Name: Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer de mammosfeerformatie-assay om stamcelachtige cellen in borstkanker te kwantificeren en hun zelfvernieuwingscapaciteit te beoordelen. Deze methode gebruikt CD44+/CD24- sortering en laaghechtingsplaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de Keizerlijke BRC, het National Institute for Health Research, en kankerbestrijding met speciale vermelding voor Hilary Craft en Sir Douglas Myers.

De onderstaande procedures zijn ethisch goedgekeurd door het Imperial College in Londen. 1. Generatie van Primaire Mammospheres van Human Breast Cancer Cell Lines OPMERKING: Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap. <ol><li> Bereid Mammosphere media DMEM / F12 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine. Bereid compleet medium onmiddellijk vóór gebruik door toevoegen van 20 ng / ml recombinant humane epidermale groeifactor (EGF; Sigma), 10 ng / ml humaan recombinant basische fibroblast groeifactor (bFGF; R &amp; D Systems) en 1 x B27 supplement. </li><li> Zuig media van kolf met aanhangend MCF-7 of MDA-MB-231 cellen (of een borstkanker cellijn van uw keuze; 70-80% samenvloeiing), was twee keer in 1x PBS, en trypsinize cellen. </li><li> Centrifugeer cellen bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Giet supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media. Pipetop en neer en gebruik zo nodig een 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen. Gebruik een hemocytometer te zorgen voor een enkele cel suspensie gevormd (niet genummerd, gebruik een 25 G naald aan de celsuspensie spuit tot 3 maal). </li><li> Indien nodig, CD44 + CD24- cellen deelverzameling via FACS met anti-CD24-fycoerythrine (PE) en anti-CD44-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) monoklonale antilichamen 9. Alternatief, isoleren dergelijke populatie met een magnetische-geactiveerde celsortering (MACS) systeem met anti-CD44 en anti-CD24-biotine gecombineerde microbolletjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeren positieve selectie met behulp van LS kolommen, en negatieve selectie met behulp van LD kolommen en bevestig de fenotypes van alle geïsoleerde cellen door flowcytometrie 17. </li><li> Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml met trypan blauw. OPMERKING: Cellevensvatbaarheid wordt berekend als het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de roosters op de hemocyTometer. Cellen die nemen trypaanblauw worden beschouwd als niet-levensvatbaar zijn. De volgende procedure wordt toegepast voor percentage levensvatbare cellen nauwkeurig bepalen. <ol><li> Bereid een oplossing van trypan blauw in PBS 0,4%. Voeg 0,1 ml van trypan blue voorraadoplossing tot 1 ml cellen. Plaats een hemocytometer en onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop bij een lage vergroting. Tel het totale aantal cellen en het aantal blauwe kleuring cellen. Levensvatbare cellen = [1,00 - (Aantal blauwe cellen ÷ Aantal totaal cellen)] × 100. </li><li> Om het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur te berekenen, gebruik dan de onderstaande formule. Vergeet niet om te corrigeren voor de verdunningsfactor. Aantal levensvatbare cellen × 10 4 × 1,1 = cellen / ml cultuur </li></ol></li><li> Resuspendeer een vooraf bepaalde hoeveelheid cellen in 2 ml compleet mammosphere medium in elk putje van een 6-well ultralage hechtende plaat. Het zaaien dichtheid is normaal gesproken 500-4,000 cellen / cm 2 cel per putje. Eventueel gebruik low attachment 24 putjes terwijl enten cellen bij dezelfde dichtheid in 0,5 ml medium. OPMERKING: Wij raden aan de optimalisatie van het zaaien dichtheid en de tijd van de cultuur voor elke