp; E kleuring bereiden 4x glas kleuring cuvetten met xyleen, 3x met ethanol 96%, 2x met ethanol 70%, 1x met ethanol 50%, 4x gedemineraliseerd water, 1x hematoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% ethanol), 1x tabblad water, 1x eosine (1 g eosine in 100 ml gedemineraliseerd water) en 2x 2-propanol. </li><li> Plaats de glaasjes 10 min in xyleen I en 10 min in xyleen II bij deparaffinize en rehydrateren glijbanen. Dip glijdt 3x in ethanol 96% I, 3x in ethanol 96% II, 3x in ethanol 70% en 3x in ethanol 50%. Draai dia&#39;s in gedemineraliseerd water. Om hematoxylin dye, dip 2x in HCl-ethanol te differentiëren. Spoelen met gedemineraliseerd water. Voor blauwen, plaats schuift 5 min in tabblad water. Voor eosinekleuring, plaats schuift 1 min in eosine en was daarna in gedeïoniseerd water. Voor dehydratatie, dip slides 2x in ethanol 70%, 2x in ethanol 96% en plaats ze gedurende 5 min in 2-propanol I, gedurende 5 min in 2-propanol II, 5 minuten in xyleen I en 5 min in xylol II. Na H &amp; E kleuring, zijn celkernen gekleurd in blauw, cytoplasma en extracellulaire matrix zijn gekleurd in het rood. </li><li> Voor antigen retrieval, verwijderen paraffine met xyleen en rehydrateren plakjes voor het kleuren. Plaats plakjesin de stoomkoker en kook gedeparaffineerde en gehydrateerd plakken voor 20 min in voorverwarmde 10 mM citraat buffer (pH 6). </li><li> Plaats de glaasjes in wassen (PBS-buffer + 0,5% polysorbaat 20) en cirkel plakken met een vloeistof afstotende dia viltstift of diamant stylus. </li><li> Plaats dia&#39;s in een vocht kamer. Blokkeren endogene peroxidase, met toevoeging van 100 pi 3% waterstofperoxide-oplossing op elke plak. Let op! Zeer gevaarlijk in geval van huid- en oogcontact. Handvat met persoonlijke beschermingsmiddelen. Wassen glijdt bij het wassen buffer. </li><li> Breng primair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was dia driemaal met wasbuffer. Vanaf hier moeten de monsters in het donker worden bewaard. </li><li> Met biotine-streptavidine detectiesysteem voor detectie van antigeen-antilichaambinding. </li><li> Tegenkleuring kernen met hematoxyline gedurende 1 minuut. Uitdrogen en mount dia&#39;s. </li><li> Afbeelding monsters met behulp van een omgekeerde microscoop. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Letsel door gebruik van de Automated Verwonden Device (AWD) <ol><li> Bereid de AWD door het desinfecteren van de werkplek met 70% ethanol en ultraviolet licht. Zorg ervoor dat de boorkop van de gewenste grootte (bijvoorbeeld 1 mm) wordt bevestigd. </li><li> Plaats huid equivalenten in aangewezen gebieden van de geautoclaveerd monster draagplaat met behulp van een steriel pincet. Plaats het monster draagplaat in de aansluiting onder de boorkop. </li><li> Gebruik de besturingssoftware te verwonden parameters in te stellen als volgt: rotatie snelheid: 15.000 rpm; penetratie: 1,5 mm; aandrijving: 100 Hz. Deze parameters moeten worden gedefinieerd voor elk monster afzonderlijk. Transfer verwonden parameters tot de AWD. </li><li> Start verwonden procedure. Verwijder monster draagplaat uit het stopcontact. Transfer gewonde FTSE terug in inserts gebruikt voor cultuur met behulp van een steriel pincet. </li><li> Ga verder met de cultuur van de gewonden FTSE in de incubator (37 ° C, 5% CO 2), voor onderzoek naar regeneratie. Alternatively, gebruikt de modellen voor histologische analyse op elk moment. </li></ol>

