Name: Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer hoe je tumor-infiltrerende leukocyten analyseert in een subcutaan muismodel met B16-melanoomcellen. Deze flowcytometrie-methode onthult immuunceldynamiek voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies R01-CA169354 &#160; en R01-047822 &#160; van de National Institutes of Health en een Merit Award van het Department of Veterans Affairs (ECB). RKP werd ondersteund door NIH T32 CA009287-30A1, een ASCO Young Investigator Award, Californië Breast Cancer Research Project Fellowship en een American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ werd ondersteund door NIH-subsidie ​​AI079320. JM werd ondersteund door beurzen van NIH T-32 training subsidie ​​T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 en American Cancer Society post-doctorale beurs PF-12-052-01-CSM.

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde Stanford, Palo Alto VA HCS, en de National Institutes of Health Institutionele AnimalCare en gebruik Comite richtlijnen. 1. Voorbereiding voor bemonstering en Processing (Benodigde tijd: ~ 10-15 min) <ol><li> Inoculeer muizen B16F0-melanoomcellen (0,5-1 x 10 6) subcutaan of nabij de middellijn van het abdomen bij vrouwelijke C57BL / 6 muizen zoals eerder 6 beschreven. Als alternatief te enten tumorcellen tegen extra anatomische plaatsen (bijv flank, uiervet pad, etc). OPMERKING: aantal tumoren (geïmplanteerd of spontane) worden gebruikt en geëvalueerd met behulp van dit protocol. Bijvoorbeeld, andere veelgebruikte syngene tumoren in C57BL / 6 worden de colon lijn MC38, Lewis Lung Carcinoma (LLC) en de prostaat TRAMP-C2 lijn. Terwijl menselijke xenotransplantaten geïnoculeerd in immunodeficiënte muizen ook op die wijze kan worden geëvalueerd moet worden opgemerkt dat de profiles van de tumor-infiltrerende leukocyten noodzakelijkerwijs volgens de immunodeficiënte toestand van de ontvangende muis worden gewijzigd. <ol><li> Gebruik compleet medium (bijvoorbeeld RPMI met 10% FBS en additieven) of een andere geschikte eiwithoudende buffer (bijvoorbeeld HBSS of PBS + 1% FBS en 1% BCS). Chill media of buffer tot 4 ° C voordat euthanization. </li></ol></li><li> Set up collectie buizen en filters voor resected tumoren; plaats deze op ijs. <ol><li> Gebruik een 50 ml conische buis per tumor te worden gereseceerd. Plaats een 40-70 micrometer celsuspensie filter in elk. U kunt ook gebruik maken van 15 ml conische buizen met metalen filter gaas. Gebruik 5 ml zuiger of dik pen een komvormig filter maken bovenaan de 15 ml buis. </li></ol></li><li> Bereid instrumenten voor resectie en tumor verwerking; Gebruik chirurgische tang en fijne schaar om reseceren en proces tumoren. Gebruik 70% ethanol aan instrumenten tussen resections / tumor samples te reinigen. Voor grotere aantal of monsters (bv&gt; 10), adviseren wij gelijktijdige verwerking van de monsters door meerdere onderzoekers tot aanzienlijke verschillen in doorlooptijd tussen tumor monsters te voorkomen. </li></ol> 2. tumorresectie (Benodigde tijd: ~ 5 min / tumor) <ol><li> Euthanaseren B16-muizen met een tumor individueel met behulp van kooldioxide of andere goedgekeurde methode. </li><li> Zet de muis op een chirurgische podium. Spray de tumor met 70% ethanol en veeg overtollige af; Dit helpt voorkomen dat de verspreiding van enige haren aanwezig. Voor niet-naakt muizen, scheren de huid rondom de tumor voorafgaand aan de resectie als dat nodig is. </li><li> Met behulp van een tang en schaar, reseceren de onderhuidse tumor en bloc, inclusief bovenliggende en de omliggende huid. De hoeveelheid van &quot;marge&quot; skin taken kan worden gevarieerd, maar gewoonlijk resectie 2-3 mm van de huid rondom de tumor. <ol><li> Weeg uitgesneden tumoren (+/- omliggende huid) op dit punt. Plaats de gereseceerd huid / tumor sectie in het filter verzekerd binnen het plastic conische buis. </li></ol></li></ol> 3. Het voorbereiden van een Single Cell Tumor Suspension (Benodigde tijd: ~ 5-7 min / tumor) <ol><li> Gebruik een tang en schaar om de tumor en overliggende / omliggende