Name: Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer een snelle en kostenefficiënte methode voor het bereiden van polyacrylamidegels in multiwell-platen om stijfheidsafhankelijke celresponsen te bestuderen. Deze techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door start-up fondsen verstrekt aan Dr. Silviya Zustiak door Saint Louis University, evenals door een President's Research Fund (PRF)-subsidie toegekend aan Dr. Silviya Zustiak door Saint Louis University. We danken Naveed Ahmed en Keval Shah voor hun technische assistentie.

1. Bereiding van Hydrogel-geassocieerde oplossingen en Aliquots <ol><li> Bereiding van polyacrylamide gel precursor oplossing. <ol><li> Bereid polyacrylamide gel precursor oplossing door mengen acrylamide (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), de crosslinker bisacrylamide (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), en de- geïoniseerd water in het volume percentages in tabel 1. Opmerking: Deze oplossingen kunnen worden bereid in grote hoeveelheden en bij 4 ° C gedurende enkele maanden. <ol><li> WAARSCHUWING: Acrylamide toxisch bij inhalatie of inname, vooral wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 40% w / v oplossing toxiciteit risico&#39;s. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (&lt;23 ° C, goed geventileerde ruimte). </li><li> LET OP: Bis-acrylamide is giftig bij inademing of inname, in het bijzonder,wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 2% w / v oplossing toxiciteit risico&#39;s. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (&lt;4 ° C, goed geventileerde ruimte). </li></ol></li></ol></li><li> Voorbereiding en het gebruik van N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrofenylamino) hexanoaat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) porties. LET OP: Sulfo-SANPAH veroorzaakt ernstige oogirritatie; handvat met handschoenen en een goede oog- of gelaatsbescherming. Bewaren bij -20 ° C na ontvangst en voor aliquoteren. <ol><li> Om sulfo-SANPAH opslaan: los sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bij 50 mg / ml. Aliquot de stockoplossing in 50 micro centrifuge buizen van 20 ui per buis. Flash bevriezing op droog ijs of vloeibare stikstof (optioneel maar voorkeursstap maximale verknopingsmiddel efficiëntie behouden) en bewaar bij -80 ° C. OPMERKING: De porties can worden opgeslagen voor enkele maanden. </li><li> Om sulfo-SANPAH gebruiken: ontdooien de hoeveelheid kort en verdund in 480 ul van gedeïoniseerd water. Onmiddellijk gebruiken. Sulfo-SANPAH hydrolyseert snel in water: dus voorzichtigheid te nemen om al het bovenstaande stappen snel uit te voeren. </li></ol></li><li> Bereiding van ammoniumpersulfaat (Mr 228,18 g / mol) hoeveelheden. OPMERKING: Ammoniumpersulfaat veroorzaakt ogen, huid en irritatie van de luchtwegen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Handvat ammoniumpersulfaat poeder in een zuurkast. Bewaren poeder in een droge, goed geventileerde plaats. Eenmaal porties verdeeld, kan de verdunde oplossing worden gebruikt op de werkbank. <ol><li> Los ammoniumpersulfaat in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke ammoniumpersulfaat concentratie van 10% g / v te bereiken. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Ontdooi onmiddellijk voor gebruik. </li></ol></li><li> Bereiding van collageen type I oplossing. <ol><li> Bereid 0,2 mg / ml collageen oplossing door verdunning van de voorraad, zodatlutie in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4. Slaan op ijs kort of onmiddellijk gebruik na verdunning. </li></ol></li></ol> 2. Hydrogel Voorbereiding (zie Figuur 1) <ol><li> Bereiding van hydrofobe glasplaatjes. <ol><li> Plaats een paar druppels van een hydrofobe oplossing op een glasplaat en gebruik tissue verspreid over het oppervlak. Laat aan de lucht drogen en veeg met een papieren zakdoekje weer om zelfs uit de hydrofobe coating. OPMERKING: Bewaren hydrofobe oplossing in een brandbare kast bij RT. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Werk in een goed geventileerde ruimte. </li></ol></li><li> Voorbereiding van flexibele kunststof steun. <ol><li> Snij de flexibele plastic steun aan de grootte van de hydrofobe beklede glasplaat passen. </li><li> Markeren de hydrofobe kant van de flexibele plastic steun door licht krassen op het oppervlak met een scherp voorwerp, zoals een scalpel. OPMERKING: Zodra de gel - en dat is volledig transparant - Dries, De krassen zal helpen onderscheiden welke flexibele kunststof steun kant bevat de gel. OPMERKING: De flexibele plastic drager een hydrofoob en een hydrofiel kant. Eenmaal afgezet, polyacrylamide permanent houdt zich aan de hydrofiele kant van de plastic steun die gemakkelijk daaropvolgende hydrogel hantering vergemakkelijkt. </li></ol></li><li> Gel Bereiding (bijvoorbeeld volumes gegeven 5 ml gel precursor toegevoegd). OPMERKING: 5 ml voldoende is om ~ 40 gels zou zijn wanneer de gel oorspronkelijke dikte is 0,5 mm. Meer gels kunnen ontstaan ​​indien de gel dikte wordt verminderd. <ol><li> Plaats 4972,5 ui polyacrylamide precursor oplossing gewenste eindconcentratie (tabel 1) in een 50 ml conische buis. Plaats in een ontgassingskamer gedurende 30 min met de dop geopend. OPMERKING: Zuurstof fungeert als een vrije radicalen vanger en, indien aanwezig, het remt polymerisatie. </li><li> Voeg 25 ul van 10% w / v ammoniumpersulfaat (zie punt 1.3) tot een uiteindelijke bereikenammoniumpersulfaat concentratie van 0,05%. </li><li> Voeg 2,5 gl N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethylethyleendiamine (TEMED, M r 116,24 g / mol) aan de ontgaste gel oplossing tot een uiteindelijke TEMED concentratie van 0,5% te bereiken. OPMERKING: Bewaren TEMED in een brandbare kast bij RT. Hanteer in een zuurkast bij het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Goed gesloten houden onder inert gas, want het is zeer lucht en vocht gevoelig. </li><li> Meng de oplossing voorzichtig door en neer te pipetteren 3-5 keer. Niet vortex diffusie van zuurstof in de gel precursor oplossing voorkomen. </li><li> Pipetteer de gel oplossing op de hydrofiele kant van de flexibele plastic steun en sandwich met hydrofobe coating glasplaatje. Scheid de twee dia met siliconen afstandhouders van gewenste dikte (bijvoorbeeld 0,5 mm). Laat een kleine hoeveelheid (-100 pl) polymeer precursor oplossing in de 50 ml conische buis te gebruiken als een indicator van gelering. OPMERKING:Elke spacer worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een enkele strook van Parafilm geeft een definitieve gezwollen gel dikte van 100-120 urn. </li><li> Plaats een andere glasplaat boven op de flexibele plastic support / gel-sandwich tot een nog hydrogel oppervlak nagaan bij polymerisatie. </li><li> Laat de gel polymeriseren gedurende 45 min, hoewel minder tijd kan worden gebruikt voor gels hoger% gew indien gewenst. Ervan te vergewissen dat de gel is gepolymeriseerd, observeert de resterende oplossing in de 50 ml conische buis; indien de resterende oplossing gegeleerd, dan is het waarschijnlijk dat gelering op de glasplaat is ook geïnitieerd. Merk echter op dat voortijdige opening van de mal wordt voorkomen dat volledige polymerisatie. </li><li> Zodra de gel wordt gevormd, schil van de flexibele plastic ondersteuning met het covalent gebonden polyacrylamidegel- op de top, en stel gel-side-up aan de lucht drogen. OPMERKING: Convectie of warmte drogen kan ook worden gebruikt om deze stap te versnellen. Eenmaal gedroogd op de flexibele kunststof steun, kan de gel winkelonbepaalde tijd d. <ol><li> Markeert geen kale plekken van de flexibele plastic steun, waar polyacrylamidegelen vormden geen gevolg van bubbels. Mark, terwijl de gel wordt nog steeds gehydrateerd, omdat dit zal in combinatie met de flexibele kunststof voor ondersteuning zodra de gel droog is. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Multiwell Plate Assembly, Collageen Coating, en Sterilisatie <ol><li> Multiwell plaat montage. <ol><li> Eenmaal gedroogd, gesneden PA gels in de gewenste vorm. <ol><li> Voor een 96-well plaat, gebruik maken van een heavy-duty perforator met een diameter van ~ 6 mm. Gebruik een heavy-duty papiersnijder te gels gesneden in vierkante of rechthoekige vormen. U kunt ook gebruik maken van een schaar. </li></ol></li><li> Bereid ongeveer 500 pl PDMS per plaat met 96 putjes volgens de instructies van de fabrikant. Om de gels aan de bodem van een multi-putjesplaat lijm, plaats een kleine druppel (~ 5 pl) van polydimethylsiloxaan (PDMS) in het midden van elk putje. Met behulp van een tang, plaats een polyacrylamidee gel in elk putje, flexibele plastic steun naar beneden. Toestaan ​​PDMS uitharden, laat de gemonteerde plaat bij 37 ° C gedurende minimaal 4 uur. </li></ol></li><li> Collageen coating van polyacrylamide gels. <ol><li> Met een transfer pipet, plaats een kleine hoeveelheid (7-8 pl) van sulfo-SANPAH (zie punt 1.2.2) goed en werveling in elk van links naar rechts om de vacht van de gel oppervlak gelijkmatig. Werken prompt sinds sulfo-SANPAH is niet stabiel in het water. </li><li> Plaats de wells plaat onder een UV-lamp met hoge intensiteit (intensiteit = 37 mW, λ = 302-365 