<ol><li>Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin%3A+an+indispensable+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin: an indispensable barrier.</a> Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89, 219-229 (2010).</li>
<li>Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wound+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Clin%22%5BJournal%5D)">The wound healing process.</a> Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).</li>
<li>Cory, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch-wound+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scratch-wound assay.</a> Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).</li>
<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).</li>
<li>Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+in+vitro+model+of+tissue-engineered+human+skin+to+study+keratinocyte+attachment+and+migration+in+the+process+of+reepithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization.</a> Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).</li>
<li>Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bilayered+living+skin+construct+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a bilayered living skin construct for clinical applications.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).</li>
<li>Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+3D+organotypic+cultures+using+human+neonatal+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells.</a> Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).</li>
<li>Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+substitutes+from+cultured+cells+and+collagen-GAG+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers.</a> Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).</li>
<li>El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+PEGT%2FPBT+as+a+dermal+scaffold+for+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).</li>
<li>Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+growth+regulation+in+fibroblast+cocultures+via+a+double+paracrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).</li>
<li>Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro burn wound model.</a> Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).</li>
<li>Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+wound+model+based+on+the+co-culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+and+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts.</a> Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).</li>
<li>Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+model+of+partial+thickness+scald+burns+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A standardized model of partial thickness scald burns in mice.</a> J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).</li>
<li>Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+type%2C+but+neither+race+nor+gender%2C+influence+epidermal+permeability+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function.</a> Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).</li>
<li>Pilcher, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+collagenase-1+expression+requires+an+epidermal+growth+factor+receptor+autocrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism.</a> J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).</li>
<li>Blank, I. H., Miller, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+the+epidermis+from+the+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of the epidermis from the dermis.</a> J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).</li>
<li>El Ghalbzouri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+facilitate+re-epithelialization+in+wounded+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents.</a> Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).</li>
<li>Vaughan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+laser-wounded+skin+equivalent+model+to+study+the+effects+of+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro.</a> Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).</li>
<li>Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+model+of+wound+healing+based+on+transplanted+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin.</a> Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).</li>
<li>Bell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstitution+of+living+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The reconstitution of living skin.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In vitro cellen gewoonlijk uitgebreid tweedimensionale celculturen, waarbij cellen hechten aan kunststof oppervlakken. Echter, deze kweekomstandigheden niet de fysiologische driedimensionale omstandigheden waarbij cellen groeien in vivo. Onder driedimensionale omstandigheden kunnen cellen natuurlijke cel-cel en cel-matrix aanhangsels samen en migreren in drie dimensies. Vooral in de cutane wondgenezing de gelijkenis van de in vivo situatie is cruciaal om zinvolle gegevens te genereren, zoals c...