huid blad voor de mond. Hak het monster met behulp van een schaar tot alle grote delen van het weefsel worden verwerkt tot 1-2 mm secties. OPMERKING: Typisch, worden geheel tumoren verwerkt; Als alternatief voor de grotere tumoren, representatieve delen van tumoren kan worden gehakt en verwerkt. </li><li> Met behulp van een zuiger van een wegwerp 5 of 10 ml spuit, mechanisch disaggregeren het gehakt tumorweefsel tegen de beveiligde filter. </li><li> Met behulp van een pipet, was de verwerkte tumorweefsel met 5-10 ml koud media of buffer. Dit zal de enkele cellen spoelen door het filter. </li><li> Herhaal de bovenstaande twee stappen meerdere keren, zodat het totale aantal en hoeveelheden waswater ongeveer hetzelfde voor vergelijkbare grootte tumoren. <ol><li> Na het wassen van de verwerkte tumorweefsel, observerenkleine fragmenten van huid en / of ander bindweefsel dient achter in het filter worden gelaten. </li><li> Als alternatief voor tumoren waarbij mechanische disaggregatie alleen niet voldoende zijn, digestie met collagenase en / of andere enzymen kunnen worden uitgevoerd voorafgaand aan het hakken procedure. Dit zal zorgen voor een meer diepgaande enkele celsuspensie. Er moet echter worden opgemerkt dat dergelijke spijsvertering protocollen kunnen beïnvloeden oppervlakte-antigeen-expressie 20, zodat voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van deze resultaten. </li></ol></li><li> Was pellet en de cellen door toevoeging media / buffer en centrifugeren bij 4 ° C 500 xg gedurende 5 minuten. </li></ol> 4. FACS kleuring van enkele celsuspensie (Benodigde tijd: ~ 30-60 min) <ol><li> Resuspendeer cellen in ijskoude FACS buffer (PBS + 1% FBS). </li><li> Count levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw en een hemacytometer, of geautomatiseerde celgetalmeter. </li><li> Bepaal de totale levensvatbare cel opbrengst per volume. Deze gegevens kunnen gebruikt worden geëxtrapoleerdabsolute aantallen tumor infiltrerende leukocyten in combinatie met FACS data. </li><li> Bepaal het aantal cellen worden gekleurd en geanalyseerd door FACS. Dit wordt beïnvloed door verschillende factoren (bv tumor histologie type tumor leeftijd en grootte, gemiddelde percentage van infiltrerende leukocyten, enz.). Opmerking: In B16 melanoma, vonden we een laag percentage van tumor-infiltrerende leukocyten (TIL; meestal &lt;5%) in vergelijking met tumorcellen. Zo werden ten minste 1 x 10 6 totaal tumor (tumor + infiltreren leukocyten) cellen meestal verzameld via FACS voor analyse. <ol><li> De trypan gekleurde counting data, berekende hoeveelheid cellen worden gekleurd voor FACS. Als bijvoorbeeld TIL vormen typisch 5% van de totale tumorcellen (veel van de tumorcellen doden van trypan vlek is), dit element in het totale aantal tumorcellen enkele celsuspensie te worden gekleurd. </li><li> Voor minder vaak leukocyt subgroepen bijv CCR9 + PDC) gebruikt een groter totaal aantal tumorcellen (bijvoorbeeld 3/2 x 10 6) voor FACS kleuring, gezien de relatief lage frequentie van deze cellen in de enkele celsuspensie. </li></ol></li><li> Vlekken op de tumor enkele celsuspensie voor FACS. <ol><li> Voor levende / dode discriminatie gebruik een fixeerbaar beits of niet fixeerbaar vlek (bijvoorbeeld propidiumjodide) worden gebruikt. Wanneer cellen worden gekleurd zonder levende / dode discriminatie moet voorzichtigheid geboden worden gezien de mogelijkheid tot niet-specifieke binding van antilichamen. </li><li> Vlekken op de celsuspensie voor specifieke leukocyten subsets met behulp van een standaard FACS kleuringsprotocol. Block cellen om niet-specifieke antilichaambinding met PBS / FBS bevattende 1% rattenserum en Fc block (anti-CD16 / 32) gedurende 10 min voor kleuren met antigeenspecifieke antilichamen verminderen. Neem de juiste isotype controle antilichamen te zorgen kleuring specifiek is. </li><li> Op dit punt, na de FACS kleuring is voltooid, stelt de monsters met 4% formaldehyde of soortgelijke fixeermiddel. WINKEL monsters bij 4 ° C in de dark (als om het doven van fluoroforen vermijden) op het