Name: Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer biofilm-omgevingsinteracties karakteriseren met een microfluidische flowcel met dubbele inlaat. Deze methode maakt 3D confocale microscopie en deeltjesvolg-analyse mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Matt Parsek aan de Universiteit van Washington (Seattle, WA) voor het verstrekken van P. aeruginosa en E. coli-stammen en Roger Nokes aan de Universiteit van Canterbury (Nieuw-Zeeland) voor het verschaffen van toegang tot Streams software. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​R01AI081983 van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. Confocale beeldvorming werd uitgevoerd bij de Northwestern Biologische Imaging Facility (BIF).

1. Flow Cell Setup en Enting . OPMERKING: Gebruik een dubbel-inlaat microfluïdische stroom cel in Song et al, 2014 14 tot biofilms groeien. Deze stroom cel is in staat om goed gedefinieerde gladde chemische gradiënten creëren. De stroomcel ontwerp wordt getoond in figuur 1 en stroomcel fabricage is eerder beschreven Song et al., 2014 14. Hier detail we door gebruikmaking P. aeruginosa en E. coli biofilms te vormen, maar andere soorten kunnen ook geschikt zijn. We gebruikten P. aeruginosa PAO1- gfp, die constitutief brengt een groen fluorescerend eiwit (GFP) als modelorganisme voor biofilm ontwikkeling. Daarnaast gebruikten we E. coli DH5a naar mixed-species biofilms met P. vormen aeruginosa. P. aeruginosa en E. coli stammen werden gekweekt op LB-agarplaten. <ol><li> Bereid de stroom cel met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan eendekglaasje via zuurstofplasma behandeling zoals beschreven in 14. De afmetingen van de stroomcel kamer zijn 23 mm x 13 mm x 0,24 mm (lengte x breedte x diepte). </li><li> Bereid gewijzigd FAB groeimedium 15. Om biofilmgroei observeren onder een voedingswaarde gradiënt binnen de stroom cel, introduceren gewijzigd FAB medium 15 met 0,6 uM glucose in één inlaat en FAB medium invoeren, zonder dat koolstofbron door de andere inlaat. Filter-steriliseren (poriëngrootte = 0,2 pm) van de glucose-stockoplossing (60 mM) alvorens het aan het FAB medium. Ook autoclaaf de FAB medium met cyclus 1 (vloeistof, 15 min; 121 ° C, 17 psi) voor gebruik. </li><li> Steriliseren van de stroom systeem. Voorafgaand aan inoculatie autoclaaf de gehele stroombaan (gemiddeld flessen, buizen, bel vallen, stroom cellen) met cyclus 1, behalve de kunststof driewegkleppen (wegwerp en vooraf gesteriliseerde) stroomopwaarts van de stroomcel. (Drie manieren kleppen worden gebruikt voor het injecteren Cell Cultuur, fluorescerende tracer en microkraaltjes.) Om besmetting tijdens de montage te voorkomen, hebben betrekking op alle slangen en connector openingen met aluminiumfolie of autoclaafzakken voor het autoclaveren. </li><li> Sluit de stroom systeem. Monteer de componenten van de stroom celsysteem voorzichtig (zie Video stroomsysteem montage) en leveren groeimedium aan de stroomcel via een peristaltische pomp die precies regelt de stroomsnelheid. </li><li> Bereid celcultuur voor inenting door de overdracht van een kolonie van P. aeruginosa of E. coli van LB platen 3 ml LB bouillon en schud de cultuur O / N bij 225 rpm en 37 ° C. Verdun de O / N celkweken in 1 ml gesteriliseerd water tot een uiteindelijke OD600 = 0,01 in het inoculum. (Cultuur en verdun de bacteriën in een laminaire stroming kap om besmetting te voorkomen.) </li><li> Voor de experimenten met gemengde species biofilms verdunnen twee bacterieculturen tot een verhouding van 1: 1 in 1 ml met een equivalente OD 600 = 0,01 voor elke bacterie. </li><li> Inoculeer de stroom cel. Injecteer 1 ml van het inoculum aan de stroomcel toevoer van de driewegklep. Na de injectie onderbreken de stroom gedurende 1 uur om bacteriële cellen te hechten aan het dekglas. (Zorg ervoor dat de stroom cel wordt geplaatst met het dekglaasje kant naar beneden te laten opgeschort cellen om zich te vestigen op het dekglaasje.) </li><li> Na 1 uur hervat de stroom en pomp het groeimedium naar de stroomcel met een constante snelheid van 0,03 ml / min voor elke inlaat voor 3 dagen. </li></ol> 2. Kenmerkend Biofilm ontwikkeling in reactie op Nutrient Verlopen Met behulp van confocale microscopie OPMERKING: P. aeruginosa kan