De huid is het grootste orgaan van het lichaam. Het creëert een barrière tussen de externe omgeving en de interne organen. Bovendien is de huid beschermt het lichaam tegen vochtverlies, milieu-invloeden, verwondingen en infecties en helpt om de lichaamstemperatuur 1 reguleren. Door zijn open ligging, wordt de huid vaak beïnvloed door mechanische, thermische of chemische trauma. Hoewel de huid is over het algemeen in staat zichzelf te repareren, kan meerdere lokale factoren zoals infectie, zuurstof, en veneuze toereikendheid leiden tot verstoorde wondgenezing. Wondgenezing kan worden gestoord door systemische factoren zoals obesitas, alcoholisme, roken, medicatie, voeding en ziekten zoals diabetes. 2 Het proces van wondgenezing kan worden verdeeld in 3 fasen: (i) de ontstekingsfase, (ii) de proliferatieve en (iii) remodelleringsfase. Bij schade aan de huid, een complex signaal cascade begint, waardoor de sluiting van de wond. 3Na een blessure, wordt de wond bloeden en een bloedstolsel wordt gevormd. Fibroblasten verhuizen naar het bloedstolsel en vervang het door nieuw weefsel dat vervolgens wordt verbouwd door de jaren heen. Het huidige begrip van de biologische processen onderliggende huid herstel beperkt. Kleine dieren en varken modellen zijn gebruikt om wondgenezing te bestuderen. Echter, deze resultaten niet direct worden overgedragen op de mens als gevolg van species-specifieke verschillen. Naast deze in vivo modellen, kunnen bepaalde aspecten van wondgenezing worden bestudeerd door een gewikkelde toestand gesimuleerd door krassen in vitro monolaag kweken gebaseerd op geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen. 4 Deze krassen modellen zijn zeer gestandaardiseerd, maar onvoldoende weerspiegelen de in vivo fysiologie. 5 Naast tweedimensionale modellen, zijn driedimensionale humane huid equivalenten ontwikkeld voor dermatologisch onderzoek. De dermale deel van deze modellen zijn gevergoede met behulp van diverse steigers inclusief gedecellulariseerde dermis, 6 collageen hydrogels, 7,8 glycosaminoglycanen 9 of synthetische materialen. 10 Gebruikmakend van deze huid equivalenten, de rol van epitheliale-mesenchymale interacties 11, de re-epithelialisatie, de cellulaire overspraak tussen fibroblasten en keratinocyten en de invloed van verschillende groeifactoren kunnen worden bestudeerd. Bovendien zijn deze modellen zijn nuttig om nieuwe kennis over hoe fibroblasten migreren naar de gewonde gebied en hoe chemotactische factoren beïnvloeden weefselregeneratie te krijgen. 12 Niet alleen genereren van de wondgenezing model zelf is uitdagend, maar ook om vast te stellen een zeer gestandaardiseerde wond model problematisch. Gebruikte technieken om te creëren wonden zijn krastesten, 13 brandwonden, 14 tape slijtage, 15 thermisch letsel, 16 zuig blaren, 17 vloeibare stikstof, 18 lasers, 19 </sup&gt; scalpels, 18 meshers 6 en biopsie stoten. 20 De meeste van deze methoden hebben dezelfde valkuilen. Blessures handmatig geïmplementeerd zijn moeilijk te standaardiseren en te reproduceren tussen meerdere tests. Grootte, vorm en diepte van de wond variëren tussen de studies en daarmee afbreuk doen aan de kwaliteit van de onderzoeksgegevens. Het gebruik van laser voor gedefinieerde huid verwonden kan relatief eenvoudig worden gestandaardiseerd, maar leidt tot een situatie nabootsen van brandwonden. Heat van laser toegepast kan eiwitdenaturatie, bloedplaatjes aggregatie of vaartuigen vernauwing, wat kan leiden tot necrotisch weefsel. In een alternatieve benadering, een geautomatiseerde verwonding apparaat (AWD), die ons in staat stelt om te definiëren en de huidwonden onder steriele omstandigheden te genereren ontwikkelden we. Verwonding parameters, zoals diepte en snelheid van penetratie en toerental van de boorkop kan worden geregeld. In deze studie hebben we gecombineerd de AWD met in eigen huis ontwikkelde volledige dikte van de huid equivalenten (ftSE) die vergelijkbaar zijn met een protocol gepubliceerd door Gangatirkar et al. 8 de dermale laag van de huid equivalent uit humane dermale fibroblasten (HDF), die zijn ingebed in een collageen I hydrogel. Op de huid laag, humane epidermale keratinocyten (HEK) zijn gezaaid. Binnen twee weken aan de lucht-vloeistof-interface van de HEK opbouwen van een epidermis bestaat uit meerdere vitale cel lagen en een hoornlaag. Naast de generatie van dit model, deze studie toont het gebruik van de AWD te definiëren en de wonden te creëren in de FTSE.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid)</td><td>Produced in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human Protein, Plasma (50&nbsp;&micro;g/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>Nunc</td><td>140627</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Nunc</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Fibroblasts culturing (500 ml):</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Bio &amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>10% (50 ml)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Keratinozyten culture medium (500 ml):</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Gel neutralization solution (250 ml):</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td>93% (232.5 ml)</td></tr><tr><td>Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage</td><td>Sigma</td><td>C4384-1g</td><td>1% (2.5 ml)</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Bio &amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>3% (7.5 ml)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3375-1kg</td><td>3% (7.5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Skin model submers medium (500&nbsp;ml):</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Bio &amp; Sell</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>5%-2% (25 ml-10 ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Skin model air-liquid interface medium (500 ml):</td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td>adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td>CaCl2 (300 mM)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902-500g</td><td>0.62% (3.1 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Histology:</td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>CK14 antibody</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>HPA023040-100&micro;l</td><td></td></tr><tr><td>CK10 antibody</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab81468</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">H&amp;E staining:</td></tr><tr><td>Mayer&acute;s Haemalaun</td><td>AppliChem</td><td>A0884,2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296325-4X2L</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-4X2.5L</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1289-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en automated verwonden