cellijnen van belang. </li><li> Incubeer ultra low-attachment 6-well platen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5-10 dagen (afhankelijk van de cellijn en de omvang van mammospheres) zonder de platen, vooral tijdens de groeifase van de eerste 5 dagen . </li></ol> 2. Generation of Primary Mammospheres van menselijke borstkanker klinische monsters OPMERKING: Menselijke borstkanker weefsel kan worden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep voor de verwijdering van borsttumoren. WINKEL weefsel op ijs gedurende 24 uur in 50 ml steriele buizen in kweekmedium bevattende 100 U / ml penicilline en 100 U / ml streptomycine. Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap. <ol><li> Breng het monster in een 100 mm petrischaal tissue met een klein volume media. Afneeme het vetweefsel met behulp van een steriele schaar, Scapel en pincet. </li><li> Voeg 2-3 ml DMEM / F12 en gehakt van het monster in 1 mm 3 stuks met een steriele scapel of scheermesje tot er geen grote stukken blijven. </li><li> Resuspendeer de weefselstukken in voorverwarmde 10 ml DMEM dat proteolytische enzymen (3000 U / ml collagenase en 1000 U / ml hyaluronidase) en incubeer bij 37 ° C in een roterende schudder totdat alle weefsel fragmenten worden gedigereerd. Meestal volledige vertering duurt 1-3 uur. Pas de spijsvertering tijd volgens pathologische tekens van tumoren. (Bijvoorbeeld borstadenocarcinoomcellijn is meestal moeilijker te verteren in vergelijking met mucineus carcinoom dat is meer kwetsbaar en moet korter spijsvertering tijd). Beoordeel de mate van vertering elk half uur door het observeren van 20 ui schorsing onder hemocytometer. </li><li> Laat de fragmenten te sedimenteren gedurende 5 minuten, breng de bovenstaande vloeistof in een 15 ml conische polypropyleen buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur temtuur. Decanteren voorzichtig de supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media. </li><li> Volg de stappen 1.1-1.4 hierboven beschreven cellijnen te verkrijgen en plaat enkelvoudige celsuspensies. Passeren cellen door de 25 G maximaal 2 keer spuit indien nodig te beschadigen cellen te beperken. </li></ol> 3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Berekening <ol><li> Na de kweekperiode, tel de mammospheres (groter dan 40 micrometer) diameter onder een microscoop bij een vergroting van 40x. Beeld digitaal 5 willekeurige velden met behulp van een digitale camera op een lichtmicroscoop en bepalen de mammospheres maat aan de hand van de acquisitie software. Gebruik geen software voor beeldanalyse. </li><li> Bereken Mammosphere Vormen Rendement (MFE%) met de volgende vergelijking: MFE (%) = (# van mammospheres per putje) / (# cellen per well) x 100 </li></ol> 4. Serial passage van de Mammospheres voor de Beoordeling van Self-verlenging <ol><li&gt; Pipette de media waarop de mammospheres uit elk putje in een 15 ml buis. Was de putjes met PBS en aan de verzamelde media. Centrifugeer bij 115 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ul voorverwarmde 0,5% trypsine / 0,2% EDTA. Incubeer gedurende 2-3 min. </li><li> Voeg 500 ul van FCS trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 100 ul mammospheres media, pipetteren op en neer om sferen disaggregeren. </li><li> Tellen cellen met hemocytometer en bepalen of cellen in enkele celsuspensie. Indien niet door een 25 G spuit tot 3 keer om enkele cellen te verkrijgen. Zaad de cellen in een nieuwe ultra low-attachment 6-well plaat bij dezelfde dichtheid die bij de eerste generatie. </li><li> Na 5-10 dagen, te tellen sferen&gt; 40 micrometer en bereken bol vormen efficiency met behulp van de formule vóór gemeld. </li></ol>

