Name: LepR Db Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer de isolatie van eilandjes van Langerhans uit Lepr db muizen en live-cell 2-photon imaging om insulinesecretie van bètacellen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers diabetesmechanismen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Australian Research Council Grant DP110100642 (aan PT) en National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 en APP1059426 (aan PT en HYG).

LET OP: Alle huidige experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale dierethiek procedures van de Universiteit van Queensland (door de Universiteit van Queensland, Anatomical Biosciences ethische commissie goedgekeurd). 1. Islet Isolatie <ol><li> Reagens voorbereiding <ol><li> Mengsel van enzymen <ol><li> Voor de pancreas spijsvertering, gebruik maken van een mengsel van Liberase en collagenase type IV. Verdunnen Liberase TL (thermolysine laag) 1 flacon van 5 mg met 26 ml DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium). </li><li> Bereid collagenase type IV in Hank&#39;s buffer bij een concentratie van 0,5 mg / ml, aangevuld met 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNase en 1 mg / ml runderserumalbumine. </li><li> Meng de Liberase TL en collagenase oplossingen in een verhouding van 4: 1 (volumeverhouding), dwz 4 ml Liberase TL + 1 ml collagenase. Aliquot het mengsel van enzymen aan elke 2,5 ml en bewaar bij -20 ° C. LET OP: Het weefsel incubatietijden vari een beetje tussen batches van enzym (30 sec tot 1 min verschil). Daarom kan een ladingsgewijze test vereist. </li></ol></li><li> Isolation RPMI Media <ol><li> Los één flacon van RPMI 1640 poeder in 1 liter water bij RT en aan te vullen met 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES. </li><li> Combineer de RPMI isolatiemedia in een grote erlenmeyer mengen met een magnetische roerder op pH 7,4 met NaOH, filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Cultuur Media </li><li> Met RPMI kweekmedium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica (bijvoorbeeld, penicilline 100 U / ml, streptomycine 100 ug / ml). </li></ol></li><li> Islet Isolatie en kweken <ol><li> Animal Sacrifice <ol><li> Offer muizen door cervicale dislocatie of CO 2 stikken volgens ethische procedures van de lokale instelling. Spray de muis lichaam grondig met 70% ethanol. </li></ol></li><li> Pancreas perfusie <ol><li> Use 2 langssneden zijdelings door de buikhuid en peritoneum van een V-vormige flap maken. Trek de flap van de huid tot het gehele buikholte ontdekken, opzij zetten de darm en houden de lever in plaats van een gevouwen tissue papier om de galbuis afgeleid (figuren 1 en 2). Zet het dier zodat de kop naar de chirurg en de staart weg van de chirurg. </li><li> Breng een vasculaire klem op de ampulla van de twaalfvingerige darm muur om de geïnjecteerde enzymen blokkeren die in de twaalfvingerige darm (Figuur 1). NB: Dit is een belangrijke stap omdat het bepaalt of de geïnjecteerde enzymen in de pancreas duct zal gaan en perfuseren de alvleesklier of reflux aan de injectieplaats (meer dan klem) of ga in de twaalfvingerige darm (onder klem). </li><li> Canule de galbuis met een 31 G naald vlakbij de kruising van de ductus hepaticus en cystic duct (figuur 1) en laat ruimte voor een tweede injectie of the alvleesklier niet in slaagt om de eerste keer perfuseren. Langzaam (meer dan ~ 10 sec) injecteer ongeveer 2 ml koude enzymmengsel in de muis galbuis. OPMERKING: De pancreas wordt snel geperfundeerd wanneer de klem zich in de juiste positie. </li><li> Pas de klem positie als de naald is in de galweg, maar kan de alvleesklier niet perfuseren (dwz., Overgaan tot de klem een beetje weg van de lever, indien meer dan geklemd of verplaats het een beetje aan de lever als onder geklemd). OPMERKING: De naald gaat soms in het omgevende capsule niet de lumen van de buis. Een nuttige teken om te controleren of de naald zich in de ductus choledochus wordt de uitzetting van de leiding bij het injecteren. Indien de alvleesklier geen perfuseren, alternatief is het enzymmengsel kan worden geïnjecteerd om meerdere sites van de pancreas met lagere opbrengst verwacht. De perfusie van de linkerkant van de pancreas (de milt kwab) van belang voor maximalisatie van het eilandje opbrengst. </li><li> Nadat de pancreas perfused, snel te verwijderen van de alvleesklier, zet het in een flesje (~ 20 ml, glas) en incubeer gedurende ~ 19 minuten in een 37 ° C waterbad. OPMERKING: De