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro modellen zijn een kosteneffectieve en ethische alternatief om cutane wondgenezingsprocessen te bestuderen. Bovendien, door het gebruik van menselijke cellen, reflecteren deze modellen de menselijke wondsituatie beter dan diermodellen. Hoewel twee-dimensionale modellen wijd gebruikt worden om processen zoals cellulaire migratie en proliferatie te onderzoeken, zijn meer complexe modellen vereist om een diepere kennis over wondgenezing te verkrijgen. Naast een geschikt modelsysteem, is het genereren van nauwkeurige en reproduceerbare wonden cruciaal om vergelijkbare resultaten te garanderen tussen verschillende testruns. In deze studie wordt de generatie van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent gedemonstreerd om wondgenezing te bestuderen. Het dermale deel van de modellen bestaat uit humane dermale fibroblasten ingebed in een rat-staart collageen type I hydrogel. Na inoculatie met humane epidermale keratinocyten en daaropvolgende cultivering aan het lucht-vloeistof-interface, wordt een meerlagige epidermis gevormd bovenop de modellen. Om het wondgenezingsproces te bestuderen, hebben we bovendien een geautomatiseerd wondapparat ontwikkeld, dat gestandaardiseerde wonden genereert in een steriele atmosfeer.

De geïsoleerde HDF en HEK verschillen zowel in morfologie en in de expressie van de typische markers. De HDF toonde typische spindel-vormige morfologie, terwijl de morfologie van Hek kan worden beschreven door een geplaveide morfologie. De cellen werden gekarakteriseerd door immunohistochemische kleuring (figuur 1) alvorens ze voor FTSE. De HDF zijn positief voor vimentine (figuur 1A), een marker voor fibroblasten. Primaire HEK zeer uiten vroege differentiatie eiwit cytokeratine-14 <str...

Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Het algemene doel van deze procedure is het opbouwen van een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte, dat lijkt op natuurlijke huid, en het aanbrengen van precieze en reproduceerbare wonden onder steriele omstandigheden met behulp van een geautomatiseerd wondingsapparaat. Dit wordt bereikt door eerst primaire humane dermale fibroblasten in een collageen 1-hydrogel in te bedden. Vervolgens worden primaire humane epidermale keratinocyten op de bovenkant van de met fibronectine gecoate hydrogel geplaatst.Vervolgens wordt het model gekweekt onder ondergedompelde omstandigheden en daarna onder een lucht-vloeistofinterface, waarbij een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte wordt gevormd, bestaande uit een dermale component en een meerlaagse epidermis. Ten slotte wordt er in een steriele omgeving een gestandaardiseerde wond aangebracht. Uiteindelijk worden immunohistochemische kleuring en microscopie gebruikt om de histologische structuur van het gewonde huidequivalent van volledige dikte te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals diermodellen, is dat het huidequivalent van volledige dikte is samengesteld uit primaire menselijke cellen. In combinatie met het geautomatiseerde wondapparaat kunnen we dus gestandaardiseerde wonden creëren, waardoor het geautomatiseerde wondapparaat inzicht kan bieden in wondgenezingsprocessen van de huid in een gehumaniseerde omgeving. Het kan ook worden toegepast op onze systemen voor bijvoorbeeld bone tissue engineering.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over wondgenezing, zoals biologische processen, de onderliggende huidherstelmechanismen en de cellulaire communicatie tussen de epidermale en dermale componenten. Begin met het oplossen van collageen in 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van 6 mg/mL. Bereid een gelneutralisatie-oplossing door 232,5 mL 2X DMM, 7,5 mL FCS, 7,5 mL 3 M HEPES en 2,5 mL van 5 mg/mL te mengen.Plaats chondroïtinesulfaat-inzetten in de putjes van een 24-wells plaat, detach menselijke dermale fibroblasten (HDF's) en centrifugeer de cel-suspensies vijf minuten lang bij 270 G. Tel de cellen en centrifugeer een aliquoot van 1.200.000 HDF's gedurende vijf minuten bij 270 G. Verwijder het supernatant en gebruik vier milliliter gekoelde gel-neutralisatie-oplossing om de HDF's voorzichtig te resuspenderen zonder luchtbellen te veroorzaken.Resuspendeer de oplossing vervolgens met acht milliliter collageenoplossing. Gebruik daarna een meerkanaalpipet en voeg 500 microliters van het collageen-celmengsel toe aan elk insert. Incubeer de gels in de 24-wells plaat gedurende 20 minuten bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide om de gels te laten stollen.Gebruik vervolgens twee milliliters DMM plus 10%FCS per well. Om de gels onder te dompelen, worden de gels 24 uur geïncubeerd. Gebruik ultrapuur water om het humane fibronectine-eiwit op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 50 micrograms per milliliter.Verwijder na een incubatie van 24 uur van de dermale equivalent-gels het medium. Gebruik 25 µL fibronectine-oplossing om elk dermaal equivalent te bedekken en incubeer de gels gedurende 30 minuten. Resuspendeer ondertussen de humane epidermale keratinocyten of HKS in kgm two plus 5% FCS tot een uiteindelijke concentratie van 1 miljoen cellen per liter zaad; zaai 100.000 heeks bovenop elke gel.Incubeer de gels vervolgens 45 minuten om de cellen te laten hechten met kgm two ready plus 5% FCS; zorg dat de cellen ondergedompeld zijn en ga door met de incubatie. Vervang na een incubatie van twee tot drie dagen het medium door 2% FCS, gevolgd door een mediumvervanging zonder FCS twee tot drie dagen later. Verwijder op dag zeven het medium volledig.Gebruik steriele pincetten om elk insert in een putje van een zes-puts plaat te plaatsen. Voeg vervolgens 1,5 milliliters airlift-medium per putje toe. Let er hierbij op dat het oppervlak van de FTSC niet nat wordt.Vervang het medium elke twee tot drie dagen gedurende nog eens 14 dagen. Bereid het automatische wondingsapparaat voor door het werkvlak met steriele pincetten te desinfecteren met 70% ethanol en ultraviolet licht. Plaats de huidequivalenten in de daarvoor bestemde gebieden van de autoclaaf-monsterdragerplaat.Plaats een monsterdragerplaat in de houder onder de boorkop. Gebruik de besturingssoftware om de wondingsparameters als volgt in te stellen. Draaisnelheid 15, 000 RPM, penetratiediepte 1,5 millimeters.Voortstuwing 100 hertz. Draag de wondparameters over naar het geautomatiseerde wondingsapparaat. Begin met de wondingsprocedure zodra dit is voltooid.Verwijder de monsterdragerplaat uit de houder en gebruik steriele pincetten om het gewonde FTSE terug te plaatsen in het inzetstuk dat voor de kweek is gebruikt. Incubeer het gewonde FTSE tot aan de experimentele evaluatie. De modellen kunnen op elk gewenst moment worden gebruikt voor histologische analyse.De geïsoleerde HDFS en HKS werden gekenmerkt door immunohistochemische kleuring voordat ze werden gebruikt voor FTSE. De HDF zijn positief voor menton, een marker voor fibroblasten; primaire HEK vertonen een hoge expressie van het vroege differentiatie-eiwit CYTOKERATIN 14, maar vrijwel geen expressie van het late keratinocyt-differentiatie-eiwit CYTOKERATIN 10. De FTSE werden zeven dagen gekweekt onder ondergedompelde mediumcondities, gevolgd door 14 dagen aan het lucht-vloeistofgrensvlak.Tijdens dit proces trekt de FTSC binnen 21 dagen aanzienlijk samen. De HEK prolifereren door het mediumniveau zodanig te wijzigen dat het oppervlak van de modellen aan de lucht wordt blootgesteld. Door de calciumconcentratie te verhogen, worden de HKS gestimuleerd om te differentiëren tot een multicellulaire epidermis die is samengesteld uit verschillende vitale cellagen van keratinocyten.In verschillende stadia van D-differentiatie en atrium cornea. Bij het vergelijken van de hematoxyline- en eosinekleuring van FTSE met native menselijke huid, wordt duidelijk dat FTSE de histologische architectuur van de huid nabootst. De HDF in de collageen one-hydrogel kan worden gekleurd met primaire antilichamen tegen vimentine.Daarnaast vormen keratinocyten een epidermale laag die bestaat uit cytokeratine 14-positieve cellen en de marker voor late differentiatie. CYTOKERATINE 10 komt tot expressie in de superbasale lagen. Bovendien is het stratum corneum positief voor RIN na de ontwikkeling ervan.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de dermatologie om cutane wondgenezing te bestuderen via een gestandaardiseerde in vitro-opstelling die de menselijke huid nauwgezet nabootst.

