De Double-H Maze: een robuuste Behavioral Test voor leren en geheugen in Knaagdieren
8 juli 2015
Het doel van dit protocol is om ruimtelijke cognitie bij knaagdieren te onderzoeken. Het double-H waterlabyrint is een nieuwe test, die bijzonder nuttig is om de verschillende componenten van leren, consolidatie en geheugen, evenals de interactie van geheugensystemen, te verduidelijken.
Het algemene doel van het volgende experiment is om ruimtelijk werkgeheugen en knaagdieren te onderzoeken en hun leer- en gedragsstrategie te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een dubbel H-labyrint te construeren om de leer- en geheugenprestaties te beoordelen. Als tweede stap worden dieren geacclimatiseerd aan het labyrint voorafgaand aan gedragstraining.
Vervolgens worden dieren dagelijks in het labyrint getraind met behulp van een egocentrische leerparadigma om een habituele respons te ontwikkelen. Als alternatief kan een allocentrische paradigma worden gebruikt om een plaatsrespons te ontwikkelen. De laatste stap is om de leerstrategie van het dier te beoordelen in een proef waarin hun startpositie wordt gewijzigd en het patroon wordt verwijderd.
De resultaten geven inzicht in de keuze van de leerstrategie die in het labyrint wordt gebruikt op basis van de opnames van het diergedrag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het achtarmige radiolabyrint of het Morris Water maze, is dat het in slechts twee dagen snel kan worden verworven, en het stelt de onderzoeker in staat om het type strategie te bepalen dat door het dier moet worden geleerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gedrag, zoals de dynamische interactie tussen de procedurele en declaratieve geheugensystemen, en hoe deze systemen worden beïnvloed door verschillende behandelingsmodaliteiten.
Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Dr. Richard Pinnell, een postdoc van het laboratorium voor neuro-elektronische systemen. De eerste stap is om het dubbele H-labyrint te construeren. Het labyrint bestaat uit een centrale gang die wordt gekruist door drie parallelle looparmen.
Elk gangpad is 20 centimeter breed en wordt omringd door hoge transparante plexiglaswanden. De wanden worden bevestigd met speciale lijm, bijvoorbeeld agri fix en schroeven, en worden waterdicht gemaakt op alle interne hoeken. Eerst wordt het plexiglas op maat gesneden en worden de interne verbindingen vastgeklemd.
De beschermende plastic coating wordt verwijderd nabij de te lijmen verbinding en alle stofdeeltjes worden verwijderd met een reinigingsmiddel. De twee zijden worden in een 90 graden vorm geplaatst en een speciale tape wordt gebruikt om de uiteinden te verzegelen om lekkage van de lijm te voorkomen. Tijdens het uithardingsproces wordt de lijm bereid door een polymerisatiemiddel te mengen en voorzichtig te roeren. De Croix-lijm wordt aangebracht met behulp van een luchtgedreven spuit.
De verbinding wordt vervolgens bevestigd en waterdicht gemaakt en wordt gelaten uitharden. Er moet een uitlaat worden geplaatst in het labyrint voor afvoer. Plaats het labyrint op een tafel die toegang biedt tot alle zijden.
Goed gecontrasteerde aanwijzingen moeten op de omringende muren worden geplaatst. Label vervolgens de noord- en zuidarmen voor oriëntatie tijdens latere videoanalyse. Plaats ten slotte een camera boven het labyrint voor post-testanalyse van het diergedrag.
Schakel de camera in om de bewegingen van het dier voor elke proef op te nemen. Vul het labyrint voor de voortrainingsfase met transparant water tot een geschatte hoogte van 17 centimeter. Voortraining kan een dag vóór of op dezelfde dag als de trainingssessies plaatsvinden.
Houd de watertemperatuur tussen 21 en 23 graden Celsius om de ratten een prikkel te geven om de ontsnappingsplatform te zoeken. Vul het labyrint de dag voor de test met water om de watertemperatuur te stabiliseren. Ongeacht de startpositie, blokkeer altijd de toegang tot de tegenoverliggende arm met een transparante guillotinedeur.
Wanneer u klaar bent, laat de rat los vanaf het uiteinde van een van de centrale armen. Wanneer de ontsnappingsplatform is bereikt, laat de rat rusten en observeer hun omgeving gedurende ongeveer 15 seconden. Voer vier opeenvolgende proeven uit met minimaal 10 seconden rust tussen de proeven.
