Name: Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een kwantitatieve recombinase polymerase amplificatie test met interne positieve controle voor DNA-kwantificatie. Deze methode biedt een betrouwbaar alternatief voor PCR zonder dure thermocycler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Bill &amp; Melinda Gates Foundation door de Grand Challenges in Global Health Initiative.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Krõlov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+JMD%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li>
<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om een ​​zinvolle kwantificering van gegevens met behulp van de MATLAB-algoritme te verkrijgen, moet de gebruiker de juiste ingang waarden te selecteren wanneer u wordt gevraagd. Na het starten van elk script in de paragrafen 5 en 6, worden alle variabelen automatisch gevraagd in het commando venster en uitgangen worden automatisch gegenereerd. In paragraaf 5.7 wordt de gebruiker gevraagd om een ​​helling drempel selecteren. De waarde van de helling drempel beïnvloedt het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt (R2)<...

Kwantitatieve nucleïnezuur amplificatie is een belangrijke techniek voor detectie van milieu, voedsel overgedragen en water ziekteverwekkers en klinische diagnostiek. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) is de gouden standaard methode voor gevoelige, specifieke en kwantitatieve detectie van nucleïnezuren, bijvoorbeeld, HIV-1 virale lading testen, detectie van bacteriële pathogenen, en screening op vele andere organismen 1 - 3. Gedurende real-time qPCR, primers amplificeren pathogeen DNA in cycli, en een fluorescent signaal gegenereerd dat evenredig is met de hoeveelheid geamplificeerd DNA in het monster bij elke cyclus. Een monster met een onbekende concentratie van pathogeen DNA kan worden gekwantificeerd met een standaard kromme die de oorspronkelijke DNA-concentratie van standaardmonsters en het tijdstip waarop het fluorescentiesignaal een bepaalde drempel bereikt (dat wil zeggen, de cyclus drempelwaarde, of CT) betrekking heeft. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Omdat real-time qPCR vereist dure thermische cycli apparatuur en enkele uren resultaten, alternatieve isothermische amplificatie technieken zoals recombinase polymerase amplificatie (RPA) te ontvangen, ontwikkeld 4. Deze platforms algemeen sneller resultaten en amplificeren van nucleïnezuren een lagere, één temperatuur, die kan worden bereikt met minder dure apparatuur eenvoudiger. RPA, die bijzonder aantrekkelijk voor point-of-care toepassingen, versterkt DNA in minuten vereist een lage versterking (37 ° C) en blijft actief in aanwezigheid van onzuiverheden 5,6. RPA-testen zijn ontwikkeld voor een breed scala van toepassingen, met inbegrip van voedsel analyse, detectie van pathogenen, kanker drug screening en detectie van biothreat agenten 7-12. Echter, gebruik van RPA voor het kwantificeren van nucleïnezuren beperkt 13,14. In eerdere werk, het was shown die real-time kwantitatieve RPA (qRPA) is haalbaar 15. Hier wordt een meer gedetailleerd protocol bedoeld met real-time kwantitatieve RPA onbekende monsters met behulp van een standaardcurve, een methode die analoog is aan kwantificering met qPCR kwantificeren. Dit protocol wordt beschreven hoe een RPA reactie uit te voeren op een thermocycler HIV-1 DNA te detecteren als proof-of-concept, evenals hoe een interne positieve controle (IPC) het systeem correct werkt ontwikkelen. Het verzamelen van gegevens met behulp van een PCR-apparaat of een microscoop en data-analyse voor de bouw van een standaard curve met behulp van training data wordt ook beschreven. Tenslotte wordt de werkwijze voor het kwantificeren van onbekende monsters met de standaardcurve met een douanemanuscript aangetoond. Deze qRPA techniek maakt kwantificering van monsters met onbekende concentraties en heeft vele voordelen boven traditionele real-time qPCR.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 voorwaartse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 achterwaartse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 sonde</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>IPC sonde</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3&rsquo;</td></tr><tr><td>RPA exo reagentia (pellets, rehydratatiebuffer, magnesiumacetaat</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR buisjesstrips</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR vlakkap buisjesstrips</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Micro-seal kleefstof</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 doelwit (pHIV-IRES- eYFP&Delta;Env&Delta;Vif&Delta;Vpr)</td><td></td><td></td><td>custom plasmid, zie: Segall, H. I., Yoo, E. &amp; Sutton, R. E. Karakterisering en detectie van kunstmatig replicatiebekwaam lentivirus met gewijzigd gastheerbereik. Molecular Therapy 8, 118&ndash;129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>Menselijk mannelijke genomische DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 wel koude-blok</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Ontwikkeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC sjabloon</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Het is ook mogelijk om een dubbelstrengs synthetisch doelwit te bestellen van IDT als de gebruiker niet in staat is om met C. parvum te werken (een BSL-2 infectieus agens). PCR en RPA primers voor C. parvum werden ontworpen met behulp van GenBank toegangsnummer AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR lange voorwaartse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3&rsquo;</td></tr><tr><td>PCR lange achterwaartse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligo's</td><td>5&rsquo;- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3&rsquo;</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X buffer</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Experimenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rechtopstaande fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Stage verwarmer</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-kanaals precisie hoge stabiliteit temperatuurregelaar</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP filter kubus</td><td>Zeiss</td><td>filter set 38 (000000-1031-346)</td><td>excitatie BP 470/40 nm, emissie BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX filter kubus</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitatie BP 530/30 nm, emissie BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Laser snijder</td><td>Engraver's Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" zwart acryl</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm helder acryl</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super lijm</td><td>Office Depot</td><td>Duro super lijm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCR-kwaliteit mineraal olie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Data Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m&rdquo;</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&rdquo;</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m&rdquo;</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Opgenomen in SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een kwantitatieve recombinase polymerase amplificatie test met een interne positieve controle

