Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle
30 maart 2015
Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.
Het algemene doel van het volgende experiment is om kwantitatieve recombinase-polymerase-vereenvoudiging te gebruiken om de DNA-concentratie van onbekende monsters te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de interne positieve controle van het doel-DNA, DNA-primers en fluorescent gelabelde sondes aan de reactie toe te voegen. Als tweede stap worden de reacties in de real-time PCR-machine geplaatst, die de reacties verwarmt om de enzymen te activeren en de fluorescentie van de sondes bewaakt om de generatie van doel- en controle-amplicons te detecteren.
Vervolgens wordt de fluorescentiegegevens geanalyseerd met behulp van een script om de standaardcurve te genereren en de test te valideren. De resultaten tonen aan dat DNA-monsters nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd binnen één orde van grootte van de juiste concentratie op basis van de validatie-experimenten die werden gebruikt om een HIV een doel-DNA te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals real-time kwantitatieve PCR, is dat RPA isothermisch is, dus er is geen dure thermische cycler nodig.
RPA vereist ook een lagere amplificatie naar temperatuur, is tolerant voor vuile monsters, versterkt het doel tot detecteerbare niveaus binnen enkele minuten en maakt gebruik van lly-enzymen om eenvoudige transport en opslag bij kamertemperatuur mogelijk te maken. Om te beginnen, maak alle werkbladen en apparatuuroppervlakken schoon met een oplossing van 50% bleekmiddel om een schone pre-amplificatiewerkruimte te creëren, verwijder de 280 millimolaire magnesiumacetaatoplossing, de rehydratatiebuffer en de reactiepellets uit de min 20 graden Celsius vriezer en ontdooi de oplossingen bij kamertemperatuur. Monteer vervolgens een mastermix door 383,5 microliter van de rehydratatiebuffer over te brengen naar een nieuwe microfugebuis bij 41,6 microliter nuclease-vrije water naar de buffer en vortex om te mengen bij 35 microliter magnesiumacetaat naar een aparte buis.
Breng het magnesiumacetaat in de rehydratatiebuffer stockoplossingen terug naar de vriezer. Verkrijg vervolgens de primer- en prob-quas uit de koelkast op vier graden Celsius. Plaats ze in de pre-amplificatiewerkruimte en zet het licht uit om lichtblootstelling te minimaliseren bij 27,3 microliter van elk van de 10 micromolar voorwaartse en achterwaartse primers naar de mastermix.
Vervolgens bij 7,8 microliter van de 10 micromolar hex-gelabelde HIV 1D NA.Probe naar de mastermix en vortex de buis. Breng vervolgens de primer en de sonde stockoplossingen terug naar opslagreagentia voor de interne positieve controle die hier kan worden toegevoegd zoals aangegeven in het tekstprotocol om de QRPA-reacties samen te stellen. Plaats eerst de gevriesdroogde enzympellets in afzonderlijke buizen van twee, lage opstaande acht-putjes PCR-buisjes pipet 37,5 microliter van de mastermix in een buis met een pellet.
Roer voorzichtig de inhoud van de buis met de pipettetip om het pellet op te lossen zonder bellen te creëren. Verwijder de tip voorzichtig uit de reactie om verlies van volume te voorkomen en zorg ervoor dat u de pipettetips tussen elke buis verwisselt. Breng de buizen over naar een gekoelde 96-wels koude blok gedurende ten minste vijf minuten om de mastermix af te koelen.
Ondertussen laadt u de thermische cycler software met het protocol en de plaatlay-out zoals aangegeven in het tekstprotocol. Snijd vervolgens twee strips van heldere plastic microseal-kleefmiddelen zodat ze iets breder zijn dan de PCR-buisjes. En verkrijg ook twee platte PCR-buisjesstripdeksels, doseer het HIV een plasmide-sjabloon zoals aangegeven in het tekstprotocol.
En voeg vervolgens 10 microliter van het sjabloon toe aan de juiste PCR-buis. Roer opnieuw voorzichtig de mix met de pipettetip. Voeg vervolgens 2,5 microliter van het magnesiumacetaat toe aan elk buisjekap en plaats vervolgens voorzichtig de doppen op de reactiebuizen zodat ze niet volledig zijn afgesloten.