nm) gedurende 5 min. Spoel de gels met PBS om overtollig sulfo-SANPAH verwijderen. </li><li> Pipetteer 50 ul van 0,2 mg / ml collageen type I oplossing (zie punt 1.4) in elk putje. Laat de plaat afgedekt bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur of O / N bij 4 ° C. OPMERKING: Om het proces te versnellen van collageen coating, kan een transfer pipet worden gebruikt om de collageen-oplossing toe te voegen. Typisch, 1 - 2 druppels dient oplossing genoeg voltooienly bedekken de gel oppervlak. </li><li> Laat de put plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur aan collageen binding staan. </li><li> Spoelen met PBS om het teveel aan collageen oplossing te verwijderen en te steriliseren onder UV (λ = 200 nm) in een weefselkweek kap voor 2 uur. </li><li> Week de gels in compleet medium (zie paragraaf 4.1 voor de samenstelling van het medium) O / N om te hydrateren en evenwicht. Gebruiken voor cell onmiddellijk of op te slaan zaaien in de koelkast tot 2 dagen. </li></ol></li></ol> 4. Cell Zaaien op PA Stijfheid Assay Opmerking Hoewel typisch voor zachte zoogdiercellijnen, het protocol beschreven in dit gedeelte wordt specifiek gebruikt met borstkanker MDA-MB-231 cellijn (zie figuren 4 en 5). <ol><li> Verzamel cellen van weefselkweek kolf blootstelling aan 5% trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per elke cm 2 van de kolf gebied; bijvoorbeeld, gebruik 2 ml trypsine / EDTA fora T25 celkweekkolf. Resuspendeer verzamelde cellen in compleet medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine bij een gewenste uiteindelijke celconcentratie. Gezien cel verdubbelingstijd en de tijd de cellen worden gezaaid op de assay Kies een geschikte sub-confluente celconcentratie. Ervoor zorgen dat de toegevoegde medium is genoeg om helemaal onder te dompelen de hydrogels. OPMERKING: Aangezien hydrogelen werden vooraf geëquilibreerd in media (zie 3.2.6 stap) 100 pl volume voldoende zijn. Typische medium volumes voor putjes moeten toereikend, omdat de gels werden vooraf geëquilibreerd in media in de vorige stap. OPMERKING: De test geschikt voor elke attachment-afhankelijke celtype zou zijn. <ol><li> Telling aantal cellen onder een omgekeerde microscoop met behulp van een hemacytometer. Load 10 ul van celsuspensie in elk hemacytometer poort en het gemiddelde van het aantal cellen van ten minste 8 kwadranten. Om het te krijgeneindcelconcentratie, vermenigvuldig het aantal cellen met 10 4. OPMERKING: Beste celgetal resultaten worden verkregen als het aantal cellen in elke hemacytometer kwadrant is 20-50. </li></ol></li><li> Kweek van de cellen op de PA stijfheid assay in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Veranderen media elke 2-3 dagen. Verzamel cellen indien nodig door blootstelling aan 5% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per cm2 van weefselkweek kolf. Tijdens alle cel manipulatie stappen te nemen speciale zorg van de hydrogel oppervlak niet te verstoren: aspireren of pipet medium door lichtjes kantelen van de multi- plaat zijwaarts en aanraken van de pipet op de zijwand van elk putje, in tegenstelling tot het aanraken van de hydrogel. OPMERKING: Behalve lettend de hydrogel oppervlak tijdens standaard weefselkweek behandeling niet te beschadigen, de cellen gezaaid op de stijfheid test kan worden gemanipuleerd op dezelfde wijze als wanneer zij werden geënt opnaar een reguliere meerdere putjes plaat. </li></ol> 5. Beeldvorming van cellen gezaaid op PA Stijfheid Assay <ol><li> Afbeelding cellen direct aan de PA stijfheid test. OPMERKING: microscoop - omgekeerd, fluorescent, of confocale kunnen worden gebruikt cell imaging. OPMERKING: De flexibele kunststof steun gebruikt om de stijfheid test te construeren is volledig transparant en niet autofluoresce of interfereren met cell imaging. Echter, hoewel de flexibele kunststof drager zelf transparant, grafische mogelijkheden beperkt door de werkafstand van de doelstelling. De flexibele kunststof drager heeft een dikte van 0,23 mm en een typische werkafstand van een 10X objectief is ~ 4 mm, sterk dalende hogere vergrotingen. <ol><li> Voor live cell imaging, positie PA stijfheid test in microscoop plaathouder en imago. Houd beeldvorming sessies onder de 2 uur, of gebruik een microscoop voorzien van een milieu-kamer voor langere belichtingstijden. </li><li> Wanneer levende cellen imaging is niet het doel, te repareren cellen in 4% formaldehyde-oplossing aangevuld met 0,1% wasmiddel. Geniet cellen in fixeermiddel bij kamertemperatuur gedurende minimaal 2 uur. Spoelen met PBS twee keer. Gooi fixatief afval in een aangewezen afvalcontainer. OPMERKING: Cellen kunnen direct worden afgebeeld of opgeslagen ondergedompeld in PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. LET OP: Formaldehyde is giftig bij inademing en contact. Handvat met handschoenen in een zuurkast. OPMERKING: Cel fixatie protocol worden gekozen op basis van de volgende cel kleuring en behandeling protocollen, omdat sommige fixeermiddelen beschadigen enkele cel eiwitten. </li><li> Voor fluorescerende beeldvorming, vlek vaste cellen met gewenste cel vlek direct in de multi- plaat. Afbeelding onmiddellijk. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3, 299-306 (2007).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+A+stiff+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: A stiff response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Watt, F. M., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).</li>
<li>Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiwell+stiffness+assay+for+the+study+of+cell+responsiveness+to+cytotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs.</a> Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).</li>
<li>Mih, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+platform+for+studying+stiffness-dependent+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology.</a> PLoS One. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PloS one. 7 (10), e46107(2012).</li>
<li>Herrick, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).</li>
<li>Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+matrix+elasticity+with+PEG+hydrogels+to+study+melanoma+drug+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness.</a> Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+influences+the+outcome+of+antitumor+drug+screening+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+hemorheology+and+microcirculation%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro.</a> Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).</li>
<li>Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Three-Dimensional+Matrix+Stiffness+in+Regulating+the+Response+of+Human+Neural+Cells+to+Toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS one. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).</li>
<li>Kumachev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+hydrogel+microbeads+with+varying+elasticity+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+cell+function+with+geometrically+modulated+elastomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates.</a> Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]</a>. 10 (Unit 10 16), (2010).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+of+adult+adipose-derived+stem+cells+using+substrates+that+mimic+the+stiffness+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue.</a> Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).</li>
<li>Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hepatocellular+morphogenesis+and+function+via+ligand-presenting+hydrogels+with+graded+mechanical+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance.</a> Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+mechanical+communication+through+compliant+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell-cell mechanical communication through compliant substrates.</a> Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).</li>
<li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li>
<li>Quinlan, A. M., Billiar, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+role+of+substrate+stiffness+in+the+persistence+of+valvular+interstitial+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
<li>Chrambach, A., Rodbard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Science. 172 (3982), 440-451 (1971).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).</li>
<li>Chrambach, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChrambach%2C+A+%22The+Practice+of+Quantitative+Gel+Electrophoresis%22">The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis</a>. , (1985).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+generating+patterned+co-cultures+with+stable+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces.</a> BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).</li>
<li>Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+molecules+and+fibronectin-mediated+cell+adhesion%3A+effect+of+proteolytic+digestion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins.</a> The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).</li>
