LepR

Het algemene doel van deze procedure is om levensvatige eilandjes van Langerhans te verkrijgen uit diabetische LEP R DB-muizen en de insulinesecretie van bètacellen binnen deze eilandjes te beoordelen met behulp van live-cell twee-foton-imaging. Dit wordt bereikt door eerst reagentia voor te bereiden, zoals het enzymmengsel voor de pancreasdigestie, het kweekmedium voor de cultivering van de eilandjes en de extracellulaire buffer voor de twee-foton-assay. Vervolgens wordt de buikholte van een geëuthanaseerde muis geopend en wordt het enzymmengsel in de pancreas geïnjecteerd om het orgaan te verteren.

Vervolgens worden de eyelets gescheiden van het pancreassubstraat en gekweekt. Ten slotte wordt tweefotonmicroscopie gebruikt om de fusie van individuele insulinegranula uit bètacellen binnen de eyelet in beeld te brengen. Uiteindelijk zal dit protocol onderzoekers helpen begrijpen hoe de insulinesecretie wordt gereguleerd bij gezondheid en ziekte.

De belangrijkste verfijning van de techniek voor het isoleren van eilandjes van Langerhans is het gebruik van gemengde enzymen om de opbrengst en de levensvatbaarheid van de eilandjes te verbeteren. De twee-foton-beeldvormingstechniek is momenteel de enige methode om de insulinesecretie van meerdere cellen binnen een intact eilandje vast te leggen. Om de enzymen voor het isoleren van pancreaseilandjes voor te bereiden, wordt één vial van vijf milligram liase TL verdund met 26 milliliter DM EM; bereid de collagenase type vier in Hank's buffer tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter, aangevuld met de volgende gemengde liase TL- en collagenase-oplossingen.

Verdeel het enzymmengsel in aliquots van 2,5 milliliter elk in een volumeverhouding van vier op één en bewaar deze bij -20 °C. Om RPMI-isolatiemedium te bereiden, los één vial RPMI 1 6 4 0 poeder op kamertemperatuur op in een grote conische kolf met één liter water en voeg twee gram natriumbicarbonaat en 4,02 gram HEPES toe. Gebruik natriumhydroxide om de pH op 7,4 in te stellen, filter het mengsel vervolgens steriel en bewaar het bij 4 °C.

Maak RPMI-kweekmedium door 10% FBS en 1% antibiotica toe te voegen aan het RPMI-isolatiemedium voor twee-foton-imaging. Bereid een natriumrijke extracellulaire buffer met de volgende reagentia. Om de extracellulaire kleurstof te bereiden, wordt een stockoplossing van 8 mM SRB gemaakt; verdeel de extracellulaire buffer over kleine buisjes en bewaar deze bij -20 °C.

Om een werkconcentratie te verkrijgen, gebruik vers extracellulair buffer om de SRB-stock op 1:10 te verdunnen. Na het opofferen van een muis en het grondig bespuiten van het lichaam van de muis met 70% ethanol volgens het tekstprotocol, positioneert u het dier met de kop naar de chirurg en de staart van de chirurg afgewendt. Maak twee lange laterale incisies door de abdominale huid en het peritoneum om een V-vormige lap te creëren.

Trek de huidflap omhoog om de gehele buikholte bloot te leggen. Leg de darm opzij en houd met het gevouwen weefsel de lever op zijn plaats om de gemeenschappelijke galgang zichtbaar te maken. Plaats vervolgens een vaatklem bij de ampulla op de wand van het duodenum om te voorkomen dat de geïnjecteerde enzymen in het duodenum terechtkomen.

Dit is een belangrijke stap die bepaalt of de pancreasenzymen de pancreasgang in via reflux gaan, bij de injectieplaats blijven of in het duodenum terechtkomen. Gebruik een naald van 31 gauge om de ductus choledochus te canuleren nabij de samenvoeging van de ductus hepaticus communis en de ductus cysticus, en laat ruimte over voor een tweede injectie. Als de pancreas de eerste keer niet wordt geperfuseerd, injecteer dan langzaam ongeveer twee milliliters van het koude enzymmengsel in de ductus choledochus van de muis.

Als de klem in de juiste positie staat, zal de pancreas snel worden geperfuseerd. Zodra de pancreas is geperfuseerd, wordt het orgaan snel verwijderd, in een glazen flacon geplaatst en ongeveer 19 minuten geïncubeerd in een waterbad van 37 °C. Stop na de incubatie het digestieproces door ongeveer 20 milliliters koud isolatiemedium toe te voegen.