worden afgebeeld met constitutief tot expressie gebracht GFP, maar E. coli in mixed-species biofilms moet worden afgebeeld door tegenkleuring. <ol><li> Let op de 3-daagse biofilms met behulp van confocale microscopie. Voor de representatieve resultaten, observeren biofilms met een confocale microscoop met een 63x objectief. Voorafgaand aan de beeldvorming, markde dubbele inlaat stroom cel met een raster op de cover glas kant. (Het doel van dit netwerk is om de experimentator om de beeldvorming regio&#39;s te lokaliseren binnen de stroom cel kamer.) </li><li> Om tegenkleuring, verdunnen 10 ul van cel-permeant rode fluorescerende nucleïnezuur vlek, zoals groen fluorescerend nucleïnezuur vlek zoals STYO 62, stockoplossing (1 mM) in 990 pi gesteriliseerd water en dan langzaam te injecteren de verdunde vlek met behulp van een injectiespuit in de stroomcel kamer uit de stroomopwaartse driewegklep. Houd de doorstroomcel stagnerende en in het donker gedurende 30 min, vervolgens opnieuw de stroom te spoelen ongebonden kleurstof gedurende 15 min. </li><li> Voeren confocale beeldvorming. Activeer de 488 nm Argon laser voor excitatie en de uitstoot verzamelen kanalen voor GFP (500-535 nm) en nucleïnezuur vlek (voor groen fluorescerend nucleïnezuur vlek, 650-750 nm). Pas winsten en offsets voor beide kanalen om heldere en zuivere beelden te hebben. Selecteer xyz en gelijktijdige imaging-modus. Gebruik de z-bedieningsknop naar identify de onderkant en bovenkant van de biofilm op het veld. Stel de z-stap tot 0,5 urn voor het verkrijgen van een 3-D afbeelding stack. (Om een ​​hoge beeldkwaliteit te garanderen, gebruikt u een lijn gemiddeld vier voor het acquisitie.) </li><li> Om de ruimtelijke patronen van biofilm ontwikkeling binnen de stroomcel, stock biofilms kaart met drie of meer lengterichting (x) afstanden langs de stroomcel inlaat en drie dwarse (y) posities ten opzichte van de opgelegde nutritionele verloop, zoals in figuur 1 . </li></ol> 3. Kenmerkend Intern transport van opgeloste stoffen door injecties van Conservatieve TL Tracer OPMERKING: Een conservatieve fluorescerende tracer, zoals Cy5, kan worden gebruikt om stoftransport patronen te detecteren binnen de biofilm. <ol><li> Los Cy5 (Mono Reactive-NHS Ester) in water tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml als een voorraadoplossing. Bewaar de Cy5- voorraad oplossing in een -20 ° C vriezer. OPMERKING: Als Cy5- is licht-SENSITive, op te slaan, te verdunnen en injecteer Cy5 oplossingen in het donker. </li><li> Voorafgaand aan de injectie van de fluorescerende tracer, neem een ​​3-D afbeelding stapel van de 3-daagse biofilm met confocale microscopie (met een 63x objectief). (Wide gebieden van biofilm kolonies zijn ideaal voor tijdreeksen observaties kleurstof transport.) Kies Ook een z-vlak met goed gescheiden kolonies voor beeldvorming (zie figuur 5A). </li><li> Voor elk Cy5 injectie experiment, verdun 2 pi van de Cy5 voorraadoplossing in 998 pi gesteriliseerd water injectievloeistof met een Cy5 concentratie van 20 ug / ml verkregen. </li><li> Stop de pomp om de stroom onderbreken en injecteer het Cy5 oplossing in het stroomopwaartse deel van de stroomcel met een injectiespuit via de 3-wegklep. (Het is belangrijk om luchtbellen te voorkomen dat de stroombaan tijdens het injecteren. Bubble vallen moeten worden opengehouden gedurende het opnieuw injecteren.) </li><li> Na het injecteren van de Cy5 oplossing, sluit de zeepbel vallen, passen de 3-weg klep, en start depompen naar de geïnjecteerde Cy5 oplossing in de stroomcel leveren. </li><li> Schakel confocale imaging-modus om XYT. Activeren Cy5 en GFP-kanalen onder gelijktijdige imaging-modus. Pas confocale instellingen op Cy5- intensiteit (laser intensiteit, gain en offset) om te voorkomen dat het verzadigen van signalen, die van cruciaal belang voor de kwantificering. (Hoge temporele resolutie heeft de voorkeur voor het visualiseren van de kleurstofpenetratie. Echter, snel scannen vermindert de beeldkwaliteit.) Kies de juiste scansnelheid en lijn gemiddeld om de tijd resolutie van beeldvorming en de beeldkwaliteit in evenwicht te brengen. Voor dit protocol gebruiken een lijn gemiddelde van vier en een frame rate van 0,15 Hz. </li><li> Hervat de stroom naar Cy5 geven in