Om met de training te beginnen, verplaats het ontsnappingsplatform vanaf zijn voortrainingspositie naar de gekozen arm en voeg water toe om het platform tot één centimeter onder het wateroppervlak te laten weken. Maak vervolgens het water ondoorzichtig door 250 gram mageremelkpoeder toe te voegen. Meng eerst het melkpoeder en water in een aparte fles en verdeel dit mengsel op verschillende plaatsen rond het labyrint.
Roeren helpt om sneller homogeniteit in het labyrintwater te bereiken. Laat de ratten los vanuit een centrale gang zoals eerder is aangetoond, waarbij u ervoor zorgt dat de toegang tot de tegenoverliggende arm is geblokkeerd. Zodra ze zijn vrijgelaten, observeer het gedrag van het dier en neem hun prestaties op, hetzij handmatig of met een videocamera.
Als het doelplatform niet binnen 60 seconden wordt bereikt, leid de rat voorzichtig naar het ontsnappingsplatform en laat de rat daar rusten en hun omgeving observeren. Gedurende ongeveer 15 seconden wordt de rat vervolgens verwijderd en gedroogd met een handdoek voor de volgende proef. Dit is belangrijk zodat de ratten de komende vier dagen niet onderkoeld raken.
Volg het basistrainingsprotocol. Laat de ratten los vanuit de noord- of zuidstartarm in een onvoorspelbare volgorde zodat beide armen twee keer worden gebruikt. Verwijder het ontsnappingsplatform om de sondeproeven op dag zes uit te voeren.
Laat de rat los van een andere arm dan die werd gebruikt tijdens de training. Als ze bijvoorbeeld in de noordarm worden vrijgelaten, worden ze losgelaten van de noordoostarm met de zuidoostelijke arm afgesloten, laat de rat maximaal 60 seconden zwemmen. Laat de rat voor elk van de vier trainingsproeven dagelijks vanuit dezelfde startarm los.
Op de zesde dag verwijdert u het ontsnappingsplatform voor de sondeproef. Laat de rat los van een andere arm dan waar ze tijdens de proef werden losgelaten. Laat de ratten 60 seconden zwemmen.
Na het testen. Bekijk de opnames die zijn gemaakt van de bovenliggende camera, volg handmatig de respons, latenties, initiële en herhaalde fouten, eerste keuzes en responstypen. Voer tot slot een statistische analyse uit
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de ruimtelijke cognitie bij knaagdieren met behulp van een dubbele-H waterdoolhof. Het doel is om componenten van leren, consolidatie en geheugen, evenals de interactie tussen geheugensystemen, te verduidelijken.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragspsychologie
- Cognitieve wetenschap
Achtergrond
- Spatieel werkgeheugen is cruciaal voor navigatie en overleving.
- Knaagdieren worden veelvuldig gebruikt om cognitieve functies te modelleren.
- Het dubbele-H-doolhof is een nieuw instrument voor het beoordelen van geheugenprestaties.
- Inzicht in geheugensystemen kan bijdragen aan de behandeling van cognitieve stoornissen.
Doel van de studie
- Om het ruimtelijk werkgeheugen bij knaagdieren te onderzoeken.
- Om leer- en gedragsstrategieën in een gecontroleerde omgeving te beoordelen.
- Om onderscheid te maken tussen egocentrische en allocentrische leerparadigma's.
Gebruikte methoden
- Constructie van een dubbel-H doolhof voor testen.
- Habituatie van dieren aan de omgeving van het doolhof.
- Dagelijkse training met behulp van een egocentrisch leerparadigma.
- Sonde-proeven om leerstrategieën te beoordelen door startposities te variëren.
Belangrijkste resultaten
- Knaagdieren vertoonden verschillende leerstrategieën op basis van het gebruikte paradigma.
- De prestaties varieerden aanzienlijk tijdens de probe-proeven.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van geheugensystemen bij knaagdieren.
- De resultaten kunnen implicaties hebben voor cognitief onderzoek bij mensen.
Conclusies
- Het dubbele-H-doolhof is effectief voor het bestuderen van ruimtelijke cognitie.
- Verschillende leerparadigma's resulteren in uiteenlopende gedragsresponsen.