moment van het verzamelen en analyseren. Opmerking opslaan gefixeerde monsters gedurende langere tijd kan leiden tot verandering van het signaal en de intensiteit van de fluoroforen 21. </li><li> Het verzamelen van de monsters op een flowcytometer. Optimale doorstroomcytometer instellingen is afhankelijk van het type instrument en de setup laser / detector. OPMERKING: Daarnaast kan er variabiliteit tussen experimenten, zelfs bij gebruik van dezelfde machine. Zo verrichten passende machine setup (bijvoorbeeld met behulp van kalibratie kralen) op een passende vergoeding instelling voorafgaand aan FACS verzamelen en analyseren van elk experiment te verzekeren. </li></ol></li><li> Analyse van leukoctye subsets <ol><li> Met FACS data-analyse software, om de gegevens te analyseren. Voor een live / dead vlek, te beginnen door gating uit dode cellen. Gebruik antilichaam tegen een leukocyten specifieke marker (bijvoorbeeld anti-CD45) om leukocyten te identificeren binnen de levende cellen. <ol><li> Na deze, gebruik maken van diverse gating regelingen aan specifieke subsets identificeren, afhankelijk van de kleuring protocol. Bijvoorbeeld om CD4 + T-cellen te identificeren, selecteer de regio SSC lo van de CD45 + populatie en selecteer de CD19-CD3 + cellen; van deze CD4 + T-cellen kunnen worden geïdentificeerd 22. </li></ol></li><li> Analyseren van gegevens en presenteren die op een aantal verschillende manieren om te zorgen voor samenhang en identificeren van patronen of trends (dwz gebruik maken van de totale aantallen, percentages, of ratio&#39;s om subsets te kwantificeren). OPMERKING: Zo hebben we gekeken naar het totale levend CD45 + cellen als een percentage van de totale tumorcellen verzameld (figuur 1). Daarnaast vervolgens berekend we het percentage van elke leukocyt deelverzameling (bijv CD4 + T-cellen) in de tumor en vergeleken als verhoudingen tussen de controle- en testgroepen (figuur 3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mantovani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+the+recruitment+and+shaping+of+the+leukocyte+infiltrate+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors.</a> Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).</li>
<li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+despite+immunosurveillance%3A+immunoselection+and+immunosubversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li>
<li>Pachynski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemoattractant+chemerin+suppresses+melanoma+by+recruiting+natural+killer+cell+antitumor+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses.</a> J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+nude+mice+ubiquitously+expressing+fluorescent+proteins+for+color-coded+imaging+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).</li>
<li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+cancer+immunology%3Aphenotyping+immune+cell+subsets+in+situ+in+FFPE+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections.</a> MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).</li>
<li>Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+angiogenesis%2C+inflammation%2C+and+metastasis+in+the+tumor+microenvironment+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging.</a> Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).</li>
<li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+confocal+microscopy+imaging+of+solid+tumor+destruction+following+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer.</a> Oncoimmunology. 2 (11), e26677(2013).</li>
<li>Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((imaging+of+the+immune+system%3A+immune+monitoring+at+the+whole+body+level%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level.</a> Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).</li>
<li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+immunofluorescence+for+visualizing+the+microcirculatory+and+immune+microenvironments+in+the+mouse+ear+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis.</a> PLoS One. 8 (2), e57135(2013).</li>
