Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamidegels in een multi-wellplaatformaat mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de gelvoorlopersolutie te sandwiches tussen een hydrofoob gecoate glasplaat en een flexibele plastic drager met een acrylamide-hechtlaag. De tweede stap is om de gel van de glasplaat af te pellen, nadat deze tijdens de polymerisatie covalent aan de flexibele plastic drager is gebonden, en deze te laten drogen.

Vervolgens worden de droge gel en de onderliggende flexibele plastic drager in de gewenste vormen gesneden en met de plastic zijde naar beneden gelijmd op de bodems van de putjes van een multi-well plaat of een ander celkweekvat. De laatste stap is het coaten van de geassembleerde polyacrylamidegels in de multi-well plaat met een celadhesieve coating, zoals een monolaag van collageen type één. Uiteindelijk worden microscopie en andere celkarakteriseringstechnieken gebruikt om het effect van het onderliggende polyacrylamidesubstraat waar te nemen.

In het bijzonder de invloed van de stijfheid op het celgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden is dat het de verwerking van elke stijfheid en dikte van polygelen mogelijk maakt, evenals hun assemblage in een multi-wellplaatformaat, op een kostenefficiënte en tijdsefficiënte manier die door andere methoden niet wordt geboden. De procedure zal worden gedemonstreerd door een student in mijn laboratorium.

Bereid eerst de precursoroplossing voor de polyacrylamidegel door acrylamide, de crosslinker bisacrylamide en gedeïoniseerd water te mengen; los Sul OPA op in dimethylsulfoxide bij 50 mg/mL. Verdeel 20 µL van de stockoplossing over 10 microcentrifugebuisjes. Vries de oplossingen vervolgens snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.

Los vervolgens ammoniumpersulfaat op in gedeïoniseerd water om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 10% gewicht per volume te bereiken. Pipetteer 25 µL van de ammoniumpersulfaatoplossing in 10 microcentrifugebuisjes en bewaar deze bij -20 °C. Bereid een collageenoplossing van 0,2 mg/mL door de collageen type I-stamsolution te verdunnen in 1x PBS bij pH 7,4.

Alle oplossingen worden tot aan het gebruik op ijs bewaard. Breng op dit punt enkele druppels van een hydrofobe oplossing aan op een glasplaat en gebruik vloeipapier om dit over het oppervlak te verspreiden. Nadat de plaat aan de lucht is gedroogd, wordt deze opnieuw met vloeipapier afgeveegd om de hydrofobe coating te egaliseren.

Snijd een flexibele plastic houder op maat van de hydrofoob gecoate glasplaat. Markeer vervolgens de hydrofobe zijde van de flexibele plastic houder door de oppervlakte lichtjes te bekrassen met een scherp instrument, zoals een scalpel. Voeg voor de gelbereiding 4972,5 µL polyacrylamide-precursoroplossing van de gewenste eindconcentratie toe aan een conische buis van 50 mL.

Plaats de buis gedurende 30 minuten met de dop open in een ontgassingskamer. Voeg vervolgens 25 µL van de eerder bereide ammoniumpersulfaatoplossing toe aan de DGAs-geloplossing om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 0,05% te bereiken. Voeg daarna 2,5 µL TM me toe om een uiteindelijke TM ME-concentratie van 0,5% te bereiken. Meng de oplossing voorzichtig door drie tot vijf keer op en neer te pipetteren. Plaats vervolgens siliconen spacers van de gewenste dikte op de hydrofiele zijde van de flexibele plastic drager.

Pipetteer vervolgens de gelloplossing op de flexibele plastic ondersteuning tussen de spacers en klem deze vast met een glazen plaatje met een hydrofobe coating. Laat de gel 45 minuten polymeriseren, verwijder dan de flexibele plastic ondersteuning met de covalent gebonden polyacrylamidegel aan de bovenzijde en leg de gel met de gelzijde naar boven om aan de lucht te drogen. Snijd de polyacrylamidegel na het drogen in de gewenste vormen.

Bereid ongeveer 500 microliters polymethylsiloxaan per 96-wells plaat voor volgens de instructies van de fabrikant om de gels aan de bodem van een multi-well plaat te lijmen. Plaats met een pincet een kleine druppel polymethylsiloxaan in het midden van elke well. Plaats in elke well één polyacrylamidegel met de flexibele plastic ondersteuning naar beneden.

Nadat de polydimethylsiloxaan is uitgehard, plaatst u met een transferpipet een kleine hoeveelheid van de eerder bereide cellulose-sample in elke put en draait u deze van zijde naar zijde om het geloppervlak gelijkmatig te coaten. Plaats de wellplaat gedurende vijf minuten onder een UV-lamp met hoge intensiteit. Spoel de gels na afloop met PBS om overtollige cellulose te verwijderen.

Pipette vervolgens ongeveer 50 µL van de eerder bereide collageen type I-oplossing in elke well. Laat de plaat afgedekt bij kamertemperatuur gedurende ten minste twee uur staan, waarna het overschot aan collageenoplossing wordt verwijderd door te spoelen met PBS. Steriliseer de gels gedurende twee uur onder UV-licht in een celkweekkast.

Week tot slot de gels gedurende de nacht in compleet medium om ze te hydrateren en te equilibreren. Gebruik de gels onmiddellijk voor het plaatsen van cellen of bewaar ze maximaal twee dagen in de koelkast; de Young-modulus als functie van verschillende acrylamide- en bisacrylamideconcentraties, respectievelijk aangeduid als A en B, wordt hier zoals verwacht weergegeven.

Zowel de opslagmodulus G prime als de verliesmodulus G double prime zijn onafhankelijk van de frequentie. Ook werd bevestigd dat het drogen en vervolgens rehydrateren van de gels geen invloed had op hun Young-modulus. Door gebruik te maken van de crosslinker Sulo sampa kan een uniforme collageencoating op hydrogels van elke stijfheid worden bereikt.

Er werd waargenomen dat wanneer borstkanker M-D-A-M-B 2 31-cellen gedurende 24 uur op polyacrylamidegels werden gezaaid, deze rond bleven op de zachte 0,5 en 1 kilo pascal gels, maar in staat waren uit te spreiden en te verlengen op de stijve 100 kilo pascal gel. Bovendien zijn hydrogels die op de flexibele plastic ondersteuning zijn gemaakt transparant, wat eenvoudige visualisatie en microscopie mogelijk maakt. Daarnaast vertoont de flexibele plastic ondersteuning geen autofluorescentie en verstoort deze derhalve de beeldvorming van fluorescentie-gelabelde cellen niet.

De celmorfologie werd verder gekwantificeerd op basis van het totale celuitspreidingsareaal en de celcirculariteit. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u op een efficiënte en goedkope manier polyamidegels kunt assembleren in een multi-well plaatformaat voor de studie van stijfheidsafhankelijke celbiologie.