de stroomcel (nog steeds bij een stroomsnelheid van 0,03 ml / min). Tegelijkertijd starten tijdreeksen confocale beeldvorming. </li><li> Kwantificeren Cy5- penetratie door radiaal gemiddeld Cy5- intensiteit binnen een 2-D ronde biofilm kolonie. Om gemiddeld eerst de rand van een biofilm cluster identificeren vervolgens een afstand kaart voor een 2-D gedeelte van de clusterEn tenslotte gemiddelde radiale patronen van Cy5 intensiteiten penetratie curve (zie figuur 6) te genereren. <ol><li> Om computationeel realiseren stap 3.8, gebruiken BioSPA (Biofilm Ruimtelijke Pattern Analysis) softwarepakket (ongepubliceerd, software en handleiding beschikbaar op aanvraag) of andere beeldanalyse programma. </li><li> Om BioSPA gebruiken, eerst importeren een beeld geplaatst in BioSPA. Selecteer vervolgens de juiste drempel voor GFP en Cy5 kanalen om binaire beelden te maken. In de analyse / berekening menu, selecteer Geavanceerde Analyse en vervolgens Diffusion Analysis. Gebruik de GFP kanaal naar de rand van een cluster definiëren en gebruik het vormgereedschap een cluster als het gebied van belang (ROI) te selecteren. </li><li> Dubbelklik op de geselecteerde biofilm cluster diffusie analyses uit te voeren. Sla de verspreiding analyseresultaten en kalibreren Cy5 intensiteit Cy5 concentratie met behulp van een kalibratiecurve. <ol><li> Om Cy5- concentratie ijklijn opstellen, meten Cy5- intensiteiten over een Cy5 concentration gradiënt onder confocale microscopie. (Cy5 intensiteit en concentratie hebben een lineair verband.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Het karakteriseren van de Omringende Flow Field door Tracking fluorescerende deeltjes OPMERKING: Fluorescerende deeltjes, zoals fluorescerende microbolletjes kunnen worden gebruikt om het stromingsveld karakteriseren om biofilms. Stromingsveld rond biofilms kan worden berekend vanaf het moment-serie observaties van deeltje posities met behulp van Particle Tracking velocimetry software. De hier getoonde resultaten werden verkregen met de Streams 2.02 softwarepakket 16 (software te downloaden en gebruikershandleiding verkrijgbaar bij <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Verdun de fluorescerende microbolletjes (diameter ~ 1 m) in gesteriliseerd water tot een uiteindelijke vaste concentratie van 0,2% en een eindvolume van 0,5 ml. Vortex om ervoor te zorgen dat de microbolletjeszijn goed verspreid. </li><li> Injecteren en leveren de verdunde fluorescerende microbolletjes in de stroom cel volgende procedures uit stappen 3,3-3,5. Zodat een nauwkeurig volgen van de deeltjes pad gebruiken relatief lage stroomsnelheid (0,01 ml / uur voor het deeltje traceerresultaten in dit document). </li><li> Schakel confocale instellingen modus XYT naar deeltje beweging volgen op een z-slice en neem de tijd-serie beelden. (Een frame rate van 1 Hz gebruikt voor representatieve resultaten in deze paper.) Herhaal deeltje injectie en het op verschillende plaatsen z 3-D stromingsveld genereren. </li><li> Pre-proces van de tijdreeksen confocale beelden door het aftrekken van de achtergrond fluorescentie signaal (het signaal in de eerste verworven afbeelding van het beeld set) met behulp van ImageJ (software te downloaden en handleiding beschikbaar op <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) of andere programma&#39;s. </li><li> In ImageJ, open de eerste afbeelding van een afbeelding set en importeer de afbeelding set. Onder Proces / Image Calculator, aftrekken van de eerste afbeelding uit de afbeelding set. Sla de pre-bewerkte afbeelding set. </li><li> Om stroom vectoren, import tijdreeksen confocale beelden in Streams 2,02 berekenen. Onder &quot;Open proces view&quot;, selecteren en uitvoeren &quot;Identificeer deeltjes&quot;. Gebruik de juiste drempel om deeltjes te identificeren. Gebruik 0,5 en 5 micrometer als minimale en maximale diameter van drempels voor 1 micrometer deeltjes. </li><li> Vervolgens onder &quot;Open proces view&quot;, selecteren en uitvoeren &quot;PTV analyse pijplijn&quot; om deeltje paden te genereren. Controleer het deeltje paden om te zien of ze vertegenwoordigen deeltje beweging. Tot slot, selecteren en uitvoeren &quot;Create snelheidsveld&quot; om een ​​stroom vector kaart te genereren. </li></ol>