<li>Habibollahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+imaging+allows+noninvasive+evaluation+of+immune+cell+modulation+in+esophageal+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia.</a> Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).</li>
<li>Balducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+probe+for+the+non-invasive+detection+of+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation.</a> Oncoimmunology. 2 (2), e23034(2013).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent%2C+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li>
<li>Hadeiba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR9+expression+defines+tolerogenic+plasmacytoid+dendritic+cells+able+to+suppress+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease.</a> Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).</li>
<li>McLean, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BALB%2Fc+murine+lung+alveolar+carcinoma+used+to+establish+a+surgical+spontaneous+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model.</a> Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).</li>
<li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+immune+cells+from+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of immune cells from primary tumors.</a> J Vis Exp. (64), e3952(2012).</li>
<li>Shafer-Weaver, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+Tumor-specific+CD8%2B+T+cells+infiltrating+prostatic+tumors+are+induced+to+become+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells.</a> J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).</li>
<li>Hackstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+and+lymphocyte+populations+in+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains.</a> Respir Res. 13, 94(2012).</li>
<li>Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells%3A+more+mechanisms+for+inhibiting+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+and+CTLA-4+combination+blockade+expands+infiltrating+T+cells+and+reduces+regulatory+T+and+myeloid+cells+within+B16+melanoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).</li>
<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het uitvoeren gedetailleerde analyse van de tumor micro kritisch bepalen van de mechanismen en gevolgen van immunomodulatie. Met de toenemende aanwezigheid van immunotherapeutische in de menselijke klinische rijk begrijpen van de invloed van deze middelen op de tumor infiltrerende leukocyten steeds vereiste vaststelling van hun werkingsmechanisme. Bij mensen bestaan ​​vaak klinische en / of logistieke problemen bij het verkrijgen en analyseren van tumorweefsel voor leukocyt deelanalyse en daarmee analyse van de perifere...

Het evenwicht tussen groei en bevordering tumor regressie is gedeeltelijk afhankelijk van de balans tussen pro- en anti-tumor-infiltrerende leukocyten aanwezig in de micro 1,2. Om de tumor micro studie (TME) en specifiek de infiltrerende leukocyten subpopulaties, ontwikkelden we een methode voor de evaluatie van subcutane tumoren in een murine tumormodel. Het belang van het bestuderen van de tumor micro-omgeving is bekend en ondersteund in de literatuur. Talrijke studies hebben aangetoond dat de balans van pro- en anti-tumor infiltrerende immuuncellen kan invloed hebben op de resultaten van tumorgroei, niet alleen in muizen maar ook menselijke studies (besproken in 3,4). Bijvoorbeeld Curiel et al. Toonde aan dat verslechterd klinische resultaten bij eierstokkankerpatiënten werden gecorreleerd met de aanwezigheid van toenemende percentages van tumor-infiltrerende regulerende CD4 + T-cellen (Tregs) 5. Onze eigen werk toonde ook het effect van een nietvel leukocyt chemoattractant van de verhouding van leukocyt populaties in een muizen melanoma model 6, die ook gecorreleerd met verminderde tumorgroei. Zo wordt de gedetailleerde analyses van de leukocyten subsets binnen een tumor nu breder erkend en steeds belangrijker. Er zijn vele manieren om de tumor micro-omgeving voor het infiltreren van leukocyten te evalueren; bijvoorbeeld groepen hebben transgene