Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Het algemene doel van deze procedure is om biofilminteracties met de omgeving te karakteriseren met behulp van geïntegreerde methoden. Er wordt een microfluïdisch stromingscelsysteem met dubbele ingang geconstrueerd waarin glucosehoudende en glucosevrije media over een stromingscel worden gepompt om een glucosegradiënt te genereren. Bacteriën worden aan het systeem toegevoegd en biofilms mogen zich gedurende enkele dagen ontwikkelen.

De biofilms worden vervolgens geïmaged door middel van 3D confocale microscopie om solutransport te karakteriseren. Binnen biofilms worden fluorescente tracers in het stromingssysteem geïnjecteerd en tijdsverloopbeeldvorming wordt uitgevoerd om het stromingsveld rond biofilmkolonies te karakteriseren, fluorescente microbeads worden geïnjecteerd en tijdsverloopbeeldvorming wordt uitgevoerd. Solutransport en deeltjesvolganalyse van de resulterende gegevens tonen de bruikbaarheid van deze methode aan bij het beoordelen van biofilmprocessen onder verschillende chemische omgevingen binnen één apparaat en in één reeks experimenten.

Het grote voordeel van deze methoden is dat ze de gelijktijdige beoordeling van meerdere aspecten van interacties van biofilms met de omgeving mogelijk maken. De hier gerapporteerde methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over biofilmvorming in natuurlijke omgevingen of bij biofilmgerelateerde infecties. Werkend in een laminaire stroomkap, breng je een kolonie posa PAO one GFP en een kolonie e coli DH vijf alfa over van een LB-plaat naar aparte buisjes met drie milliliter LB-bouillon.

Incubeer de culturen een nacht bij 37 graden Celsius terwijl je schudt op 225 RPM. Dit stromingssysteem is gebaseerd op een microfluïdische cel met dubbele ingang die observatie van biofilmgroei onder een goed gedefinieerde chemische gradiënt mogelijk maakt, gevormd door het mengen van twee oplossingen in de stromingskamer. Tijdens de stroming wordt een glad concentratiegradiënt gevormd in de transversale richting.

Als gevolg van diffusie is het concentratieprofiel steil dicht bij de ingang en meer ontspannen stroomafwaarts. Op de dag van het experiment, monteer je voorzichtig het stromingssysteem. Klem eerst de slang in de peristaltiekpomp, bevestig vervolgens het ene uiteinde van de slang aan een mediumfles met 900 milliliter FAB-medium met glucose en het andere uiteinde aan een luchtbelval.

Herhaal dit proces om een tweede mediumfles met 900 milliliter FAB zonder glucose te verbinden aan een tweede luchtbelval. Plaats vervolgens driewegkleppen net voor de ingangen van de stromingscel en verbind elk van de luchtbellenvallen met de stromingscel. Verbind tenslotte de uitlaat van de stromingscel met een afvalinflessie.

Zorg ervoor dat de stromingscel wordt geplaatst met de dekselzijde naar beneden om gesuspendeerde cellen te laten bezinken op de deksel. Nadat het stromingssysteem is geassembleerd, zet je de peristaltiekpomp aan met een stromingssnelheid van 10 milliliter per uur voor elke ingang om het systeem te vullen. Met het medium wordt FAB-medium geïntroduceerd in de twee ingangen met glucose alleen aanwezig in één ingang. Vervolgens, werkend in de kap, verdun je de twee bacterieculturen tot een verhouding van één op één in één milliliter steriele water met een gelijkwaardige OD 600 van 0,01 voor elke bacterie om de stromingscel te inoculeren, gebruik een steriele plastic spuit om 500 microliter van het inoculum in elk van de ingangen van de stromingscel te injecteren via de driewegklep.

Na de injectie, stop je de pomp en laat je de bacteriecellen gedurende één uur aan het dekglaasje hechten. Nadat de cellen zich hebben gehecht, stel je de pomp in op 0,03 milliliter per minuut voor elke ingang en laat je het systeem drie dagen stromen bij kamertemperatuur, gedurende welke een biofilm zich ontwikkelt onder een gradiënt van glucoseblootstelling. Na drie dagen gebruik je een stift en een liniaal om een raster op de zijkant van het dekglaasje van de stromingscel te tekenen ter voorbereiding op beeldvorming.

Dit zal helpen bij het lokaliseren van de beeldvormingsregio's om e coli tegenkleuren voor visualisatie. Draai eerst de lichten uit om het werkgebied te verduisteren, aangezien de tegenkleuring lichtgevoelig is. Gebruik een spuit om langzaam één milliliter verdunde cel doorlatende rode fluorescente nucleïnezuurkleuring in de driewegklep stroomopwaarts van de stromingskamer te injecteren.

Stop de stroming. Houd de stromingscel 30 minuten lang stil in het donker. Nadat 30 minuten zijn verstreken.

Hervat de stroming bij 0,03 milliliter per minuut en spoel de vrije kleuring weg gedurende 15 minuten. Stop vervolgens de stroming en observeer de biofilms met behulp van confocale microscopie met een 63 x objectief. Zoek een gezichtsveld met een goede hoeveelheid biomassa met biofilmkolonies die goed gescheiden zijn, zoals hier getoond.

Neem vervolgens 3D-beeldstacks op in de juiste kanalen om de ruimtelijke patronen van biofilmontwikkeling binnen de stromingscel af te beelden, de biofilms op drie of meer longitudinale of X-afstanden langs de ingang van de stromingscel en op drie transversale of Y-posities ten opzichte van de opgelegde voedingsgradiënt. Om solutransportpatronen binnen de biofilm te karakteriseren, begin je met de stromingscel. Na drie dagen biofilmontwikkeling, werk weer in het donker.

Stop de pomp om de stroming te pauzeren, open de luchtbellenvallen om de injectiedruk vrij te geven. Gebruik vervolgens een spuit om één milliliter van een verdunde sci-fi traceroplossing in een van de driewegkleppen stroomopwaarts van de stromingscel te injecteren. Na het injecteren van de sci-fi oplossing, sluit je de luchtbellenvallen.

Stel de driewegklep in en start de pomp opnieuw bij 0,03 milliliter per minuut om de sci-fi oplossing in de stromingscel te leveren. Schakel vervolgens de confocale beeldvormingsmodus in XYT met een framesnelheid van 0,15 hertz. Een hoge tijdsresolutie wordt geprefereerd voor het verbaliseren van de kleuringspenetratie, maar snel scannen vermindert de beeldkwaliteit.