<ol><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li>
<li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+A+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear%3A+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li>
<li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk%2Fbiofilm+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Convection+around+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%3A+The+Journal+of+Bioadhesion+and+Biofilm+Research%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li>
<li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorption+sites+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li>
<li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Eng-T+Asme%22%5BJournal%5D)">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li>
<li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li>
<li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li>
<li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li>
<li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li>
<li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs%5BTitle%5D)+AND+%22Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li>
<li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li>
<li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li>
<li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li>
<li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We toonden een suite van methoden om drie belangrijke biofilm-omgeving interacties te karakteriseren: biofilm reactie op chemische gradiënten, effecten van biofilm groei op de omliggende stroom micromilieu, en biofilm heterogeniteit als gevolg van interne beperkingen transport. Wij toonden eerst het gebruik van een nieuwe microfluidic stroomcel een goed gedefinieerde chemische helling biofilm ontwikkeling leggen. Een goed gedefinieerde chemische gradiënt binnen de stroomcel genereren, is het...

Micro-organismen hechten aan oppervlakken en vormen biofilms - celaggregaten bevindt in een extracellulaire polymere matrix 1. Biofilms gedragen zich heel anders uit individuele microbiële cellen, omdat biofilms hebben dramatische ruimtelijke heterogeniteit als gevolg van een combinatie van interne beperkingen transport van opgeloste stoffen en ruimtelijke variaties in de celstofwisseling 2,3. Zuurstof en voedingsstoffen concentraties drastisch verlagen op het raakvlak van biofilm en omringende vloeistof en krijgen verder uitgeput binnen in de biofilm 2. Ruimtelijke variaties in biofilm ademhaling en eiwitsynthese kan ook optreden als reactie op gelokaliseerde zuurstof en voedingsstoffen beschikbaarheid 2. In aquatische en bodem omgevingen, de meeste bacteriën wonen in biofilms. Natuurlijke biofilms uit te voeren belangrijke biogeochemische processen zoals fietsen koolstof en stikstof en het verminderen van metalen 4,5. Klinisch, biofilmvorming is responsbaar voor langere pulmonale en urineweginfecties 6. Biofilm geassocieerde infecties zijn zeer problematisch, omdat de cellen in biofilms hebben een extreem hoge weerstand tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met hun planktonische tegenhangers 6. Omdat biofilms zijn belangrijk in uiteenlopende situaties, is een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht op het begrijpen van de omgevingsfactoren die biofilm activiteiten en de ruimtelijke heterogeniteit in biofilms en het omliggende micro regelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat biofilm ontwikkeling sterk wordt gereguleerd door een aantal omgevingsfactoren: biofilms ontwikkelen verschillende morfologie onder verschillende stromingscondities; zuurstof en beschikbaarheid van voedingsstoffen invloed biofilm morfologie; en hydrodynamische shear stress invloed op de bevestiging van planktonische cellen aan oppervlakken en het detachement van de cellen van biofilms 7-9. Verder externe stroming beïnvloedt de levering van substraten into en binnen biofilms 10. De groei van biofilms verandert ook omringende fysische en chemische omstandigheden. Bijvoorbeeld biofilm groei leidt tot lokale uitputting van zuurstof en voedingsstoffen 2; biofilms accumuleren anorganische en organische verbindingen uit de omgeving 11; en biofilm clusters af te leiden stroom en toename oppervlakte wrijving 12,13. Omdat biofilms interactie met hun omgeving in een zeer complexe manieren, is het essentieel om informatie over de biofilm eigenschappen en milieu-omstandigheden gelijktijdig te verkrijgen, en multi-disciplinaire aanpak moeten worden gebruikt om volledig te karakteriseren biofilm-omgeving interacties. Hier presenteren we een reeks geïntegreerde methoden ruimtelijke patronen in microbiële groei in mono-soorten en dual-species biofilms karakteriseren onder een opgelegde voeding gradiënt, en de resulterende wijziging van de lokale chemische en vloeibare micro observeren. We sparst beschrijven het gebruik van een recent ontwikkelde dubbele inlaat microfluïdische stroom cel biofilmgroei observeren onder goed gedefinieerde chemische gradiënten. We demonstreren dan het gebruik van deze microfluïdische stroomcel de groei van beide soorten bacteriën, Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli, in biofilms observeren onder verschillende voedingsomstandigheden. We zien hoe in situ visualisatie van fluorescerende tracer propagatie in biofilm kolonies kunnen worden gebruikt om kwantitatief beoordelen patronen van stoftransport in biofilms. Tenslotte laten we zien hoe microschaal particle volgen velocimetry, uitgevoerd onder confocale microscopie kan worden gebruikt om locale stromingsveld verkrijgen rond de groeiende biofilms.