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Het werd onlangs aangetoond dat recombinase polymerase-amplificatie (RPA), een isotherme amplificatieplatform voor het detecteren van pathogenen, kan worden gebruikt om de DNA-monsterconcentratie te kwantificeren met behulp van een standaardcurve. In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol voor het ontwikkelen en implementeren van een real-time kwantitatieve recombinase polymerase-amplificatie-assay (qRPA-assay) gegeven. Met behulp van HIV-1 DNA-kwantificering als voorbeeld, worden de assemblage van real-time RPA-reacties, het ontwerp van een interne positieve controle (IPC) sequentie en co-amplificatie van de IPC en doelwit van belang allemaal beschreven. Er worden instructies en dataverwerkingsscripts gegeven voor de constructie van een standaardcurve met behulp van gegevens van meerdere experimenten, die kunnen worden gebruikt om de concentratie van onbekende monsters te voorspellen of de prestaties van de assay te beoordelen. Ten slotte wordt een alternatieve methode beschreven voor het verzamelen van real-time fluorescentiegegevens met een microscoop en een stagesverwarmer als een stap naar het ontwikkelen van een point-of-care qRPA-assay. Het protocol en de scripts die worden verstrekt, kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een qRPA-assay voor elk DNA-doelwit van belang.

Voor het selecteren van een sequentie te dienen als de IPC qRPA experimenten met target (HIV-1) DNA interne positieve controle (IPC) kandidaten worden gegenereerd en gescreend op hun vermogen om amplificeren qRPA reacties zonder HIV-1 DNA aanwezig. IPC kandidaten zijn langer dan de doel (HIV-1) DNA voorkomen IPC vorming van niet-concurrerende HIV-1 amplicon formatie. Zoals getoond in figuur 2A, het genereren van twee C. parvum IPC kandidaten werd geverifieerd door de aanwezigheid van 415 en 435...