Het magnesiumacetaat moet duidelijk zichtbaar zijn door de dop. Plaats de PCR-buisjes in een microcentrifuge en centrifugeer de buizen gedurende 10 seconden om al het vocht in de bodem van de buis te verzamelen en eventuele bellen te verwijderen. Het combineren van de magnesiumacetaatoplossing met de mastermix start de QRPA-reactie.
Verwijder snel de PCR-buizen naar de koude blok om de reactie te stoppen. Verwijder vervolgens langzaam de deksels om verontreiniging van de reacties te voorkomen en verzegel de buizen met een heldere microseal-folie. Breng de buizen over naar de thermische cycler volgens de locaties in de plaatlay-out.
Sluit het deksel van de thermische cycler en klik op startrun. Zorg ervoor om een bestandsnaam voor het experiment aan te geven wanneer de run is voltooid. Bekijk de ruwe fluorescentiegegevens en exporteer deze naar een spreadsheet die een bestand met de naam kwantificeringsversterkingsresultaten zal maken.
Om de standaardcurve te bouwen. Download eerst het standaardcurve script, open vervolgens MATLAB of een vergelijkbaar data-analyseprogramma. Open het script en druk op run om het script uit te voeren.
Typ het aantal te analyseren gegevensbestanden in wanneer daarom wordt gevraagd. Typ vervolgens het aantal monsters en het aantal replica's in elk trainingsbestand. In het opdrachtvenster.
Typ de laagste DNA-concentratie in log-gebaseerde 10-kopieën die werd gebruikt om de standaardcurve te bouwen en druk op enter. In het voorbeeld hier. De laagste concentratie is een log gebaseerd op 10-kopieën.
Typ vervolgens het verschil in concentratie tussen elke DNA-standaard in het opdrachtprompt en druk op enter hier. Het concentratie-interval is één log gebaseerd op 10-kopieën. Voer vervolgens de waarde voor de hellingsdrempel in het opdrachtvenster in en druk op enter.
Deze waarde ligt meestal tussen drie en vijf. Typ het aantal standaardafwijkingen boven de achtergrond voor positieve drempel, ook bekend als Z, en druk vervolgens op enter typische Z-waarden variëren van één tot vijf. Specificeer vervolgens het apparaat dat werd gebruikt om de gegevens in dit geval te verzamelen.
Typ één voor de thermische cycler en druk vervolgens op enter. Als er een interne positieve controle is, selecteert u de standaard of een nieuwe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor een real-time recombinase polymerase amplification-assay, ontworpen voor het kwantificeren van DNA-concentraties in monsters. De methode maakt gebruik van een thermocycler of een microscoop met een warmteplaat voor het objectglas, en omvat de ontwikkeling van een interne positieve controle.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biotechnologie
- Moleculaire biologie
- Genomica
Achtergrond
- Kwantitatieve analyse van DNA is cruciaal in diverse biologische onderzoeksvelden.
- Traditionele methoden zoals real-time kwantitatieve PCR vereisen dure thermocyclers.
- Recombinase polymerase amplificatie (RPA) biedt een isothermisch alternatief.
- Interne positieve controles verhogen de betrouwbaarheid van kwantitatieve assays.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het kwantificeren van DNA-concentraties met behulp van RPA.
- Het creëren van een interne positieve controle voor een verbeterde validatie van de assay.
- Het leveren van scripts voor het analyseren van real-time fluorescentiegegevens.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van reactiemengsels met target-DNA, primers en fluorescente probes.
- Gebruik van een real-time PCR-apparaat om de fluorescentie tijdens de amplificatie te monitoren.
- Analyse van fluorescentiegegevens om een standaardcurve te genereren.
- Validatie van de assay door experimenten ter kwantificering van HIV target-DNA.
Belangrijkste resultaten
- De assay kwantificeert DNA-concentraties nauwkeurig binnen één grootteorde.
- Validatie-experimenten bevestigden de effectiviteit van de interne positieve controle.