<table><tbody><tr><td>Peristaltische pomp</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Pompslang 0,50&nbsp;mm OVC, Oranje/Geel</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Driewegkraan met draaibare mannelijke Luer-lock</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation voor het maken van zonnepanelen</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Pyrex middelgrote fles, 1&nbsp;L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>C-FLEX slang</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>1 ml TB-slang</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Polymeerslang</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Steriele Intramedic Luer Stub Adapter</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>PrecisionGlide-naald</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>HACH</td><td></td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Spuitfilters - steriele (0,2 &mu;m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>MAXQ-schuddelaar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Flow cell setup en inoculatie</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat anhydrisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Monobasisch kaliumfosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Calciumsulfaat dihydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>IJzer(II)sulfaat heptahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Mangaan(II)sulfaat monohydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Koper(II)sulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Zinksulfaat heptahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Kobalt(II)sulfaat heptahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Natriummolybdaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Groeimedia</td></tr><tr><td>TCS SP2 Confocal Microscopie</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>Rode fluorescente (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>Streams 2.02</td><td>University of Cantebury</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr></tbody></table>

methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en habitat heterogeniteit

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms zijn oppervlak bevestigd microbiële gemeenschappen die complexe structuren hebben en produceren aanzienlijke ruimtelijke heterogeniteit. Biofilm ontwikkeling wordt sterk gereguleerd door de omringende stroom en voedingswaarde milieu. Biofilm groei verhoogt ook de heterogeniteit van de lokale micro-omgeving door het genereren van complexe stroomvelden en stoftransport patronen. Om de ontwikkeling van heterogeniteit in biofilms en interacties tussen biofilms en hun lokale micro-leefgebied te onderzoeken, we groeiden mono-species biofilms van Pseudomonas aeruginosa en dual-species biofilms van P. aeruginosa en Escherichia coli onder nutritionele gradiënten in een microfluïdische stroomcel. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het creëren van voedingsstoffen gradiënten binnen de stroom cel en voor de teelt en het visualiseren van biofilm ontwikkeling onder deze omstandigheden. We ook aanwezig protocollen voor een reeks optische methoden ruimtelijke patronen kwantificeren biofilmstructuur, stromen distrimies dan biofilms, en massatransport rond en binnen de biofilm kolonies. Deze methoden ondersteunen uitgebreide onderzoeken van de co-ontwikkeling van biofilm en de habitat heterogeniteit.

