Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen
25 maart 2015
Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.
Het algemene doel van deze procedure is om een snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multi-well plate-formaat mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de gelprecursoroplossing tussen een hydrofoob gecoate glazen plaat en een acrylamide-achtige flexibele kunststofondersteuning te plaatsen. De tweede stap is om de gel van de glazen plaat af te pellen, die covalent aan de flexibele kunststofondersteuning is bevestigd na polymerisatie en hem te laten drogen.
Vervolgens worden de droge gel en de onderliggende flexibele kunststofondersteuning in de gewenste vormen gesneden en met de kunststof kant naar beneden op de bodem van de putjes van een multi-well plate of een ander celkwekervat gelijmd. De laatste stap is het coaten van de geassembleerde polyacrylamide gels in de multi-well plate met een cel-adhesief coating, zoals een monolaag van collageen type één. Uiteindelijk worden microscopie, evenals andere celkarakteriseringstechnieken gebruikt om het effect van het onderliggende polyacrylamide substraat te observeren.
In het bijzonder de stijfheid op celgedrag. Het belangrijkste voordeel van deze methode boven bestaande methoden is dat het de behandeling van elke stijfheid en dikte van poly gels mogelijk maakt, evenals hun samenstelling in een multi-well plate-formaat, op een lage kosten en tijd efficiënte manier, die andere methoden niet bieden. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan als een student in mijn laboratorium.
Eerst bereidt u de polyacrylamide gelprecursoroplossing voor door acrylamide, de crosslinker bisacrylamide en gedeïoniseerd water op te lossen. Sul OPA in dimethylsulfox op 50 milligram per milliliter. Verdeel 20 microliter van de stockoplossing in 10 microcentrifugebuisjes. Bewaar vervolgens de oplossingen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.
Los vervolgens ammoniumpersulfaat op in gedeïoniseerd water om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 10%gewicht per volume te bereiken. Eloqua 25 microliter van de ammoniumpersulfaatoplossing in 10 microcentrifugebuisjes en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Bereid een collageenoplossing van 0,2 milligram per milliliter voor door de collageen type één stockoplossing te verdunnen in één XPBS bij pH 7,4.
Alle oplossingen worden tot gebruik gekoeld gehouden. Plaats op dit punt een paar druppels van een hydrofobe oplossing op een glazen plaat en gebruik tissuepapier om deze over het oppervlak te verspreiden. Laat de plaat vervolgens aan de lucht drogen en veeg het weer af met tissuepapier om de hydrofobe coating gelijkmatig te verdelen.
Snijd een flexibele kunststofondersteuning om de maat van de hydrofoob gecoate glazen plaat te matchen. Markeer vervolgens de hydrofobe kant van de flexibele kunststofondersteuning door het oppervlak lichtjes te krassen met een scherp gereedschap zoals een scalpel. Voeg voor de gelvoorbereiding 4972,5 microliter polyacrylamide precursoroplossing van de gewenste uiteindelijke concentratie toe aan een 50 milliliter conische buis.
Plaats de buis 30 minuten in een ontgassingskamer met de dop geopend. Voeg vervolgens 25 microliter van de eerder bereide ammoniumpersulfaatoplossing toe aan de DGAs geloplossing om een uiteindelijke ammoniumpersulfaatconcentratie van 0,05% te bereiken. Voeg vervolgens 2,5 microliter TM me toe om een uiteindelijke TM ME-concentratie van 0,5% te bereiken. Meng de oplossing voorzichtig door er drie tot vijf keer met een pipettering omhoog en omlaag te mixen. Plaats vervolgens siliconenafstandhouders van de gewenste dikte op de hydrofiele kant van de flexibele kunststofondersteuning.
Pipetteer vervolgens de geloplossing op de flexibele kunststofondersteuning tussen de afstandhouders en leg een hydrofoob gecoate glazen glijdende lichte schuif op. Laat de gel 45 minuten polymeriseren, pel de flexibele kunststofondersteuning af met de covalent aan de polyacrylamide gel bevestigde gel erboven en zet de gel met de gelzijde omhoog om te drogen. Eenmaal gedroogd, snijd de polyacrylamide gel in de gewenste vormen.
Bereid ongeveer 500 microliter polymethyl soane per 96-well plaat volgens de instructies van de fabrikant om de gels op de bodem van een multi-well plaat te lijmen. Plaats een kleine druppel polymethyl soane in het midden van elke put met behulp van een pincet. Plaats één polyacrylamide gel in elke put met de flexibele kunststofondersteuning naar beneden.
Na het uitharden van de poly dimethyl suboxane, plaatst u een kleine hoeveelheid van de eerder bereide cellulose sampa in elk putje met een transferpipet en draait u van links naar rechts om het geloppervlak gelijkmatig te coaten. Plaats de puttenplaat gedurende vijf minuten onder een hoogintensiteit UV-lamp. Wanneer u klaar bent, spoelt u de gels met PBS om overtollig cello te verwijderen.
Pipetteer vervolgens ongeveer 50 microliter van de eerder bereide collageen Type één oplossing in elke put. Laat de plaat gedurende ten minste twee uur op kamertemperatuur bedekt staan na het spoelen met PBS om overtollig collageen oplossing te verwijderen. Steriliseer de gels onder UV-licht in een weefselkweekkap gedurende twee uur.
Week de gels ten slotte een nacht in compleet medium om te hydrateren en te egaliseren. Gebruik de gels voor celbezetting onmiddellijk of bewaar ze in de koelkast gedurende maximaal twee dagen. Young's modulus als functie van verschillende acrylamide en bis. Acrylamideconcentraties aangeduid als A en B respectievelijk wordt hier verwacht weergegeven.