<li>Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creasing+instability+of+surface-attached+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Creasing instability of surface-attached hydrogels.</a> Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).</li>
<li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+creasing+instability+of+soft+polyacrylamide+cell+culture+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates.</a> Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).</li>
<li>Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+force+microscopy+on+elastic+layers+of+finite+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness.</a> Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Polyacrylamide gels, oorspronkelijk ontwikkeld voor elektroforese, 28 worden nu routinematig gebruikt als celkweek substraten om de effecten van substraat stijfheid op celmorfologie, beweeglijkheid en communicatie 3,24,29 onder celeigenschappen bestuderen. Polyacrylamide staat manipulatie substraat stijfheid om de stijfheid van alle zachte weefsels in het lichaam omvatten (0,3-300 kPa) 1 met een eenvoudige verandering in polymeervoorloper concentratie (Figuur 2, Tabel 1,...

De meeste lichaamsweefsels zijn zacht visco-elastisch materiaal met een elasticiteitsmodulus van 0,1 kPa hersenen 100 kPa zachte kraakbeen, maar de meeste in vitro-onderzoek verricht naar weefselkweek polystyreen (TCP) dat een modulus van ~ 1 GPa heeft . 1 Deze stijfheid mismatch grote invloed op de manier waarop cellen reageren op hun omgeving. Een groeiende hoeveelheid onderzoek is dus gewijd aan het ophelderen van het effect van substraat stijfheid over het lot van verscheidene celtypen, waaronder 2,3 stamcellen. 4 Daardoor zijn verschillende hydrogels ontwikkeld om te helpen bij het ​​begrijpen van stijfheid-afhankelijke cellijn biologie waaronder polyacrylamide (PA), 5-7 polyethyleenglycol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxaan (PDMS), 10 en alginaat. 11 Hoewel het bewijs dat substraat stijfheid heeft een aanzienlijke impact op de lot van de cel groeit, de meeste studies zijn uitgevoerd op kleine schaal met een klein aantal jarenamples. Systematische, multidimensionale studies naar het effect van substraat stijfheid voor een serie van celtypen of milieuomstandigheden zijn zeldzaam. 12 Verscheidene veelbelovende high-throughput hydrogel technieken ontwikkeld, zoals PEG-gebaseerde microarrays, 13 microfluïdische inrichtingen voor de productie van agarose hydrogel microbolletjes, 14 of micro- en nano-stangen waar stijfheid wordt gemoduleerd door de diameter en hoogte van de microrods. 15 Nochtans , de technologieën voor te bereiden dergelijke substraten zijn verfijnde en beschikbaar voor een beperkt aantal laboratoria. Veel onderzoek met stijfheid gemoduleerd celresponsen gebruik polyacrylamide (PA) gels die niet alleen goedkoop en eenvoudig te implementeren, maar vertonen ook een fysiologisch relevant bereik van Young&#39;s modulus, namelijk 0,3 -. 300 kPa 16-22 De bestaande werkwijzen te vervaardigen PA gels voor celcultuur zijn arbeidsintensief en dus prepared in kleine batches. Enkele moeilijkheden bij de bereiding van PA gels celsubstraten voort uit het vereiste dat de gels worden bereid: 1) in afwezigheid van zuurstof om volledige polymerisatie mogelijk, 2) met een vlakke oppervlakte uniforme cel toe hechting en verspreiding, en 3) vast aan de onderkant van de celkweekschaal te voorkomen drijven. Verschillende groepen hebben geprobeerd om PA gels voor celcultuur te produceren in grote batches. Semler et al. Bereide dikke vellen PA gels waarvan vervolgens &quot;cut&quot; met een perforator en geplaatst in 96-well platen. 23 Deze methode is beperkt tot stijver gels, namelijk&gt; 1 kPa in Young&#39;s modulus, want zachter gels zijn &quot;sticky&quot;, moeilijk te snijden en gemakkelijk beschadigd. Mih et al. Ontwikkelden een meer geavanceerde techniek waardoor de gels rechtstreeks worden gepolymeriseerd glazen bodem multi- putjesplaat. <sup&gt; 6 Dit werd bereikt door het gieten van de gel-oplossingen in gefunctionaliseerde glas-bodemplaten en de vorming van gels door &quot;sandwichen&quot; ze met een aangepaste dekglaasje array. 6 Hoewel veelbelovend, lichte voorsprong effecten werden nog waargenomen met deze techniek. Daarnaast is de techniek vereist een speciaal ontworpen matrix niet onmiddellijk door veel laboratoria en kostbare glazen bodem putjes. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om PA gels monteren in een plaat met meerdere putjes die door elk laboratorium gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. Hier wordt een flexibele kunststof gebruikte drager, die twee kanten heeft - een hydrofoob is, dat afweermiddel voor PA gels, en een hydrofiele, die covalent bindt PA gel op afzetting. Zodra PA gel platen worden gedeponeerd en permanent aangebracht op de flexibele kunststof steun, maakt het hanteren van gels van elke dikte of stijfheid en snij ze in elke gewenste vorm. Dit ca.oach produceert niet alleen de aangepaste plastic &#39;coverslips&#39; in de maten anders niet in de handel verkrijgbaar, maar voorkomt ook de noodzaak om glasoppervlakken-treat pre, ofwel dekglaasjes of de putten van dure glazen bodem putjes, met een PA binding oplossing, dat is een vervelende en tijdrovende stap. Tenslotte kan uniform PA gels platen worden bereid in grote series en opgeslagen de gehydrateerde enkele maanden. Kortom, de assay hier gepresenteerde is een verbetering over bestaande werkwijzen in verschillende aspecten. Ten eerste, het proces van multi-putjesplaat samenstel efficiënt, en de totale kosten van de benodigde materialen is laag. Ten tweede worden de hydrogelen in grote batches in een homogene gel film. Tenslotte uitsluitend materialen die commercieel verkrijgbaar zijn vereist. De bruikbaarheid van de test wordt geïllustreerd door onderzoeken van het effect van substraat stijfheid op celmorfologie en verspreidingsgebied.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic solution &#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37% Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA-based cell adhesion blocking kit &#8212; ECM Cell Adhesion Array Kit</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>flexible plastic support &#8212; GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Glass Plates</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals tubes</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (flat bottom)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pipettes (1&nbsp;ml, 2&nbsp;ml, 5&nbsp;ml, 10&nbsp;ml, 25&nbsp;ml, 50&nbsp;ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp;ml: 05214038, 5&nbsp;ml (FALCON): 357529, 10&nbsp;ml: 13-678-11E, 25&nbsp;ml: 13-678-11, 50&nbsp;ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Glass Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1-200&nbsp;&#956;l, 101-1000&nbsp;&#956;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Powder Free Examination Gloves</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacers &#8212; Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UV oven</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber/degasser</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump for degasser</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige-polyacrylamide gebaseerde multiwell stiffness assay voor de studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Momenteel wordt het merendeel van het in vitro celonderzoek uitgevoerd op stijf weefselkweekpolystyreen (~1 GPa), terwijl de meeste cellen in het lichaam vastzitten aan een matrix die elastisch en veel zachter is (0,1 – 100 kPa). Aangezien een dergelijke stijfheidsdiscrepantie de celreacties sterk beïnvloedt, is er een grote belangstelling voor het ontwikkelen van hydrogelmaterialen die een breed scala aan stijfheden omvatten om als celsubstraat te dienen. Polyacrylamidegels, die goedkoop zijn en het stijfheidsbereik van alle zachte weefsels in het lichaam beslaan, zijn de hydrogel van keuze voor veel onderzoeksgroepen. De bereiding van polyacrylamidegel is echter lang, vervelend en alleen geschikt voor kleine batches. Hier beschrijven we een test die, door gebruik te maken van een permanente flexibele plastic film als structurele ondersteuning voor de gels, de bereiding van polyacrylamidegels in een multiwell plate-formaat mogelijk maakt. De techniek is sneller, efficiënter en goedkoper dan de huidige methoden en maakt de bereiding van gels van aangepaste maten mogelijk die anders niet beschikbaar zijn. Aangezien er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, kan de methode gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium en zou het bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Polyacrylamide (PA) hydrogels worden wijd gebruikt om stijfheid afhankelijke cel responsen testen. 17,24 Door het mengen verschillende concentraties van acrylamide (A) en bis-acrylamide (B) kan PA gels die de stijfheidsgebied meeste zachte weefsels omvatten maken het lichaam - 0,3 -.. 300 kPa Young&#39;s modulus 1 evenwel bereiding van polyacrylamidegels is vervelend en tijdrovend, vaak beperkt hun bruikbaarheid in &quot;high-throughput&quot; toepassingen zoals bijvoorbeeld drug discovery 12</...