De dubbele inlaat microfluidic stroomcel maakt waarneming van biofilm groei onder een welbepaalde chemische gradiënt gevormd door het mengen van twee oplossingen binnen de stromingskamer. De resulterende chemische gradiënt werd vroeger waargenomen door kleurstof injectie en in detail gekarakteriseerd door Song et al. 14. Smooth concentratie gradiënten werden gevormd in de dwarsrichting, zoals getoond in figuur 1. Het concentratieprofiel was steil nabij de inlaat heb downstream ontspa...

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties van biofilms met de omringende omgeving te karakteriseren met behulp van geïntegreerde methoden. Er wordt een microfluïdisch flowcell-systeem met een dubbele inlaat geconstrueerd waarin glucosehoudende en glucosevrije media door een flowcell worden gepompt, waardoor een glucosegradiënt ontstaat. Bacteriën worden aan het systeem toegevoegd en biofilms krijgen de gelegenheid om zich gedurende enkele dagen te ontwikkelen.De biofilms worden vervolgens gevisualiseerd met 3D-confocale microscopie om het transport van opgeloste stoffen te karakteriseren. Voor de karakterisering van het stromingsveld rondom biofilmkolonies worden fluorescerende tracers in het stroomsysteem geïnjecteerd en wordt time-lapse imaging uitgevoerd; daarnaast worden fluorescerende microbeads geïnjecteerd gevolgd door time-lapse imaging. Analyse van het transport van opgeloste stoffen en particle tracking van de resulterende data tonen het nut van deze methode aan bij het beoordelen van biofilmprocessen onder verschillende chemische omgevingen binnen één enkel apparaat en in één set experimenten.Het belangrijkste voordeel van deze methoden is dat ze een geli

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te...

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Source: Miquel Guennoc, C., et al. New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the preparation of a fungal culture on treated cellophane membranes to support colony formation and radial growth. It then shows the cultivation and preparation of soil bacterial cells for interaction assays. Finally, it illustrates how bacterial cells adhere to the fungal colony...

Establishing a Fungal-Bacterial Co-culture for Biofilm Formation

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Stroom cytometry in combinatie met visuele clustering biedt een easy-to-use en snelle methode voor het bestuderen van aquatische biofilms. Het kan worden gebruikt voor de karakterisering van de biofilm, de detectie van veranderingen in de structuur van de Gemeenschap van de biofilm, en detectie van abiotische deeltjes ingebed in de biofilm.

Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Microbiële biofilms vormen complexe architecturen in interfasen en ontwikkelen tot zeer Schaalafhankelijke ruimtelijke patronen. Hier introduceren we een experimenteel systeem (hard-en software) voor het automatisch verwerven van 3D optische coherentie tomografie (OCT) datasets. Deze toolset maakt de niet-invasieve en Multi-Scale karakterisatie van biofilm morfogenese in ruimte en tijd mogelijk.

Geautomatiseerde 3D optische coherentie tomografie om biofilm morfogenese te Verheldoen over grote ruimtelijke weegschalen

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

Een snelle en gestandaardiseerde procedure voor het opzetten van synergetische multispecies biofilmgemeenschappen uit verschillende rhizosfeerbodems wordt hier gepresenteerd. Het is een uniek protocol dat is ontworpen om de complexe bodemmicrobiota van de rhizosfeer te onderzoeken en te simuleren.

Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

Leer biofilm-omgevingsinteracties karakteriseren met een microfluidische flowcel met dubbele inlaat. Deze methode maakt 3D confocale microscopie en deeltjesvolg-analyse mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Meer video's verkennen