<ol><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB%2C+Lin28%2C+Let-7+MicroRNA%2C+and+IL6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li>
<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+current+status+and+evolving+complexities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li>
<li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li>
<li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 
 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558</a> 1707-1710 (1992).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+%2F+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li>
<li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li>
<li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44%3A+promising+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209(2011).</li>
<li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281(2013).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%E2%80%99t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li>
<li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat dat kan worden gezien als nadelig voor de onpartijdigheid van dit artikel.

Succesvolle evaluatie van de primaire en secundaire mammospheres vertrouwt op cellen worden uitgeplaat bij voldoende lage dichtheden die vorm mammospheres van enkele klonen, met minimale bol aggregatie. Maar op dichtheid te laag zijn, te weinig mammospheres kunnen vormen om de effecten van behandelingen statistisch onderscheiden. Zaaien dichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt omdat ze aanzienlijk in hun bol vormen efficiëntie kan variëren (die uitdrukken lage E-cadherine kan minder stabiel en ko...

Het bestaan ​​van de tumor cellijnen onder leiding van de stam-achtige kanker stamcellen is sterk toegevoegd aan ons begrip van de tumor heterogeniteit. Terwijl sommige fenotypische diversiteit in tumoren komt voort uit de klonale uitgroei van genetisch verschillende klonen, verschijnt er een substantieel onderdeel te vloeien uit epigenetische verschillen: kankercellen kan (soms reversibel) overgang tussen stam, stamvader, en gedifferentieerde staten via activering of onderdrukking van specifiek gen expressie programma&#39;s 1-3. Dit kan cel intrinsieke of extrinsieke factoren weerspiegelen, die de genexpressie programma dat momenteel wordt uitgedrukt in een cel met de resulterende autocriene signalering in samenhang met paracrienen van naburige kanker, stromale of immuuncellen leveren modulerende factoren en microenviromental omstandigheden zoals de mate van hypoxie 2,4,5. Hoewel innovatieve lineage tracing benaderingenrukken ons vermogen om vermeende kanker stamcellen bestuderen in hun in vivo niche 6-8, bol vorming assays steeds een populaire en handige op mogelijke borstkankercellen &#39;schatten gedragen als stamcellen, althans onder de assay omstandigheden. Het wordt vaak gebruikt naast achteraf werkwijzen voor het zuiveren van kanker stamcellen, hun expressie van membraan merkers CD44 en CD24 9 en activiteit van het enzym ALDH (aldehyde dehydrogenase) 10 markers die zijn voorgesteld overeenkwam met meer mesenchymal- en epitheliale -achtige kanker stamcellen respectievelijk 11. De bol vorming benadering werd eerst ontwikkeld als neurosphere assay, waardoor de groei van putatieve stamcellen uit één klonen in niet-hechtende, serumvrije omstandigheden met de toevoeging van epitheliale groeifactor (EGF) 12, later wordt nuttig toegepast om de normale en kankerachtige borstweefsel. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De identiteit van de bol vormende grondlegger cel en de gemengde celtypen waaruit de bol massa, zijn relevant voor de gevolgtrekkingen kunnen worden gemaakt van mammo- of andere bol vormende assays. Langlopende latente bot fide stamcellen, dacht te rusten in G0 fase, zal niet de ervaring van de precieze combinatie van factoren die activering in vivo zou bevoordelen. De mammosphere test plaats maakt de groei van cellen ofwel klaar voor mitotische deling of reeds verdelen 13. Deze progenitors, hoewel niet echt rustende cel, kan de cel stadium dat proliferates met EGF en basische fibroblast groeifactor (bFGF) mitogenen in de assay. Niettemin, ze bevatten een reeks van geactiveerde stamcellen geassocieerde signaaltransductiewegne 14. Bovendien is de snelheid van hun vorming betreft de tumorigeniciteit van het weefsel van opname van, gemeten door hun vermogen in beperkte verdunning assays muis xenotransplantaten 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. Hier geven we gedetailleerde protocollen enkele cellen isoleren en te kweken primaire mammospheres zowel humane borstkankercellijnen en klinische monsters van borsttumoren. We beschrijven ook hoe seriële passages van primaire mammospheres voeren om zelf-vernieuwing te beoordelen, en hoe te berekenen bol vormen efficiëntie die vergelijking over verschillende zaaien dichtheden (zie schema in figuur 1) mogelijk maakt.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicillin &amp; Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>R&amp;D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0.5% trypsin/0.2% EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Low attachment 6-well plates</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Sterile razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Sterile micro-dissecting scissors</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

mammosphere formation assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Net als bij gezonde weefsels, veel bloed en solide tumoren zijn nu gedacht aan hiërarchisch georganiseerd worden, met een subset van stamcellen-achtige kankercellen die zichzelf te vernieuwen, terwijl die aanleiding geven tot meer gedifferentieerde nageslacht. Het begrijpen en zich richten op deze kankerstamcellen bij borstkanker, die verbeterde chemo- en radio-weerstand ten opzichte van de niet-stam tumor bulk kunnen bezitten, is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied. Markers zoals CD44, CD24 en ALDH activiteit kan beoordeeld worden met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om prospectief isoleren cellen die verbeterde tumorigeniciteit weergegeven wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen: de mammosphere test ook worden veel gebruikt voor zijn vermogen om achteraf identificeren sphere- vormende cellen die zich ontwikkelen uit enkele stamcel-achtige klonen. Hier schetsen we benaderingen voor de juiste kweken van mammospheres uit cellijnen of primaire monsters van patiënten, hun passage, en berekeningen te schatten bol forming efficiëntie (SFE). Eerst bespreken we de belangrijkste overwegingen en valkuilen in de juiste planning en interpretatie van mammosphere experimenten.