- Verder onderzoek is nodig om de onderliggende mechanismen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het dubbele-H-doolhof maakt nauwkeurige controle over de toewijzing van leerstrategieën in knaagdiermodellen mogelijk, waardoor een belangrijke beperking in assays voor ruimtelijke cognitie wordt aangepakt waarbij strategische variabiliteit de interpretatie bemoeilijkt. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie door onderzoekers in staat te stellen egocentrische versus allocentrische geheugenbijdragen te isoleren, wat het voorspellende vertrouwen in preklinische cognitieve screening verbetert. De snelle acquisitietijdlijn van de assay (reeds vanaf twee dagen) en de compatibiliteit met farmacologische of genetische perturbaties positioneren het als een schaalbaar instrument voor vroege discovery-workflows gericht op de modulatie van het geheugensysteem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door specifieke leerstrategieën (allocentrisch of egocentrisch) aan te sturen om de bijdragen van het geheugensysteem te isoleren.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in gedragsmatige resultaten, wat zorgt voor een duidelijkere beoordeling van de target-engagement.
- Strategische waarde: Verbetert de triage van het portfolio door verbindingen te onderscheiden die selectief procedurele versus declaratieve geheugenpaden moduleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve, strategiespecifieke meetwaarden (latenties, fouttypen, armvoorkeur) die geschikt zijn voor high-content screening.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde trainings- en probe-trialprotocollen verbeteren de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en screeningcampagnes.
- Strategische waarde: Compatibel met ondoorzichtig water (bijv. magere melk) om afhankelijkheid van visuele cues te voorkomen, wat de validiteit van de assay bij compound screening waarborgt.
Translationele & Preklinische Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert de dynamische interactie tussen procedurele en declaratieve geheugensystemen, wat relevant is voor de mechanismen van neuropsychiatrische en neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: De vorming van een stabiel geheugenspoor maakt consistente longitudinale tests mogelijk over verschillende behandelingsfasen heen.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortzetting door verbindingen te identificeren die geheugensystemen verschillend beïnvloeden, voorafgaand aan kostbare studies in een later stadium.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het dubbel-H-doolhof past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, in het bijzonder voor cognitieve targets waarbij selectiviteit van het geheugensysteem een belangrijke onderscheidende factor is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over de bijdragen van het geheugensysteem door het mogelijk maken van door de experimentator gestuurde strategie-toewijzing tijdens de training.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gedragsresultaten (ontsnappingslatentie, arm-ingangen, foutpatronen) die de vergelijking van verbindingen en de bevestiging van hits faciliteren.
- Analytics: Genereert analyseerbare eindpunten zoals responslatenties, initiële en repetitieve fouten, en de eerste keuze van de arm voor statistische evaluatie van verschuivingen in de leerstrategie.
- Translationeel onderzoek: Modelleert translationele relevantie door interacties tussen allocentrische en egocentrische systemen te onderzoeken, wat een weerspiegeling is van klinische beoordelingen van geheugendomeinen.
- Enterprise Reuse: Het platformontwerp maakt hergebruik in meerdere studies mogelijk met minimale reconfiguratie, ter ondersteuning van longitudinale screeningscampagnes of campagnes over verschillende verbindingen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door confounders van ongecontroleerde leerstrategieën in ruimtelijke geheugentaken te verminderen.
- Operationele waarde: Hoge reproduceerbaarheid dankzij gestandaardiseerde constructie van het doolhof, controle over de troebelheid van het water en gedefinieerde trialstructuren.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door effecten op cognitieve domeinen te isoleren, waardoor uitval in een laat stadium door onverwachte interacties tussen geheugensystemen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt mechanismegebaseerde prioritering van verbindingen die zich richten op specifieke geheugenpaden, waardoor de kapitaalefficiëntie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt verbeterd.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in gedragsneurowetenschappen en videogebaseerde trackingsystemen voor een nauwkeurige kwantificering van de prestaties.
- Afhankelijk van de precieze fabricage van een transparant plexiglas labyrinth met afgedichte verbindingen en een afvoerpunt om lekken te voorkomen en optische helderheid te garanderen.
- Vereist een consistente controle van de watertemperatuur (21–23°C) en dagelijkse vernieuwing van de ondoorzichtige magere melkoplossing om de validiteit van de assay en het dierenwelzijn te waarborgen.
- Vereist het counterbalancen van startposities en de toewijzing van armen tijdens trainingen en probe-trials om confounders door plaatsleren te vermijden.
- Beperkt tot knaagdiersoorten (ratten/muizen) vanwege de afmetingen van het labyrinth en de motivatie om aan het water te ontsnappen; niet direct schaalbaar naar hogere diersoorten zonder herontwerp.