incubatietijd kan iets variëren afhankelijk van de muizenstam en leeftijd. </li><li> Na de incubatietijd, stopt het verteringsproces door toevoeging ~ 20 ml koud isolatiemedia. Schud het flesje voorzichtig aan de alvleesklier verstoren en giet het door een normaal theezeef (poriediameter van 1 mm) in een steriele 50 ml buis. Vul de buis met isolatiemedia en centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld. </li><li> Los het pellet in de isolatiemedia telkens over naar twee 15 ml buisjes, centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld. Afzuiging het supernatant, meng de twee pellets goed met 6 ml dichtheidsgradiënt cellen scheidingsmedium (Histopaque 1077 oplossing) per buisje vortexen of en neer te pipetteren. Voeg voorzichtig ~ 6 ml van de isolatiemedia aan de zijkant van de buis bovenopde dichtheidsgradiënt scheidingsmedium en centrifugeer bij 100 xg gedurende 15 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof in de bovenste (isolatie media), middelste en onderste (dichtheid gradiënt celscheiding media) laag in 3 afzonderlijke gerechten. Handpick de eilandjes in deze 3 gerechten met een pipet onder een stereomicroscoop. OPMERKING: De middelste laag bevat de meeste van de eilandjes. Eilandjes worden als compacte structuren van -50 tot 500 urn in grootte (figuur 3). We krijgen ~ 200 eilandjes in WT-muizen en 300- &lt;100 eilandjes in db / db-muizen. </li></ol></li><li> Islet kweken <ol><li> Om de eilandjes herstellen van de enzymdigestie cultuur groepen 40 eilandjes in een 25 cm petrischaal met 6 ml RPMI kweekmedium (10 mM glucose) bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 gedurende 2 dagen vóór levende 2-cel-foton beeldvorming. Verander dagelijks het kweekmedium. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photon Imaging <ol><li> Reagens Voorbereiding <ol><li> Extracellulaire Buffer <ol><li> Bereid de natrium- rijke extracellulaire buffer voor 2-foton assay met 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 en 10 mM HEPES. </li></ol></li><li> Extracellulaire Dye <ol><li> Voor de 2-photon assay bereiden stock SRB 8 mM in extracellulaire buffer, aliquot in kleine buisjes en bewaar bij -20 ° C. Verdun de voorraad SRB 01:10 in verse extracellulaire buffer om een ​​werkende concentratie van 0,8 mm te krijgen. </li></ol></li></ol></li><li> foton Imaging <ol><li> Ten eerste, pre-incubeer 2 dagen gekweekt eilandjes in 3 mM glucose extracellulaire buffer gedurende 30 min. NOTA BENE: Wij gebruiken eilandjes tussen de 2 en 5 dagen in de cultuur. </li><li> Plaats dan een glasplaatje op de thermo-regelkamer geplaatst op de microscoop podium. Gebruik vet aan het lekken van de oplossing te voorkomen. </li><li> Bedek de kamer met 500 ul van extracellular buffer die 0,8 mM SRB met verschillende glucoseconcentraties (3 mM, 6 mM, 15 mM en 20 mM glucose). </li><li> Plaats vervolgens de gepre-incubeerd eilandje in het midden van de kamer en zich op 3-4 cellagen in het eilandje waar in knaagdieren eilandjes, immunokleuring insulinebehoefte blijkt dat de meeste cellen beta-cellen. LET OP: De SRB zal al het celmembraan van het eilandje snel schetsen en het eilandje is klaar om de afbeelding. </li><li> Gebruik een 2-foton microscoop met een 60X olie-immersie objectief (NA 1,42) en imaging software (bijv., Scanimage 11). Figuur 4 illustreert een typisch microscopie regeling. Afbeelding exocytische gebeurtenissen met SRB als een membraan impermeant fluorescerende extracellulaire marker opgewonden door femtoseconde laserpulsen op 880 nm, met fluorescentie gedetecteerd bij 550-650 nm. Noteer het eilandje respons op stimulatie. </li><li> Identificeren enkele exocytose gebeurtenissen door de plotselinge verschijning van een kleine fluorescerende spot (resolutie 10 pixels /1; m) en bevestig door de snel stijgende fase van het fluorescerende signaal over een regio van belang (~ 0,78 micrometer 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De belangrijkste factor bij het eilandje isolement de initiële perfusie van de pancreas; Een onder pancreas perfusie resulteert in een aanzienlijk lagere opbrengst eilandje. Andere factoren beïnvloeden ook de isolatie kwaliteit zoals destructietijd en de mate van schudden die gedeeltelijk kan compenseren voor het niveau van perfusie. Bijvoorbeeld, een volledig pancreas perfusie moeten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ~ 18 min 30 sec onder zacht schudden daarentegen een onder gedigereerd pancreas ~ 20 minuten dige...