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamidegels in een multi-wellplaatformaat mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de gelvoorlopersolutie te sandwiches tussen een hydrofoob gecoate glasplaat en een flexibele plastic drager met een acrylamide-hechtlaag. De tweede stap is om de gel van de glasplaat af te pellen, nadat deze tijdens de polymerisatie covalent aan de flexibele plastic drager is gebonden, en deze te laten drogen.Vervolgens worden de droge gel en de onderliggende flexibele plastic drager in de gewenste vormen gesneden en met de plastic zijde naar beneden gelijmd op de bodems van de putjes van een multi-well plaat of een ander celkweekvat. De laatste stap is het coaten van de geassembleerde polyacrylamidegels in de multi-well plaat met een celadhesieve coating, zoals een monolaag van collageen type één. Uiteindelijk worden microscopie en andere celkarakteriseringstechnieken gebruikt om het effect van het onderliggende polyacrylamidesubstraat waar te nemen.In het bijzonder de invloed van de stijfheid op het celgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden is dat het de verwerking van elke stijfheid en dikte van polygelen mogelijk maakt, evenals hun assemblage in een multi-wellplaatformaat, op een kostenefficiënte en tijdsefficiënte manier die door andere methoden niet wordt geboden. De procedure zal worden gedemonstreerd door een student in mijn laboratorium.Bereid eerst de precursoroplossing voor de polyacrylamidegel door acrylamide, de crosslinker bisacrylamide en gedeïoniseerd water te mengen; los Sul OPA op in dimethylsulfoxide bij 50 mg/mL. Verdeel 20 µL van de stockoplossing over 10 microcentrifugebuisjes. Vries de oplossingen vervolgens snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.Los vervolgens ammoniumpersulfaat op in gedeïoniseerd water om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 10% gewicht per volume te bereiken. Pipetteer 25 µL van de ammoniumpersulfaatoplossing in 10 microcentrifugebuisjes en bewaar deze bij -20 °C. Bereid een collageenoplossing van 0,2 mg/mL door de collageen type I-stamsolution te verdunnen in 1x PBS bij pH 7,4.Alle oplossingen worden tot aan het gebruik op ijs bewaard. Breng op dit punt enkele druppels van een hydrofobe oplossing aan op een glasplaat en gebruik vloeipapier om dit over het oppervlak te verspreiden. Nadat de plaat aan de lucht is gedroogd, wordt deze opnieuw met vloeipapier afgeveegd om de hydrofobe coating te egaliseren.Snijd een flexibele plastic houder op maat van de hydrofoob gecoate glasplaat. Markeer vervolgens de hydrofobe zijde van de flexibele plastic houder door de oppervlakte lichtjes te bekrassen met een scherp instrument, zoals een scalpel. Voeg voor de gelbereiding 4972,5 µL polyacrylamide-precursoroplossing van de gewenste eindconcentratie toe aan een conische buis van 50 mL.Plaats de buis gedurende 30 minuten met de dop open in een ontgassingskamer. Voeg vervolgens 25 µL van de eerder bereide ammoniumpersulfaatoplossing toe aan de DGAs-geloplossing om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 0,05% te bereiken. Voeg daarna 2,5 µL TM me toe om een uiteindelijke TM ME-concentratie van 0,5% te bereiken. Meng de oplossing voorzichtig door drie tot vijf keer op en neer te pipetteren. Plaats vervolgens siliconen spacers van de gewenste dikte op de hydrofiele zijde van de flexibele plastic drager.Pipetteer vervolgens de gelloplossing op de flexibele plastic ondersteuning tussen de spacers en klem deze vast met een glazen plaatje met een hydrofobe coating. Laat de gel 45 minuten polymeriseren, verwijder dan de flexibele plastic ondersteuning met de covalent gebonden polyacrylamidegel aan de bovenzijde en leg de gel met de gelzijde naar boven om aan de lucht te drogen. Snijd de polyacrylamidegel na het drogen in de gewenste vormen.Bereid ongeveer 500 microliters