muizen ontworpen om verschillende fluorescerende eiwitten om het imago van de TME 7, klassieke immunohistochemie en immunofluorescentie van conserven secties 8, met inbegrip van verschillende beeldvormende modaliteiten zoals MRI, PET, confocale microscopie 9-11 uitdrukken - sommige met de mogelijkheid om monitoren intravitally 10,12. Deze kunnen worden gebruikt met verschillende moleculaire beeldvormende middelen, zoals nanodeeltjes 13 of nieuwe contrastmiddelen 14 dat immuuncellen label. Onze werkwijze is een flowcytometrie-aanpak en heeft verschillende voordelen.Ten eerste kan de gehele tumor micro-omgeving worden bemonsterd; bij de analyse, wordt de gehele subcutane tumor en omliggende rand chirurgisch weggesneden voor verwerking. Dit elimineert potentieel bemonsteren voorspanning in één tumor en geeft een &quot;globale&quot; analyse van de tumor als geheel. Ten tweede gebruikt multicolor flowcytometrie de leukocyt subgroepen te analyseren kunnen we meer specifiek meten het fenotype van infiltrerende leukocyten. Afhankelijk van het aantal gebruikte kleuren kunnen zeer specifieke subsets worden geïdentificeerd. Dit is belangrijk omdat er verschillende leukocyt subgroepen binnen een bepaald celtype - of zelfs een subtype algemene classificatie - dat uiteenlopende functies kunnen aanzienlijk het bepalen van het lot van de tumor. Zo hebben plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) betrokken bij anti-tumor immuniteit 15. Echter, de CCR9 + subset van pDCs is aangetoond dat tolerogene 16 en verschuiven van de balans van zo&#39;n sub invloed kunnen zijn op tumorgroei. Onze werkwijze is geschikt voor subcutane of andere tumoren die kunnen worden weggesneden en bloc. In onze handen werden tumoren gelijkmatig gereseceerd bij de euthanasie. Het is echter denkbaar, zoals is gedaan in een aantal studies, dat een subcutane tumor volledig kon worden uitgesneden met sluiting van de omringende huid in een overleving operatie 17, waardoor extra evaluatie van het dier. De analyse wordt dan uitgevoerd op het gereseceerde tumor. Dus de resultaten vormen een tijdstip in de ontwikkeling van de tumor. Hoewel dit kan een gedetailleerd blik in de micro-omgeving, maar ook een statisch beeld van wat ongetwijfeld een dynamisch proces. Echter, geïsoleerde leukocyten (bijvoorbeeld via magnetische afscheiding of dichtheidsgradiëntcentrifugatie) kan vervolgens afzonderlijk worden geanalyseerd vanuit de tumor epitheel en stroma, of gebruikt worden in andere, functionele assays om hun fenotype verder te definiëren, zoals Previ geweestDUREND beschreven 18. Deze methode zou dan nuttig voor onderzoekers geïnteresseerd in het begrijpen van de samenstelling van de leukocyten in de tumor micro-omgeving op een bepaald tijdstip, ongeacht of in de omgeving van het natuurlijke ziekteverloop of na een bepaalde therapeutische verstoring. Hoewel niet door ons, variaties van deze procedure kan ook eventueel worden gebruikt om specifieke delen van een tumor afzonderlijk analyseren. Gegeven bijvoorbeeld de grootte van de tumor, de randzone (s) worden van de centrale, mogelijk necrotische kern van de tumor ontleed de onderzoeker een ruimtelijk gescheiden gezien de tumor micro geven. In de snel groeiende gebied van de tumor immunologie, zal er ongetwijfeld een exponentieel groeiend aantal studies evalueren van immunomodulerende verbindingen in muizen tumor modellen. Verschillende rapporten hebben de verschillen in specifieke leukocytfunctie gemarkeerd in de tumor ten opzichte van de perifere enving. Bijvoorbeeld Shafer-Weaver et al. Toonden in een muismodel dat antigeen-specifieke effector T CD8 + cellen, terwijl actief in de periferie, werden getransformeerd in CD8 + T-suppressor-cellen eenmaal verhandeld in de tumor micro-omgeving 19. Dit was gedeeltelijk te wijten aan TGFO, maar ook andere factoren zijn waarschijnlijk betrokken ook. Aldus evalueren leukocyt subgroepen - getallen en verhoudingen, alsmede functionele status - binnen de tumor zelf een nauwkeurigere voorstelling van het effect van een bepaalde immunomodulatie op tumor lot geven. De techniek maakt gedetailleerde analyse van de tumor en geeft de onderzoeker de mogelijkheid om veranderingen in leukocyt populaties dan eerdere benaderingen beter identificeren.