De rol van de beta-cel disfunctie bij de ziekte is algemeen erkend 3,4. Cellijnen zoals MIN6 en INS-1 zijn nuttige hulpmiddelen om de biologie van beta cel gedrag te begrijpen. De fysiologische sturing van insulinesecretie vindt plaats in de eilandjes van Langerhans. Deze eilandjes bevatten duizenden dicht opeengepakte beta-cellen, alsmede bloedvaten en andere endocrine celsoorten. Deze omgeving binnen het eilandje invloed insulinesecretie en kan waarschijnlijk bij diabetes zijn. Daarom, om de fysiologische controle van insulinesecretie en de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, is het essentieel intacte eilandjes bestuderen. Isolatie Islet Levende menselijke eilandjes en in het bijzonder menselijke eilandjes aan type 2 diabetes patiënten moeilijk te verkrijgen. Bovendien humane eilandjes hebben beperkte mogelijkheden voor experimentele moleculaire manipulatie. Onderzoekers hebben daarom in dienst istermijn van dieren en dierlijke modellen van type 2 diabetes. Een dergelijke ziekte model is de db / db muis. Dit is een mutatie die spontane modellen Type 2 diabetes met een fenotype progressie die parallel loopt met menselijke ziekten 5,6. De hier gepresenteerde voor eilandje isolatie van diabetische db / db-muizen protocol vele trappen evenals andere groepen met een aantal verfijningen voor betere opbrengst, reiniging en verbeterde eilandje overleving. 2 foton imaging De live-cell 2-foton assay hier beschreven stelt onderzoekers in staat om het aantal te kwantificeren en evalueren van de kenmerken van de single-insuline met korrels van veel cellen van diabetische 7 en wild type eilandjes 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>om isolatiemedia voor te bereiden</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>om kweekmedia voor te bereiden</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>om kweekmedia voor te bereiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>om kweekmedia voor te bereiden</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>om de liberase te verdunnen</td></tr><tr><td>Metamorph programma</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>om de 2-fotonbeelden te analyseren</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; mouse model van type 2 diabetes: eilandjes van langerhans isolatie en live-cell 2-photon imaging van intacte eilandjes

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is een chronische ziekte die 382 miljoen mensen in 2013, en zal naar verwachting 592 miljoen stijgen met 2035 1. In de afgelopen 2 decennia, de rol van de beta-cel disfunctie bij type 2 diabetes is duidelijk vastgesteld 2. Onderzoek vooruitgang vereist voor de isolering van pancreaseilandjes. Het protocol van het eilandje isolatie gepresenteerde heeft veel gemeen stappen protocollen van andere groepen, met enkele wijzigingen om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes van zowel het wildtype en diabetische db LepR (db / db) muizen. Een levende cel 2-photon beeldvormingsmethode Vervolgens krijgt die gebruikt kan worden om de besturing van insulineafscheiding in eilandjes onderzoeken.

Islet opbrengst en zuivering Voor een normale wild type muis, worden ongeveer 200 eilandjes verwacht. Gezonde eilandjes kijken helder, ronde en hebben een gladde rand. Een over-gedigereerde isolatie batch is vaak klein en fuzzy eilandjes terwijl een onder gedigereerd batch heeft minder eilandjes en acinaire cellen gevoegd eilandjes (Figuur 3). Bij diabetische db / db muizen, het eilandje opbrengst en uiterlijk afhankelijk van de progressie van de ziekte beter glykemische mui...