- RPA vertoonde voordelen ten opzichte van traditionele PCR-methoden.
- Het protocol is toegankelijk voor onderzoekers zonder dure apparatuur.
Conclusies
- De ontwikkelde RPA-assay is een betrouwbare methode voor DNA-kwantificering.
- Interne positieve controles zijn essentieel voor de validatie van de assay.
- Deze methode kan de toegang tot DNA-kwantificeringstechnieken verbreden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve DNA-meting is een fundamentele capaciteit bij targetvalidatie en assayontwikkeling, waarbij nauwkeurige concentratiegegevens de identificatie van lead-verbindingen en het voorspellende vertrouwen ondersteunen. De beschreven qRPA-methode biedt een isotherme alternatief voor qPCR, waardoor de afhankelijkheid van apparatuur wordt verminderd en inzet in omgevingen met variabele middelen mogelijk wordt. Dit positioneert de assay als een schaalbare tool voor vroege discovery-workflows die betrouwbare kwantificering van nucleïnezuren vereisen zonder infrastructuur voor thermisch cyclen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van nauwkeurige kwantificering van DNA-doelwitten in complexe monsters.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van doelwitten door concentratiegegevens te leveren met een nauwkeurigheid binnen één grootteorde met behulp van interne positieve controles.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanisch de-risking door het genereren van standaardcurves die vergelijking tussen experimenten en beoordeling van de assayprestaties mogelijk maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele die essentieel zijn voor dosis-responsvorming en de gereedheid voor compound-screening.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van de assay mogelijk via interne positieve controles die de amplificatie-efficiëntie en inhibitie monitoren.
- Schaalbaarheid: Compatibel met microscoopgebaseerde detectie, wat aanpassing aan point-of-care of gedecentraliseerde testformaten ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt kwantificering in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door middel van reproduceerbare generatie van standaardcurven.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt het monitoren van DNA-gebaseerde biomarkers waarbij concentratiewijzigingen wijzen op target-engagement of modulatie van signaalpaden.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Levert kwantitatieve resultaten die go/no-go-beslissingen onderbouwen door detectielimieten en het dynamisch bereik te definiëren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij kwantitatieve nucleïnezuurdata bijdragen aan de prioritering van verbindingen en studies naar het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk door DNA-targets te kwantificeren om effecten van pathway-modulatie of genetische perturbatie te beoordelen.
- Screening: Levert reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor high-throughput adaptatie in combinatie met geautomatiseerde vloeistofbehandeling.
- Analytics: Genereert standaardcurven en Z-score drempelwaarden waarmee teams condities kunnen vergelijken en de sensitiviteit van de assay kunnen valideren.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door kwantificeerbare DNA-metingen te bieden die correleren met biologische activiteit.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar kwantificatieplatform dat toepasbaar is op diverse DNA-targets, waardoor de inspanning voor de ontwikkeling van nieuwe assays wordt verminderd.
Operationele & Zakelijke Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door variabiliteit te verminderen via normalisatie met een interne positieve controle.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via isotherme amplificatie en een reactie-opstelling met een koelblok, waardoor temperatuurafhankelijke artefacten worden geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de behoefte aan thermocyclers weg te nemen, wat de drempel voor kwantitatieve DNA-analyse verlaagt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door concentratiegegevens die accurate dosering en target-expositiemodellering ondersteunen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de moleculaire biologie op het gebied van primer/probe-ontwerp en de interpretatie van fluorescentiedata.
- Toegang tot fluorescentiedetectieapparatuur is noodzakelijk, zoals een real-time PCR-apparaat of een microscoop met tafelverwarmer.
- Standaardisatie van de omgang met reagentia is vereist, inclusief de timing van de toevoeging van magnesiumacetaat en opslag in een koelblok.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende monster-types, met name wat betreft de tolerantie voor inhibitoren en de DNA-zuiverheid.
- Omvat praktische beperkingen, zoals een kwantificeringsnauwkeurigheid van één grootteorde en de afwezigheid van echte amplificatiecycli, waardoor een nauwkeurige timing van de reactie vereist is.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