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the detailed protocol for generating in vitro 3D organotypic skin reconstructs to study melanoma progression. This skin model mimics both the architecture and multicellular complexity of organs in vivo.

Generation of Organotypic Full Skin Reconstructs: A Procedure to Establish 3D Skin Model Using Human Skin Samples

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Tijdens de ontwikkeling van zoogdieren genezen huidwonden in een vroeg stadium van de zwangerschap zonder litteken. Hier beschrijven we een betrouwbaar en reproduceerbaar model van littekenloos wondgenezing bij foetussen in de cutane dorsale regio van E16,5 (zonder litteken) en E18,5 (met litteken) muis-embryo's.

Een muis Foetale Skin Model van Scarless Wound Repair

Dit artikel presenteert methoden om een conform, huidachtig elektronisch systeem te fabriceren en te karakteriseren en protocollen voor het gebruik in klinische toepassingen, met name bij het beheer van cutane wonden.

Fabricage en karakterisering van een Conformal Skin-achtige Electronic System for Quantitative, Cutane Wound Management

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om menselijke weefsels te splitsen en micro-autologe transplantaten die in combinatie met collageen sponzen, tot menselijk biologisch complexen klaar voor gebruik in de behandeling van huidletsels te maken. Verder dit systeem bewaart cellevensvatbaarheid van micro-grafts op verschillende tijdstippen na mechanische disaggregatie.

Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

Hier presenteren we goedkope en eenvoudige procedures om verschillende 3D-huidmodellen te introduceren voor routineonderzoek in een celkweeklaboratorium. Onderzoekers kunnen modellen maken die zijn afgestemd op hun behoeften zonder afhankelijk te zijn van in de handel verkrijgbare modellen.

Opbouw van huidmodellen voor tal van toepassingen - van tweedimensionale (2D) monocultuur tot driedimensionale (3D) multicultuur

Leer een driedimensionaal volledig dikte huidequivalent genereren met een geautomatiseerd wondapparaat voor huidbiologie. Deze methode maakt gestandaardiseerde wonden in een steriele omgeving mogelijk.

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Meer video's verkennen