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Het algemene doel van deze procedure is om levensvatige eilandjes van Langerhans te verkrijgen uit diabetische LEP R DB-muizen en de insulinesecretie van bètacellen binnen deze eilandjes te beoordelen met behulp van live-cell twee-foton-imaging. Dit wordt bereikt door eerst reagentia voor te bereiden, zoals het enzymmengsel voor de pancreasdigestie, het kweekmedium voor de cultivering van de eilandjes en de extracellulaire buffer voor de twee-foton-assay. Vervolgens wordt de buikholte van een geëuthanaseerde muis geopend en wordt het enzymmengsel in de pancreas geïnjecteerd om het orgaan te verteren.Vervolgens worden de eyelets gescheiden van het pancreassubstraat en gekweekt. Ten slotte wordt tweefotonmicroscopie gebruikt om de fusie van individuele insulinegranula uit bètacellen binnen de eyelet in beeld te brengen. Uiteindelijk zal dit protocol onderzoekers helpen begrijpen hoe de insulinesecretie wordt gereguleerd bij gezondheid en ziekte.De belangrijkste verfijning van de techniek voor het isoleren van eilandjes van Langerhans is het gebruik van gemengde enzymen om de opbrengst en de levensvatbaarheid van de eilandjes te verbeteren. De twee-foton-beeldvormingstechniek is momenteel de enige methode om de insulinesecretie van meerdere cellen binnen een intact eilandje vast te leggen. Om de enzymen voor het isoleren van pancreaseilandjes voor te bereiden, wordt één vial van vijf milligram liase TL verdund met 26 milliliter DM EM; bereid de collagenase type vier in Hank's buffer tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter, aangevuld met de volgende gemengde liase TL- en collagenase-oplossingen.Verdeel het enzymmengsel in aliquots van 2,5 milliliter elk in een volumeverhouding van vier op één en bewaar deze bij -20 °C. Om RPMI-isolatiemedium te bereiden, los één vial RPMI 1 6 4 0 poeder op kamertemperatuur op in een grote conische kolf met één liter water en voeg twee gram natriumbicarbonaat en 4,02 gram HEPES toe. Gebruik natriumhydroxide om de pH op 7,4 in te stellen, filter het mengsel vervolgens steriel en bewaar het bij 4 °C.Maak RPMI-kweekmedium door 10% FBS en 1% antibiotica toe te voegen aan het RPMI-isolatiemedium voor twee-foton-imaging. Bereid een natriumrijke extracellulaire buffer met de volgende reagentia. Om de extracellulaire kleurstof te bereiden, wordt een stockoplossing van 8 mM SRB gemaakt; verdeel de extracellulaire buffer over kleine buisjes en bewaar deze bij -20 °C.Om een werkconcentratie te verkrijgen, gebruik vers extracellulair buffer om de SRB-stock op 1:10 te verdunnen. Na het opofferen van een muis en het grondig bespuiten van het lichaam van de muis met 70% ethanol volgens het tekstprotocol, positioneert u het dier met de kop naar de chirurg en de staart van de chirurg afgewendt. Maak twee lange laterale incisies door de abdominale huid en het peritoneum om een V-vormige lap te creëren.Trek de huidflap omhoog om de gehele buikholte bloot te leggen. Leg de darm opzij en houd met het gevouwen weefsel de lever op zijn plaats om de gemeenschappelijke galgang zichtbaar te maken. Plaats vervolgens een vaatklem bij de ampulla op de wand van het duodenum om te voorkomen dat de geïnjecteerde enzymen in het duodenum terechtkomen.Dit is een belangrijke stap die bepaalt of de pancreasenzymen de pancreasgang in via reflux gaan, bij de injectieplaats blijven of in het duodenum terechtkomen. Gebruik een naald van 31 gauge om de ductus choledochus te canuleren nabij de samenvoeging van de ductus hepaticus communis en de ductus cysticus, en laat ruimte over voor een tweede injectie. Als de pancreas de eerste keer niet wordt geperfuseerd, injecteer dan langzaam ongeveer twee milliliters van het koude enzymmengsel in de ductus choledochus van de muis.Als de klem in de juiste positie staat, zal de pancreas snel worden geperfuseerd. Zodra de pancreas is geperfuseerd, wordt het orgaan snel verwijderd, in een glazen flacon geplaatst en ongeveer 19 minuten geïncubeerd in een waterbad van 37 °C. Stop na de incubatie het digestieproces door ongeveer 20 milliliters koud isolatiemedium toe te voegen.Schud het flacon voorzichtig om de pancreas te homogeniseren en giet deze door een normale T-zeef met een poriegrootte van 1 mm in een steriele buis van 50 ml. Vul de buis aan met het isolatiemedium en centrifugeer bij 400 G en 4 °C gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en voeg isolatiemedium toe aan het pellet om het op te lossen.Breng de suspensie vervolgens over naar twee buisjes van 15 milliliter en centrifugeer een tweede keer. Na het aspireren van het supernatant voegt u zes milliliter densiteitsgradiënt-celseparatiemedium toe aan elk buisje en resuspendeert u dit met een pipet of door middel van vortexen. Voeg vervolgens, langs de wand van de buisjes, voorzichtig ongeveer zes milliliter isolatiemedium toe bovenop het densiteitsgradiënt-separatiemedium en centrifugeer bij 100 G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Verzamel na het scheiden de bovenste, middelste en onderste lagen in drie afzonderlijke schaaltjes. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop een pipet om de oogjes in de drie schaaltjes handmatig te selecteren. De meeste oogjes zullen zich in de middelste laag bevinden, wat helpt bij het herstel van de oogjes na de enzymatische digestie.Bereid groepen van 40 eilandjes voor in Petri-schalen van 25 centimeter met zes milliliter RPMI-kweekmedium dat 10 millimolair glucose bevat en kweek deze gedurende twee dagen. Verschoon het medium dagelijks om tweefoton-imaging uit te voeren als indirecte assay om de insulinesecretie te meten. Begin met het pre-incuberen van de twee dagen gekweekte eilandjes in een extracellulaire buffer met drie millimolair glucose.Breng gedurende 30 minuten vet aan op de objecttafel van de microscoop om lekkage van de oplossing te voorkomen en monteer de thermocontrolekamer met een glazen objectglas op de objecttafel. Vul de kamer vervolgens met 500 µL extracellulaire buffer die 0,8 mM SRB en verschillende glucoseconcentraties bevat. Plaats daarna het vooraf geïncubeerde ooglid in het midden van de kamer en focus op drie tot vier cellagen in het ooglid.Waar in de eilandjes van Langerhans van knaagdieren immuunkleuring voor insuline aantoont dat de meeste cellen bètacellen zijn. Identificeer vervolgens met de tweefotonmicroscoop en een 60 x olie-immersieobjectief individuele exocytotische gebeurtenissen aan de hand van de plotselinge verschijning van een klein fluorescent stipje. Bevestig tenslotte in de software voor scanbeelden een gebeurtenis door de snel stijgende fase van het fluorescentiesignaal over een region of interest voor een wild-type muis.Met het in deze video gedemonstreerde protocol worden ongeveer 200 eilandjes van Langerhans verwacht. Gezonde eilandjes zien er helder en rond uit en hebben een gladde rand. Een onderverteerde isolatiebatch bevat doorgaans kleine, wazige eilandjes en eilandjes waaraan acinaire cellen vastzitten.Terwijl een te sterk gedigesteerde batch minder oogjes vertoont in de tweefoton-assay als reactie op stimuli zoals glucose of hoog kalium, fuseren insulegranules met het plasmamembraan, waarbij een SRB de granules binnendringt, wat resulteert in het verschijnen van een plotseling fluorescent spotje van ongeveer 400 nanometers in diameter. Binnen de geregistreerde tijd worden alle exo-gebeurtenissen als reactie op de stimulus geïdentificeerd, evenals de locatie van de gebeurtenissen, het tijdstip van verschijnen, de duur en het type fusie. Gebeurtenissen zoals KISS en Run of volledige fusie worden gekarakteriseerd en zijn waardevol voor het beoordelen van eventuele defecten in de granulefusie in modellen van diabetes type 2.Deze methode werd gebruikt om aan te tonen dat het defect in diabetische DB/DB-eilandjes het verlies van volledige korrelfusie is en niet een verandering in de kinetiek van individuele korrelfusie. Bovendien is de belangrijkste factor die bijdraagt aan de verminderde insulinesecretie bij de ziekte een afname van het aantal responsieve cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de pancreaspersfusie en de stimulatie van eilandjes van RDB-muizen en in staat moeten zijn om de twee ton-assays uit te voeren om de secretie-responsen binnen intacte eilandjes te beoordelen.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

This video demonstrates an imaging-based method to visualize transplanted luciferase-expressing beta cells into a non-obese diabetic immunodeficient mouse. The introduction of splenocytes from a diabetic mouse leads to progressive beta cell destruction, visually confirmed by declining luminescence after substrate introduction.

Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes

Een nieuwe benadering van het combineren van de intra-oculaire transplantatie en confocale microscopie maakt longitudinale, niet-invasieve real-time beeldvorming met single-cell resolutie binnen geënt...

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming met Single-cell resolutie in real-time

Beschrijven we een protocol voor visualisatie van insuline exocytose in intact eilandjes met behulp van pHluorin, een pH-gevoelige groen fluorescent proteïne. Geïsoleerde eilandjes zijn besmet met adenovirus codering pHluorin gekoppeld aan het blaasje lading neuropeptide Y. Dit zorgt voor de detectie van insuline submodule fusion gebeurtenissen door confocale microscopie.

Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer de isolatie van eilandjes van Langerhans uit Lepr db muizen en live-cell 2-photon imaging om insulinesecretie van bètacellen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers diabetesmechanismen te begrijpen.

LepR

Meer video's verkennen