polymethylsiloxaan per 96-wells plaat voor volgens de instructies van de fabrikant om de gels aan de bodem van een multi-well plaat te lijmen. Plaats met een pincet een kleine druppel polymethylsiloxaan in het midden van elke well. Plaats in elke well één polyacrylamidegel met de flexibele plastic ondersteuning naar beneden.Nadat de polydimethylsiloxaan is uitgehard, plaatst u met een transferpipet een kleine hoeveelheid van de eerder bereide cellulose-sample in elke put en draait u deze van zijde naar zijde om het geloppervlak gelijkmatig te coaten. Plaats de wellplaat gedurende vijf minuten onder een UV-lamp met hoge intensiteit. Spoel de gels na afloop met PBS om overtollige cellulose te verwijderen.Pipette vervolgens ongeveer 50 µL van de eerder bereide collageen type I-oplossing in elke well. Laat de plaat afgedekt bij kamertemperatuur gedurende ten minste twee uur staan, waarna het overschot aan collageenoplossing wordt verwijderd door te spoelen met PBS. Steriliseer de gels gedurende twee uur onder UV-licht in een celkweekkast.Week tot slot de gels gedurende de nacht in compleet medium om ze te hydrateren en te equilibreren. Gebruik de gels onmiddellijk voor het plaatsen van cellen of bewaar ze maximaal twee dagen in de koelkast; de Young-modulus als functie van verschillende acrylamide- en bisacrylamideconcentraties, respectievelijk aangeduid als A en B, wordt hier zoals verwacht weergegeven.Zowel de opslagmodulus G prime als de verliesmodulus G double prime zijn onafhankelijk van de frequentie. Ook werd bevestigd dat het drogen en vervolgens rehydrateren van de gels geen invloed had op hun Young-modulus. Door gebruik te maken van de crosslinker Sulo sampa kan een uniforme collageencoating op hydrogels van elke stijfheid worden bereikt.Er werd waargenomen dat wanneer borstkanker M-D-A-M-B 2 31-cellen gedurende 24 uur op polyacrylamidegels werden gezaaid, deze rond bleven op de zachte 0,5 en 1 kilo pascal gels, maar in staat waren uit te spreiden en te verlengen op de stijve 100 kilo pascal gel. Bovendien zijn hydrogels die op de flexibele plastic ondersteuning zijn gemaakt transparant, wat eenvoudige visualisatie en microscopie mogelijk maakt. Daarnaast vertoont de flexibele plastic ondersteuning geen autofluorescentie en verstoort deze derhalve de beeldvorming van fluorescentie-gelabelde cellen niet.De celmorfologie werd verder gekwantificeerd op basis van het totale celuitspreidingsareaal en de celcirculariteit. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u op een efficiënte en goedkope manier polyamidegels kunt assembleren in een multi-well plaatformaat voor de studie van stijfheidsafhankelijke celbiologie.

simple-polyacrylamide-based-multiwell-stiffness-assay-for-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden...

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

This video demonstrates an assay to study the effect of extracellular matrix (ECM) stiffness on bacterial infection of adherent cells. Polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, overlaid with collagen, are layered in a multi-well plate to mimic the stiffness of physiological ECM. Upon overlaying human endothelial cells on the hydrogels and infecting the cells with Listeria monocytogenes bacteria engineered to express a fluorescent protein once intracellular, flow cytometry is used to...

An Assay to Study the Impact of Extracellular Matrix Stiffness on Bacterial Infection

This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.

Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Bioluminescentie Imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT)

Leer een snelle en kostenefficiënte methode voor het bereiden van polyacrylamidegels in multiwell-platen om stijfheidsafhankelijke celresponsen te bestuderen. Deze techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Meer video's verkennen