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>http://cellgro.com</td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>40 &#956;m filter</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>5 ml spuit</td><td>BD</td><td>14-823-35</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>chirurgische schaar/tang</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>roboz.com</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-030-CM</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>trypanblauw</td><td>Cellgro</td><td>MT-25-900-CI</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Hausser Scientifice&nbsp;</td><td>02-671-54&nbsp;</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Live/Dead-kleuring</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td>lieftechnologies.com</td></tr><tr><td>FlowJo-software</td><td>TreeStar, Inc</td><td></td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Gespecialiseerde immuuncellen die de tumor micro infiltreren reguleren de groei en overleving van neoplasie. Kwaadaardige cellen moet ontwijken of te ondermijnen anti-tumor immuunrespons om te overleven en te bloeien. Tumoren maken van een aantal verschillende mechanismen van het immuunsysteem &quot;escape&quot;, waaronder de werving van tolerogene DC, immunosuppressieve regulerende T-cellen (Tregs) en myeloide suppressor cellen (MDSC) dat cytotoxische anti-tumor responsen te remmen. Immunostimulerende dendritische cellen, natuurlijke killer cellen die aangeboren anti-tumor immuniteit haven en cytotoxische T-cellen allemaal kunnen deelnemen aan tumorsuppressie: Omgekeerd kunnen anti-tumor effector immuuncellen de groei en uitbreiding van maligniteiten vertragen. De balans tussen pro- en anti-tumor leukocyten bepaalt uiteindelijk het gedrag en het lot van de getransformeerde cellen; een veelheid van menselijke klinische studies hebben aangetoond dit uit. Zo, gedetailleerde analyse van leukocyten subsets binnende tumor micro-omgeving is steeds belangrijker geworden. Hier beschrijven we een werkwijze voor het analyseren infiltrerende leukocyten subsets aanwezig in de tumor micro-omgeving in een muizen tumormodel. Muis B16 melanoma tumorcellen werden subcutaan geïnoculeerd in C57BL / 6 muizen. Op een bepaald tijdstip, werden tumoren en de omliggende huid weggesneden en bloc en in enkele cel suspensies, die vervolgens werden gekleurd voor multi-color flowcytometrie verwerkt. Hand van diverse leukocyten deelverzameling markers, konden we de relatieve percentages van infiltrerende leukocyten subsets tussen controle en chemerin expressie tumoren vergelijken. Onderzoekers kunnen dergelijke gebruiken om de immune aanwezigheid in de tumor micro-omgeving en in combinatie met traditionele schuifmaat maat metingen van tumorgroei, zal mogelijk kunnen zij het effect van veranderingen in immune samenstelling op tumorgroei helderen bestuderen. Een dergelijke techniek kan worden toegepast op elk tumormodel waarin de tumor en de micro Ceen worden gereseceerd en verwerkt.

Onze resultaten toonden dat geforceerde overexpressie van chemerin in muriene B16 tumoren vergroot het percentage van tumor-infiltrerende leukocyten (TIL). Bovendien, veranderingen in de relatieve verhouding van leukocyten subsets vertegenwoordigd in de tumor micro verbonden chemerin expressie geïdentificeerd. Re-print met toestemming van Pachynski et al. 6. Figuur 1 toont dat er een aanzienlijke toename van de totale CD45 + cellen (TIL&#39;s) binnen in de ...

Dit protocol beschrijft een methode voor de gedetailleerde evaluatie van leukocytensubsets binnen de tumormicro-omgeving in een muistumormodel. Chemerin-uitdrukkende B16 melanoomcellen werden subcutaan geïmplanteerd in syngene muizen. Cellen uit de tumormicro-omgeving werden vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat gedetailleerde leukocytensubsetanalyses mogelijk maakt.

