Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle
March 30th, 2015
Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.
Het algemene doel van het volgende experiment is om kwantitatieve recombinase-polymerase-vereenvoudiging te gebruiken om de DNA-concentratie van onbekende monsters te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de interne positieve controle van het doel-DNA, DNA-primers en fluorescent gelabelde sondes aan de reactie toe te voegen. Als tweede stap worden de reacties in de real-time PCR-machine geplaatst, die de reacties verwarmt om de enzymen te activeren en de fluorescentie van de sondes bewaakt om de generatie van doel- en controle-amplicons te detecteren.
Vervolgens wordt de fluorescentiegegevens geanalyseerd met behulp van een script om de standaardcurve te genereren en de test te valideren. De resultaten tonen aan dat DNA-monsters nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd binnen één orde van grootte van de juiste concentratie op basis van de validatie-experimenten die werden gebruikt om een HIV een doel-DNA te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals real-time kwantitatieve PCR, is dat RPA isothermisch is, dus er is geen dure thermische cycler nodig.
RPA vereist ook een lagere amplificatie naar temperatuur, is tolerant voor vuile monsters, versterkt het doel tot detecteerbare niveaus binnen enkele minuten en maakt gebruik van lly-enzymen om eenvoudige transport en opslag bij kamertemperatuur mogelijk te maken. Om te beginnen, maak alle werkbladen en apparatuuroppervlakken schoon met een oplossing van 50% bleekmiddel om een schone pre-amplificatiewerkruimte te creëren, verwijder de 280 millimolaire magnesiumacetaatoplossing, de rehydratatiebuffer en de reactiepellets uit de min 20 graden Celsius vriezer en ontdooi de oplossingen bij kamertemperatuur. Monteer vervolgens een mastermix door 383,5 microliter van de rehydratatiebuffer over te brengen naar een nieuwe microfugebuis bij 41,6 microliter nuclease-vrije water naar de buffer en vortex om te mengen bij 35 microliter magnesiumacetaat naar een aparte buis.
Breng het magnesiumacetaat in de rehydratatiebuffer stockoplossingen terug naar de vriezer. Verkrijg vervolgens de primer- en prob-quas uit de koelkast op vier graden Celsius. Plaats ze in de pre-amplificatiewerkruimte en zet het licht uit om lichtblootstelling te minimaliseren bij 27,3 microliter van elk van de 10 micromolar voorwaartse en achterwaartse primers naar de mastermix.
Vervolgens bij 7,8 microliter van de 10 micromolar hex-gelabelde HIV 1D NA.Probe naar de mastermix en vortex de buis. Breng vervolgens de primer en de sonde stockoplossingen terug naar opslagreagentia voor de interne positieve controle die hier kan worden toegevoegd zoals aangegeven in het tekstprotocol om de QRPA-reacties samen te stellen. Plaats eerst de gevriesdroogde enzympellets in afzonderlijke buizen van twee, lage opstaande acht-putjes PCR-buisjes pipet 37,5 microliter van de mastermix in een buis met een pellet.
Roer voorzichtig de inhoud van de buis met de pipettetip om het pellet op te lossen zonder bellen te creëren. Verwijder de tip voorzichtig uit de reactie om verlies van volume te voorkomen en zorg ervoor dat u de pipettetips tussen elke buis verwisselt. Breng de buizen over naar een gekoelde 96-wels koude blok gedurende ten minste vijf minuten om de mastermix af te koelen.
Ondertussen laadt u de thermische cycler software met het protocol en de plaatlay-out zoals aangegeven in het tekstprotocol. Snijd vervolgens twee strips van heldere plastic microseal-kleefmiddelen zodat ze iets breder zijn dan de PCR-buisjes. En verkrijg ook twee platte PCR-buisjesstripdeksels, doseer het HIV een plasmide-sjabloon zoals aangegeven in het tekstprotocol.
En voeg vervolgens 10 microliter van het sjabloon toe aan de juiste PCR-buis. Roer opnieuw voorzichtig de mix met de pipettetip. Voeg vervolgens 2,5 microliter van het magnesiumacetaat toe aan elk buisjekap en plaats vervolgens voorzichtig de doppen op de reactiebuizen zodat ze niet volledig zijn afgesloten.
Het magnesiumacetaat moet duidelijk zichtbaar zijn door de dop. Plaats de PCR-buisjes in een microcentrifuge en centrifugeer de buizen gedurende 10 seconden om al het vocht in de bodem van de buis te verzamelen en eventuele bellen te verwijderen. Het combineren van de magnesiumacetaatoplossing met de mastermix start de QRPA-reactie.
Verwijder snel de PCR-buizen naar de koude blok om de reactie te stoppen. Verwijder vervolgens langzaam de deksels om verontreiniging van de reacties te voorkomen en verzegel de buizen met een heldere microseal-folie. Breng de buizen over naar de thermische cycler volgens de locaties in de plaatlay-out.
Sluit het deksel van de thermische cycler en klik op startrun. Zorg ervoor om een bestandsnaam voor het experiment aan te geven wanneer de run is voltooid. Bekijk de ruwe fluorescentiegegevens en exporteer deze naar een spreadsheet die een bestand met de naam kwantificeringsversterkingsresultaten zal maken.
Om de standaardcurve te bouwen. Download eerst het standaardcurve script, open vervolgens MATLAB of een vergelijkbaar data-analyseprogramma. Open het script en druk op run om het script uit te voeren.