Zowel de opslagmodulus G prime als de verliesmodulus G dubbel prime zijn onafhankelijk van de frequentie. Het werd ook bevestigd dat het drogen en vervolgens opnieuw hydrateren van de gels hun Young's modulus niet beïnvloedde. Door het gebruik van de Crosslinker Sulo sampa kan een uniforme collageencoating op hydrogels van elke stijfheid worden bereikt.
Het werd waargenomen dat wanneer gezaaid op polyacrylamide gels gedurende 24 uur, borstkanker M-D-A-M-B 2 31 cellen rond bleven op de zachte 0,5 en één kilo pascal gels, maar zich konden verspreiden en verlengen op de stijve 100 kilo pascal gel. Bovendien zijn hydrogels gemaakt op de flexibele kunststofonder
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor de snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate-formaat. De techniek is toegankelijk voor elk onderzoekslaboratorium en is bijzonder nuttig voor studies over stijfheidsafhankelijke celresponsen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Biomaterialen
Achtergrond
- Polyacrylamide gels worden veel gebruikt in celcultuur en biomechanica.
- Het begrijpen van celresponsen op substraatstijfheid is cruciaal voor verschillende biologische toepassingen.
- De traditionele methoden voor gelbereiding kunnen tijdrovend zijn en vereisen gespecialiseerde apparatuur.
- Deze nieuwe methode vereenvoudigt het proces, waardoor het toegankelijker wordt voor onderzoekers.
Doel van het Onderzoek
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het bereiden van polyacrylamide gels.
- Om onderzoek naar hoe cellen reageren op verschillende stijfheidsniveaus te faciliteren.
- Om de noodzaak voor gespecialiseerde apparatuur bij gelbereiding te elimineren.
Gebruikte Methoden
- Het sandwichen van de gel precursor oplossing tussen een hydrofobe glazen plaat en een flexibele plastic ondersteuning.
- Het afpellen van de gel van de glazen plaat na polymerisatie.
- Het snijden van de droge gel in gewenste vormen en het lijmen op multiwell platen.
- Het coaten van de gels met een celhechtende laag, zoals collageen type een.
Belangrijkste Resultaten
- De methode maakt snelle bereiding van gels mogelijk die geschikt zijn voor celcultuur.
- Gels kunnen eenvoudig worden aangepast in vorm en grootte voor verschillende experimenten.
- Celhechting en gedrag kunnen effectief worden bestudeerd op deze substraten.
- De aanpak is kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde tools.
Conclusies
- Deze methode verbetert de toegankelijkheid voor onderzoekers die celmechanica bestuderen.
- Het biedt een betrouwbaar platform voor het onderzoeken van stijfheidsafhankelijke cellulaire responsen.
- De techniek kan gemakkelijk worden toegepast in verschillende laboratoriuminstellingen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Stiffness-dependent cell responses are critical in target validation and phenotypic screening, yet traditional hydrogel preparation limits throughput and reproducibility in early discovery. This multiwell plate-compatible polyacrylamide gel assay enables rapid, cost-effective preparation of tunable substrates, supporting scalable assessment of mechanobiology in disease-relevant systems. By eliminating equipment barriers and enabling custom gel formats, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating substrate stiffness to clarify pathway dependencies in cell-based assays.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible preparation of polyacrylamide gels across stiffness ranges mimicking physiological tissues.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking extracellular matrix mechanics to cellular phenotypes, improving target confidence in mechanosensitive pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated, stiffness-tunable biological systems ready for downstream compound screening and target engagement studies.
- Operational Value: Ensures assay standardization and quantitative outputs via consistent gel thickness, crosslinking, and collagen coating across multiwell formats.
- Scalability: Enables platform reuse and high-throughput evaluation of compound effects on stiffness-dependent cell responses without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant modeling by recapitulating tissue stiffness ranges (0.1–100 kPa) observed in fibrotic, tumorigenic, or neurodegenerative microenvironments.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through quantification of cell spreading area and circularity as functional readouts of mechanotransduction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by revealing how substrate mechanics modulate drug sensitivity in 3D-like culture conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling mechanobiology-informed assay design at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating stiffness as an independent variable in cell response modeling.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible gel fabrication, ensuring consistent mechanical cues for compound library evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., cell area, circularity) that enable statistical comparison of conditions across stiffness gradients.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by maintaining physiological relevance in substrate mechanics.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, scalable capability for mechanobiology studies across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through multiwell plate compatibility and room-temperature gel handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering barriers to mechanobiology research and reducing reliance on outsourced hydrogel fabrication.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on stiffness-dependent phenotypic anchors in early-stage models.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture and gel casting expertise, including handling of acrylamide and bis-acrylamide solutions.
- Needs standard laboratory equipment: centrifuge tubes, degassing chamber, UV lamp, and tissue culture hood for sterilization.
- Demands cross-team standardization of gel thickness, crosslinking ratios, and collagen coating protocols for inter-experiment comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to 3D models or primary cell systems with distinct adhesion requirements.
- Includes practical limitations such as gel handling post-delamination and potential variability in hydrophobic coating uniformity affecting gel adhesion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Hydrogel-associated Solutions and Aliquots
2:41
Hydrogel Preparation
4:29
Multiwell Plate Assembly, Collagen Coating, and Sterilization
6:00
Results: Polyacrylamide Gel Preparation in Multiwell Plates for Stiffness-dependent Cell Response Studies
7:19
Conclusion