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van de infiltrerende leukocyten in een subcutaan tumormodel bij muizen. Dit wordt bereikt door eerst murine B 16 F zero melanomcellen van vrouwelijke C 57 BL six muizen te inoculeren om de groeiende tumor in vivo te vestigen. Vervolgens worden de B 16 tumor-dragende muizen geëuthanaseerd en wordt de subcutane tumor in blok geresecteerd, inclusief de overliggende en omringende huid.Vervolgens wordt een enkelcel-suspensie van zowel tumorcellen als tumorinfiltrerende leukocyten geïsoleerd, die daarna via flowcytometrie kan worden geanalyseerd. Ten slotte wordt de opbrengst aan levensvatbare cellen per volume bepaald en wordt het aantal cellen dat moet worden gekleurd en geanalyseerd berekend. Uiteindelijk wordt flowcytometrie gebruikt om de frequentie en het type leukocytsubsets binnen de tumormicro-omgeving aan te tonen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van kanker, omdat men de effecten van een therapie op de leukocyten binnen de tumormicro-omgeving kan evalueren. Het is dit evenwicht tussen effector- en suppressorcellen dat mede bepaalt of de tumor groeit of teruggaat. Om tumorgroei te induceren, worden murine B 16 F zero melanomacellen in een fysiologische buffer, zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing, subcutaan geïnoculeerd in of nabij de middellijn van de buik bij vrouwelijke C 57 BL six muizen volgens het tekstprotocol. Zeven tot 14 dagen later, vlak voor het resecteren van de tumoren, wordt er per tumor één conische buis van 50 milliliter klaargezet en op ijs geplaatst.Plaats een cel-suspensiefilter van 40 tot 70 micron in elke buis. Bereid chirurgische pincetten en een schaar voor om de resectie uit te voeren, en 70% ethanol om de instrumenten tussen de tumorstalen door te reinigen. Nadat een B 16 tumordragende muis is geëuthanaseerd, dient de muis volgens het tekstprotocol op een chirurgische tafel te worden vastgezet; gebruik 70% ethanol om het tumorgebied te besproeien en veeg de toegang schoon om te voorkomen dat haren zich verspreiden. Zorg ervoor dat de lokale ethanol volledig is afgeveegd en is verdampt voordat de tumor met pincetten en een schaar wordt geresecteerd; resecteer de subcutane tumor in één blok, inclusief de overliggende huid en ongeveer twee tot drie millimeter van de omringende huid.Weeg de geresecteerde tumoren met en zonder de omringende huid en plaats elk deel in een filter in de conische buis. Om een tumor-cel-suspensie te bereiden, gebruikt u een pincet en een schaar om de tumor en de overliggende en omringende huid fijn te hakken totdat alle grote stukken weefsel zijn verwerkt tot secties van één tot twee millimeter. Gebruik vervolgens de zuiger van een wegwerpspuit van vijf of 10 milliliter om het fijngehakte tumorweefsel mechanisch te dissociëren tegen het vastgezetten filter.Was vervolgens het bewerkte tumorweefsel met een pipet en 5 tot 10 milliliters koud medium of buffer. Hierdoor worden de enkelvoudige cellen door het filter gespoeld.Herhaal de aggregatie- en wasstappen meerdere keren, waarbij u ervoor zorgt dat het totale aantal en de volumes van de wasbeurten ongeveer gelijk zijn voor tumoren van vergelijkbare grootte. Controleer na het wassen van het weefsel of kleine fragmenten huid en/of ander bindweefsel in het filter zijn achtergebleven. Voeg medium toe om de cellen te wassen en te pelletteren en centrifugeer bij 500 Gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik ijskoud FACS-buffer om de cellen te resuspenderen voor de FACS-analyse.Vervolgens worden met trypanblauw en een hemocytometer de levensvatbare cellen bepaald om het totaal aantal levensvatbare cellen per volume vast te stellen, wat wordt gebruikt om de absolute aantallen tumorinfiltrerende leukocyten te extrapoleren of om in combinatie met FACS te gebruiken. Op basis van de telgegevens van de trypanblauwkleuring wordt het volume aan cellen berekend dat voor FACS gekleurd moet worden. Als TIL's bijvoorbeeld gewoonlijk 5% van de totale tumorcellen vormen, moet dit worden meegerekend in het totaal aantal tumorcellen in suspensie dat gekleurd zal worden.Om de cellen te kleuren voor het onderscheid tussen levende en dode