Typ het aantal te analyseren gegevensbestanden in wanneer daarom wordt gevraagd. Typ vervolgens het aantal monsters en het aantal replica's in elk trainingsbestand. In het opdrachtvenster.
Typ de laagste DNA-concentratie in log-gebaseerde 10-kopieën die werd gebruikt om de standaardcurve te bouwen en druk op enter. In het voorbeeld hier. De laagste concentratie is een log gebaseerd op 10-kopieën.
Typ vervolgens het verschil in concentratie tussen elke DNA-standaard in het opdrachtprompt en druk op enter hier. Het concentratie-interval is één log gebaseerd op 10-kopieën. Voer vervolgens de waarde voor de hellingsdrempel in het opdrachtvenster in en druk op enter.
Deze waarde ligt meestal tussen drie en vijf. Typ het aantal standaardafwijkingen boven de achtergrond voor positieve drempel, ook bekend als Z, en druk vervolgens op enter typische Z-waarden variëren van één tot vijf. Specificeer vervolgens het apparaat dat werd gebruikt om de gegevens in dit geval te verzamelen.
Typ één voor de thermische cycler en druk vervolgens op enter. Als er een interne positieve controle is, selecteert u de standaard of een nieuwe
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor een real-time recombinase polymerase-amplificatie-assay, ontworpen om DNA-concentraties in monsters te kwantificeren. De methode maakt gebruik van een thermische cycler of een microscoop met een stageverwarming, en omvat de ontwikkeling van een interne positieve controle.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Moleculairbiologie
- Genomics
Achtergrond
- Kwantitatieve analyse van DNA is cruciaal in verschillende biologische onderzoeksvelden.
- Traditionele methoden zoals real-time kwantitatieve PCR vereisen dure thermische cyclers.
- Recombinase polymerase-amplificatie (RPA) biedt een isotherm alternatief.
- Interne positieve controles verbeteren de betrouwbaarheid van kwantitatieve assays.
Doel van studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het kwantificeren van DNA-concentraties met behulp van RPA.
- Om een interne positieve controle te creëren voor verbeterde assayvalidatie.
- Om scripts te verstrekken voor het analyseren van real-time fluorescentiegegevens.
Gebruikte methoden
- Bereiding van reactiemengsels met doel-DNA, primers en fluorescente probes.
- Gebruik van een real-time PCR-machine om fluorescentie tijdens amplificatie te monitoren.
- Analyse van fluorescentiegegevens om een standaardcurve te genereren.
- Validatie van de assay door experimenten die HIV-doel-DNA kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- De assay kwantificeert DNA-concentraties nauwkeurig binnen een orde van grootte.
- Validatie-experimenten bevestigden de effectiviteit van de interne positieve controle.
- RPA vertoont voordelen boven traditionele PCR-methoden.
- Het protocol is toegankelijk voor onderzoekers zonder dure apparatuur.
Conclusies
- De ontwikkelde RPA-assay is een betrouwbare methode voor DNA-kwantificering.
- Interne positieve controles zijn essentieel voor assayvalidatie.
- Deze methode kan bredere toegang tot DNA-kwantificeringstechnieken faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative DNA measurement is a foundational capability in target validation and assay development, where accurate concentration data supports lead identification and predictive confidence. The described qRPA method provides an isothermal alternative to qPCR, reducing equipment dependency and enabling deployment in resource-variable settings. This positions the assay as a scalable tool for early discovery workflows requiring reliable nucleic acid quantification without thermal cycling infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise DNA target quantification in complex samples.
- Operational Value: Supports functional target validation by delivering concentration data within one order of magnitude accuracy using internal positive controls.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by generating standard curves that allow cross-experiment comparison and assay performance assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements essential for dose-response modeling and compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay standardization through internal positive controls that monitor amplification efficiency and inhibition.
- Scalability: Compatible with microscope-based detection, supporting adaptation to point-of-care or decentralized testing formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage quantification to preclinical validation through reproducible standard curve generation.
- Biomarker Alignment: Supports monitoring of DNA-based biomarkers where concentration changes indicate target engagement or pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative outputs that inform go/no-go decisions by defining detectable limits and dynamic range.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative nucleic acid data informs compound prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying DNA targets to assess pathway modulation or genetic perturbation effects.
- Screening: Delivers reproducible fluorescence-based readouts suitable for high-throughput adaptation when paired with automated liquid handling.
- Analytics: Generates standard curves and Z-score thresholds that allow teams to compare conditions and validate assay sensitivity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing quantifiable DNA measurements that correlate with biological activity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across DNA targets, reducing redevelopment effort for new assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability through internal positive control normalization.
- Operational Value: Enhances reproducibility via isothermal amplification and cold-block reaction setup, minimizing temperature-dependent artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for thermal cyclers, lowering barrier to entry for quantitative DNA analysis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through concentration data that supports accurate dosing and target exposure modeling.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in primer/probe design and fluorescence data interpretation.
- Needs access to fluorescence detection equipment such as a real-time PCR machine or microscope with stage heater.
- Demands standardization of reagent handling, including magnesium acetate addition timing and cold-block storage.
- Involves adaptation considerations for sample types, particularly regarding inhibitor tolerance and DNA purity.
- Includes practical limitations such as the one-order-of-magnitude quantification accuracy and absence of true amplification cycles requiring precise reaction timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