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om kwantitatieve recombinase polymerase simplification te gebruiken om de DNA-concentratie van onbekende monsters te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de interne positieve controle van het doel-DNA, DNA-primers en fluorescentie-gelabelde probes aan de reactie toe te voegen. In een tweede stap worden de reacties in de real-time PCR-machine geplaatst, die de reacties verhit om de enzymen te activeren en de fluorescentie van de probes monitort om de vorming van doel- en controle-amplicons te detecteren.Vervolgens worden de fluorescentiegegevens geanalyseerd met behulp van een script om de standaardcurve te genereren en de assay te valideren. De resultaten tonen aan dat DNA-monsters nauwkeurig gekwantificeerd kunnen worden binnen één grootteorde van de juiste concentratie, gebaseerd op de validatie-experimenten die werden gebruikt om een HIV-1 target DNA te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals real-time kwantitatieve PCR is dat RPA isotherme is, waardoor een duur thermocycler niet nodig is.RPA vereist bovendien een lagere amplificatietemperatuur, is tolerant voor vervuilde monsters, amplificeert het doelwit binnen enkele minuten tot detecteerbare niveaus en maakt gebruik van lyofilisatie-enzymen om eenvoudig transport en bewaring bij kamertemperatuur mogelijk te maken. Begin met het reinigen van alle werkbladen en apparatuuroppervlakken met een 50% bleekoplossing om een schone pre-amplificatie-werkruimte te creëren; haal de 280 millimolair magnesiumacetaat-oplossing, de rehydratatiebuffer en de reactiepellets uit de vriezer van -20 °C en laat de oplossingen ontdooien bij kamertemperatuur. Stel vervolgens een mastermix samen door 383,5 µL van de rehydratatiebuffer over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis, voeg 41,6 µL nucleasevrij water toe aan de buffer en vortex om te mengen, en voeg 35 µL magnesiumacetaat toe aan een aparte buis.Plaats de magnesiumacetaat-voorraadoplossingen van de rehydratatiebuffer terug in de vriezer. Haal vervolgens de primer- en probe-stocks uit de koelkast van vier graden Celsius. Plaats deze in de pre-amplificatie werkruimte en schakel de lichten uit om lichtblootstelling te minimaliseren; voeg 27,3 µL van elk van de 10 µM forward- en reverse-primers toe aan de mastermix.Voeg vervolgens 7,8 µL van de 10 µM hex-gelabelde HIV 1D NA-probe toe aan de mastermix en vortex de buis. Plaats daarna de primer- en probe-stockoplossingen terug in de opslag; reagentia voor de interne positieve controle kunnen hier worden toegevoegd, zoals aangegeven in het tekstprotocol, om de QRPA-reacties samen te stellen. Plaats eerst de gevriesdroogde enzympellets in individuele buisjes van twee low-rise PCR-strips met acht putjes en pipetteer 37,5 µL van de mastermix in een buis die een pellet bevat.Roer de inhoud van de buis voorzichtig met de pipetpunt om het pellet op te lossen zonder bellen te vormen. Verwijder de punt voorzichtig uit de reactie om volumeverlies te voorkomen en zorg ervoor dat de pipetpunten tussen elke buis worden gewisseld. Plaats de buizen gedurende ten minste vijf minuten in een gekoeld 96-well koudeblok om de mastermix af te koelen.Laad ondertussen de software van de thermocycler met het protocol; de indeling van de plaat staat aangegeven in het tekstprotocol. Snijd vervolgens twee strips transparante plastic microsealsafsluitingen af, zodat deze iets breder zijn dan de PCR-buisjes. Neem daarnaast twee vlakke PCR-buisjesstrip-deksels en doseer het HIV-1 plasmide-template zoals aangegeven in het tekstprotocol.Voeg vervolgens 10 µL van het template toe aan de juiste PCR-buis. Roer het mengsel opnieuw voorzichtig met de pipetpunt. Voeg daarna 2,5 µL magnesiumacetaat toe aan elke buisdop en plaats de doppen voorzichtig op de reactiebuizen, zodat ze niet volledig zijn afgesloten.Het magnesiumacetaat moet duidelijk zichtbaar zijn door de dop. Plaats de PCR-buisstrips in een microcentrifuge en centrifugeer de buisjes 10 seconden om alle vloeistof onderin de buis te verzamelen en eventuele luchtbellen te verwijderen. Het toevoegen van de magnesiumacetaatoplossing aan de mastermix start de QRPA-reactie.Verplaats de PCR-buisjes snel naar het koelblok om de reactie te stoppen. Verwijder vervolgens voorzichtig de doppen om contaminatie van de reacties te voorkomen en verzegel de buisjes met een transparante micros seal film. Plaats de buisjes in de thermocycler volgens de posities in het plaatoverzicht.Sluit het deksel van de thermocycler en klik op start run. Zorg ervoor dat u een bestandsnaam voor het experiment opgeeft wanneer de run is voltooid. Bekijk de ruwe fluorescentiedata en exporteer deze naar een spreadsheet, wat een bestand zal creëren met de naam quantification amplification results.Om de standaardcurve op te stellen: download eerst het script voor de standaardcurve en open vervolgens MATLAB of een soortgelijk programma voor data-analyse. Open het script en klik op 'run' om het script uit te voeren.Typ het aantal te analyseren databestanden in wanneer daarom wordt gevraagd. Typ vervolgens het aantal monsters en het aantal replica's in elk trainingsbestand in het opdrachtvenster.Typ de laagste DNA-concentratie in log-gebaseerde 10 kopieën die is gebruikt voor het opstellen van de standaardcurve in en druk op enter. In dit voorbeeld is de laagste concentratie één log-gebaseerde 10 kopieën.Typ vervolgens het verschil in concentratie tussen elke DNA-standaard in de opdrachtprompt en druk op enter. Het concentratie-interval is één log-10 kopie. Voer daarna de waarde voor de drempelwaarde van de helling in het opdrachtvenster in en druk op enter.Deze waarde ligt doorgaans tussen drie en vijf. Voer het aantal standaarddeviaties boven de achtergrond voor de positieve drempelwaarde in, ook wel bekend als Z, en druk vervolgens op enter; typische Z-waarden variëren van één tot vijf. Specificeer daarna de apparatuur die in dit geval is gebruikt om de gegevens te verzamelen.Typ één in voor de thermische cycler en druk vervolgens op enter. Als er een interne positieve controle aanwezig is, selecteert u de standaardwaarde of een nieuwe waarde voor de drempelwaarde door Y of N te typen, afhankelijk van of een nieuwe drempelwaarde nodig is. Selecteer tot slot alle spreadsheetbestanden die worden gebruikt om de standaardcurve op te stellen.Het script zal vervolgens automatisch alle gegevens importeren en analyseren. Realtime QRPA werd uitgevoerd op dubbele monsters met verschillende kopie-aantallen van HIV 1D NA. Het begin van detecteerbare amplificatie, aangegeven door een toename in fluorescentie, treedt eerder op bij monsters met hogere DNA-kopie-aantallen dan bij monsters met lagere kopie-aantallen. De ruwe fluorescentiegegevens werden gebruikt om een standaardcurve te genereren op basis van de amplificatie van bekende concentraties HIV 1D NA. Deze gegevens zijn gefit aan een exponentiële curve, en de R-kwadraatwaarde duidt op een hoge goede passing.De standaardcurve werd gebruikt om de concentraties van aanvullende DNA-monsters met een bekende concentratie te voorspellen. Door de waarde van Z op één in te stellen, kunnen lage DNA-concentraties nauwkeurig worden voorspeld. Daarentegen worden hoge DNA-concentraties beter voorspeld met een Z-waarde van vijf.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat RPA geen echte cycli heeft om de snelheid van de DNA-amplificatie te beperken. Daarom moet de amplificatiesnelheid nauwkeurig worden gecontroleerd. Consistentie tussen experimenten is essentieel, dus zorg ervoor dat voor alle experimenten dezelfde primer-aliquots worden gebruikt.Bescherm de reactiecomponenten tegen warmte en licht. Voeg magnesiumacetaat onmiddellijk toe voordat de gegevensverzameling begint, en bewaar de reacties in het koudeblok tot aan de aanvang van het experiment.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