cellen, wordt een fixeerbare of niet-fixeerbare kleurstof gebruikt, zoals propidiumjodide. Gebruik vervolgens FBS in PBS met 1% ratenserum en FC-blok om de cellen gedurende 10 minuten te blokkeren, alvorens een standaard flowcytometrie-kleuringsprotocol toe te passen om de celsuspensie te kleuren voor specifieke leukocytsubsets.Gebruik na het kleuren 4% paraformaldehyd om de monsters te fixeren en bewaar deze bij vier graden Celsius in het donker tot het tijdstip van collectie en analyse. Gebruik een flowcytometer om de monsters te collecteren. Begin bij de data-analysesoftware met het uitsluiten (gating) van dode cellen; identificeer vervolgens de leukocyten binnen de levende cellen met een antilichaam tegen een leukocyt-specifieke marker, zoals anti-CD 45.Gebruik vervolgens verschillende gating-schema's om specifieke subsets te identificeren volgens het tekstprotocol. Analyseer de gegevens en presenteer deze op verschillende manieren om consistentie te waarborgen en patronen of trends te identificeren, zoals hier getoond. Geforceerde overexpressie van kein in murine B 16 tumoren, geresecteerd op dag 17, resulteerde in een significante toename van het totaal aantal CD 45-positieve cellen vergeleken met de controles in deze figuur, waarbij immunofluorescentie op cryosneden van B 16 tumoren is gebruikt.Een toename van infiltrerende CD 45-positieve cellen uit tumoren werd bevestigd. Verdere analyse van de fax-gegevens laat een relatieve gemiddelde toename zien van NK-cellen, T-cellen en conventionele CD 11 C-positieve dendritische cellen. In de tumoren waar kein werd overgeëxpresseerd vergeleken met de controletumoren, was er ook een relatieve afname in het percentage immuunonderdrukkende leukocyten, waaronder myeloïde-afgeleide suppressorcellen en plasmacytoïde dendritische cellen.Studies hebben aangetoond dat de ratio van leukocyten-subsets binnen de tumor een belangrijke factor kan zijn voor de tumorgroei en de klinische uitkomsten; ter ondersteuning hiervan was het aantal CD3-positieve T-cellen en NK-cellen per tumor verhoogd in de kein-exprimerende tumoren in vergelijking met de controles. Deze figuur laat zien dat bij een directe vergelijking van effector- en suppressorcelpopulaties binnen de tumormicro-omgeving significante stijgingen in de ratio's van effector- ten opzichte van suppressorcelpopulaties duidelijk zichtbaar waren binnen de kein-exprimerende tumoren vergeleken met de controles. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals cel sortering of cel isolatie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de functionaliteit van tumor-infiltrerende leukocyten.

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het isoleren van zeer zuivere populaties van leucocyten dat tumoren te infiltreren. Dit protocol is een bewerking van de Miltenyi Biotech-protocol om opbrengst en zuiverheid voor het isoleren van cellen van complexe tumorweefsel te verbeteren.

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Deze studie richt zich op de in vivo subcutane inductie van luminescente colorectale kankercellen in een muizenmodel en de daaropvolgende luminescentiemeting met behulp van een beeldvormingssysteem. De procedure heeft tot doel een reproduceerbaar tumorgroeimodel op te zetten voor real-time monitoring en therapeutische evaluatie.

Subcutane injectie van menselijke colorectale kankercellen bij athymische naakte muizen om de werkzaamheid van antitumoren te evalueren

Met de toenemende interesse in intratumorale immunotherapie is het kiezen van tumormodellen die toegankelijk en praktisch zijn, van essentieel belang. Subcutane tumoren zijn gemakkelijk vast te stellen, maar moeilijk te visualiseren en te manipuleren. In dit protocol beschrijven we methoden om intradermale tumoren te genereren die zorgen voor betere zichtbaarheid en toegankelijkheid.

Intradermale tumorimplantatie als robuust model voor intratumorale immunotherapiestudies bij muiskanker

Leer hoe je tumor-infiltrerende leukocyten analyseert in een subcutaan muismodel met B16-melanoomcellen. Deze flowcytometrie-methode onthult immuunceldynamiek voor kankeronderzoek.

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Meer video's verkennen