Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Het algemene doel van deze procedure is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid en om nauwkeurige en reproduceerbare wonden te genereren onder steriele omstandigheden met behulp van een geautomatiseerd wondapparatuur. Dit wordt bereikt door eerst primaire humane dermale fibroblasten in een collageen-een hydrogel in te bedden. Vervolgens worden primaire humane epidermale keratinocyten op de bovenkant van het fibronectine-gecoate hydrogel geplaatst.

Vervolgens wordt het model onder gedompelde omstandigheden gekweekt en vervolgens onder een lucht-vloeistofinterface wordt een driedimensionale huidequivalent van volledige dikte gevormd, bestaande uit een dermale component en een meerlaagse epidermis. Ten slotte wordt in een steriele omgeving een gestandaardiseerd wond gegenereerd. Uiteindelijk wordt immunohistochemische kleuring en microscopie gebruikt om de histologische structuur van het gewonde huidequivalent van volledige dikte te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals diermodellen, is dat het huidequivalent van volledige dikte bestaat uit primaire humane cellen. Dus samen met het geautomatiseerde wondapparatuur kunnen we gestandaardiseerde wonden genereren. Dus het geautomatiseerde wondapparatuur kan inzicht geven in huidgenezingsprocessen in een gehumaniseerde omgeving. Het kan ook worden toegepast op onze systemen zoals botweefsel engineering.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over wondgenezing, zoals biologische processen, onderliggende huidherstel en de cellulaire crosstalk tussen de epidermale en dermale component. Om te beginnen lost u collageen op met 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van zes milligram per milliliter. Bereid een gelneutralisatieoplossing voor door 232,5 milliliter van twee X dmm, 7,5 milliliter FCS, 7,5 milliliter drie molaire hees en 2,5 milliliter van vijf milligram per milliliter te mengen.

Chondroitinsulfaat plaats inzetstukken in de putjes van een 24-putjesplaat los humane dermale fibroblasten of HDFS en centrifugeer de celsuspensies gedurende vijf minuten. Bij 270 G tel de cellen en centrifugeer een Eloqua van 1.200.000 HDF gedurende vijf minuten. Bij 270 G verwijder de snat en gebruik vier milliliter gekoelde gelneutralisatieoplossing om de HDF voorzichtig te resuspenderen zonder luchtbellen te veroorzaken.

Vervolgens resuspendeert u de oplossing met acht milliliter collageenoplossing. Gebruik vervolgens een multi-stapspipet en voeg 500 microliter collageencelmengsel toe aan elke inzet. In de 24-putjesplaat incubeert u de gels gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de gels te laten stollen.

Gebruik vervolgens twee milliliter DMM plus 10% FCS per put. Om de gels te laten onderdompelen, incubeer de gels gedurende 24 uur. Gebruik ultrapuur water om humaan fibronectine-eiwit op te lossen tot een eindconcentratie van 50 microgram per milliliter.

Na het incuberen van de dermale equivalente gels gedurende 24 uur, verwijdert u het medium. Gebruik 25 microliter fibronectineoplossing om elke dermale equivalent te bedekken en incubeer de gels gedurende 30 minuten. Ondertussen resuspendeert u de humane epidermale, keratinocyten of HKS met kgm twee plus 5% FCS tot een eindconcentratie van 1 miljoen cellen per liter zaad, 100.000 heeks bovenop elke gel.

Vervolgens incubeert u de gels gedurende 45 minuten om cellen te laten hechten met behulp van kgm twee klaar plus 5% FCS gedompelde cellen en vervolg de incubatie. Na incubatie gedurende twee tot drie dagen, vervangt u het medium met 2% FCS gevolgd door mediumvervanging zonder FCS, twee tot drie dagen later. Op dag zeven verwijdert u het medium volledig.

Gebruik steriele pincetten om elke inzet in één put van een zes-putjesplaat te plaatsen. Voeg vervolgens 1,5 milliliter airliftmedium per put toe. Zorg ervoor dat u het oppervlak van de FTSC niet nat maakt.

Ververs het medium om de twee tot drie dagen gedurende een bijkomende 14 dagen. Bereid het geautomatiseerde wondapparatuur voor door 70% ethanol en ultraviolet licht te gebruiken om het werkgebied te desinfecteren met behulp van steriele pincetten. Plaats huidequivalenten in aangewezen gebieden van de autoclaafsteekproefdragerplaat.

Plaats een steekproefdragerplaat in de holte onder de boorkop. Gebruik de besturingssoftware om de wondparameters als volgt in te stellen. Spin snelheid 15.000 RPM penetratie, 1,5 millimeter.

Aandrijving 100 hertz. Breng de wondparameters over naar het geautomatiseerde wondapparatuur. Begin met de wondprocedure wanneer klaar.

Verwijder de steekproefdragerplaat uit de holte en gebruik steriele pincetten om de gewonde FTSE terug in de inzet te brengen die voor het kweken is gebruikt. Incubeer de gewonde FTSE tot experimentele evaluatie. Gebruik de modellen voor zijn histologische analyse op elk moment.

De geïsoleerde HDFS en HKS werden gekenmerkt door immunohistochemische kleuring voordat ze voor FTSE werden gebruikt. De HDF zijn positief voor menton, een marker voor fibroblasten primaire HEK die hoog differentiatie-eiwit CYTOKERATIN 14 tot expressie brengen, maar bijna geen late keratinocyten differentiatie-eiwit CYTOKERATIN 10. De FTSE werden gedurende zeven dagen onder gedompelde mediumcondities gekweekt, gevolgd door 14 dagen bij de lucht-vloeistofinterface.

Tijdens dit proces contracteert de FTSC binnen 21 dagen significant. De HEK prolifereren door het mediumniveau op een zodanige manier te wijzigen dat het oppervlak van de modellen wordt blootgesteld aan lucht. En door de calciumconcentratie te verhogen, worden de HKS gestimuleerd om te differentiëren in een meercellige epidermis die bestaat uit verschillende vitale cellagen van keratinocyten.

In verschillende toestanden van D-differentiatie en atrium corneum. Het vergelijken van de hematine en eosinekleuring van FTSE met inheemse menselijke huid, wordt het duidelijk dat FTSE de histologische architectuur van de huid nabootst. De HDF in de collageen-een hydrogel kan worden gekleurd met primaire antilichamen tegen vimentin.

Bovendien vormen keratinocyten een epidermale