In this video, we demonstrate the duplex digital PCR (ddPCR) technique — a modification of the traditional PCR technique that is useful in detecting two different genetic markers simultaneously. A single PCR reaction is partitioned into nanoliter-sized emulsified droplets that are independently amplified, and the detection of differently colored fluorescence amplification signals from the fraction of droplets is used to compute the initial concentration of the target sequences.

Duplex Digital PCR for Simultaneous Quantification of Dual Genetic Markers

Hier beschrijven we een methode voor de gelijktijdige kwantificering van T-cel receptor excisie cirkels (TRECs) en K-deletrerende recombinatie excisie cirkels (KRECs). De TREC/KREC test kan worden gebruikt als marker voor de output van de thymus en het beenmerg.

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode die wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Het validatieprotocol voor EHV-2 qRT-PCR omvat een drieledige procedure: ontwikkeling, karakterisering van de qRT-PCR-test alleen en karakterisering van de volledige analytische methode.

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Milieu-DNA-tests vereisen een rigoureus ontwerp, testen, optimalisatie en validatie voordat het verzamelen van veldgegevens kan beginnen. Hier presenteren we een protocol om gebruikers door elke stap te nemen bij het ontwerpen van een soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-test voor de detectie en kwantificering van dna van een doelsoort uit milieumonsters.

Ontwikkeling en testen van soortspecifieke kwantitatieve PCR-tests voor milieu-DNA-toepassingen

Gedetailleerde instructies worden gegeven om een open-source, modulaire fluorimeter te bouwen die compatibel is met veel goedkope kachels om real-time, kwantitatieve isotherme nucleïnezuurversterking uit te voeren.

Open-Source miniatuurfluorimeter om real-time isotherme nucleïnezuurversterkingsreacties te monitoren in resource-beperkte instellingen

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Om de snelle en nauwkeurige detectie van Acinetobacter baumannii te vergemakkelijken, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in combinatie met LbaCas12a-endonuclease voor het identificeren van A. baumannii-infecties .

Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem

Leer een kwantitatieve recombinase polymerase amplificatie test met interne positieve controle voor DNA-kwantificatie. Deze methode biedt een betrouwbaar alternatief voor PCR zonder dure thermocycler.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Meer video's verkennen