Schud het flacon voorzichtig om de pancreas te homogeniseren en giet deze door een normale T-zeef met een poriegrootte van 1 mm in een steriele buis van 50 ml. Vul de buis aan met het isolatiemedium en centrifugeer bij 400 G en 4 °C gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en voeg isolatiemedium toe aan het pellet om het op te lossen.

Breng de suspensie vervolgens over naar twee buisjes van 15 milliliter en centrifugeer een tweede keer. Na het aspireren van het supernatant voegt u zes milliliter densiteitsgradiënt-celseparatiemedium toe aan elk buisje en resuspendeert u dit met een pipet of door middel van vortexen. Voeg vervolgens, langs de wand van de buisjes, voorzichtig ongeveer zes milliliter isolatiemedium toe bovenop het densiteitsgradiënt-separatiemedium en centrifugeer bij 100 G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.

Verzamel na het scheiden de bovenste, middelste en onderste lagen in drie afzonderlijke schaaltjes. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop een pipet om de oogjes in de drie schaaltjes handmatig te selecteren. De meeste oogjes zullen zich in de middelste laag bevinden, wat helpt bij het herstel van de oogjes na de enzymatische digestie.

Bereid groepen van 40 eilandjes voor in Petri-schalen van 25 centimeter met zes milliliter RPMI-kweekmedium dat 10 millimolair glucose bevat en kweek deze gedurende twee dagen. Verschoon het medium dagelijks om tweefoton-imaging uit te voeren als indirecte assay om de insulinesecretie te meten. Begin met het pre-incuberen van de twee dagen gekweekte eilandjes in een extracellulaire buffer met drie millimolair glucose.

Breng gedurende 30 minuten vet aan op de objecttafel van de microscoop om lekkage van de oplossing te voorkomen en monteer de thermocontrolekamer met een glazen objectglas op de objecttafel. Vul de kamer vervolgens met 500 µL extracellulaire buffer die 0,8 mM SRB en verschillende glucoseconcentraties bevat. Plaats daarna het vooraf geïncubeerde ooglid in het midden van de kamer en focus op drie tot vier cellagen in het ooglid.

Waar in de eilandjes van Langerhans van knaagdieren immuunkleuring voor insuline aantoont dat de meeste cellen bètacellen zijn. Identificeer vervolgens met de tweefotonmicroscoop en een 60 x olie-immersieobjectief individuele exocytotische gebeurtenissen aan de hand van de plotselinge verschijning van een klein fluorescent stipje. Bevestig tenslotte in de software voor scanbeelden een gebeurtenis door de snel stijgende fase van het fluorescentiesignaal over een region of interest voor een wild-type muis.

Met het in deze video gedemonstreerde protocol worden ongeveer 200 eilandjes van Langerhans verwacht. Gezonde eilandjes zien er helder en rond uit en hebben een gladde rand. Een onderverteerde isolatiebatch bevat doorgaans kleine, wazige eilandjes en eilandjes waaraan acinaire cellen vastzitten.

Terwijl een te sterk gedigesteerde batch minder oogjes vertoont in de tweefoton-assay als reactie op stimuli zoals glucose of hoog kalium, fuseren insulegranules met het plasmamembraan, waarbij een SRB de granules binnendringt, wat resulteert in het verschijnen van een plotseling fluorescent spotje van ongeveer 400 nanometers in diameter. Binnen de geregistreerde tijd worden alle exo-gebeurtenissen als reactie op de stimulus geïdentificeerd, evenals de locatie van de gebeurtenissen, het tijdstip van verschijnen, de duur en het type fusie. Gebeurtenissen zoals KISS en Run of volledige fusie worden gekarakteriseerd en zijn waardevol voor het beoordelen van eventuele defecten in de granulefusie in modellen van diabetes type 2.

Deze methode werd gebruikt om aan te tonen dat het defect in diabetische DB/DB-eilandjes het verlies van volledige korrelfusie is en niet een verandering in de kinetiek van individuele korrelfusie. Bovendien is de belangrijkste factor die bijdraagt aan de verminderde insulinesecretie bij de ziekte een afname van het aantal responsieve cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de pancreaspersfusie en de stimulatie van eilandjes van RDB-muizen en in staat moeten zijn om de twee ton-assays uit te voeren om de secretie-responsen binnen intacte eilandjes te beoordelen.