Verschillende monsters of die aan verschillende behandelingen kunnen variëren in het aantal mammospheres&gt; 40 urn die ontstaan ​​na normaliseren initiële cellen gezaaid. Bereken mammosphere vormende efficiëntie (MFE) voor elke behandeling gekweekt in drievoud. Dit maakt experimenten met verschillende dichtheden zaaien te vergelijken. Gegevens best weergegeven op een staafdiagram, idealiter met positieve en negatieve controles, en tonen de standaardafwijking over de drievoudige putjes. Consequent overdracht hechtende c...

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het schatten van de proportie stamcelachtige cellen binnen een kankercellijn of tumorweefselmonster, en het beoordelen van hun vermogen tot zelfvernieuwing over opeenvolgende passages. Om dit te bereiken, wordt een kankercellijn of tumorweefsel verwerkt om een suspensie van enkelvoudige cellen te genereren, die vervolgens wordt gesorteerd om CD 44-positieve en CD 24-negatieve cellulaire subpopulaties te isoleren. De cellen worden gezaaid op platen met lage aanhechting, krijgen tijd om te groeien en worden vervolgens via lichtmicroscopie onderzocht op sfeervorming.De vormingsefficiëntie wordt gekwantificeerd door het aantal gevormde sferen te bepalen ten opzichte van het aantal oorspronkelijk gezaaide cellen. Het proces van het genereren van een enkelcel-suspensie, het bieden van tijd voor groei en het bepalen van de sfeer-vormingsefficiëntie wordt herhaald over opeenvolgende passages, wat uiteindelijk een maat geeft voor het vermogen van de cellen tot zelfvernieuwing over tijd. Deze methode biedt een eenvoudige perspectivische assay om cellen te identificeren die functionele eigenschappen van stamcellen vertonen, zoals zelfvernieuwing, evenals een kwantitatieve schatting van het aantal stamcellen afkomstig uit in vivo tumoren.Een centraal uitgangspunt van sfeer-vormende assays is dat elke sfeer afkomstig is van een enkele cel en daarom klonaal is. Om deze redenen is de celdichtheid de belangrijkste parameter in deze assay, omdat deze een kritieke impact heeft op de clonaliteit. Werk onder een steriele cultuurkap. Begin deze procedure met MCF 7 of MDA MB 231 cellen die 70 tot 80% confluent zijn.Aspireer het medium uit de kolf en was de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens tripsin EDTA toe en incubeer gedurende twee tot zes minuten; na loslating wordt dit gestopt door het toevoegen van mammos sphere medium met 10% FBS. Zodra de cellen zijn losgelaten, worden ze overgebracht naar een conische centrifugebuis van 15 milliliter en gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Giet na de centrifugatie het supernatant af. Resuspendeer de cellen vervolgens in één tot vijf milliliter manosphere-medium en pipetteer dit 10 keer op en neer om het celpellet op te lossen. Breng de celsuspensie daarna door een cell strainer-filter van 40 micron en vang het filtraat op in de bijgevoegde buis.Om een enkelcel-suspensie te verkrijgen, breng ik een aliquot van 20 µL van de geresuspendeerde cellen aan op een hemocytometer en gebruik ik een microscoop om deze te onderzoeken. Indien er celclusters worden waargenomen zoals hier te zien is, gebruik dan een spuit om de suspensie één of twee keer door een naald van 25 gauge te persen. Zodra de cellen zijn gedispergeerd tot een enkelcel-suspensie zoals hier getoond, kunnen CD 44-positieve CD 24-negatieve celpopulaties worden geïsoleerd via fluorescence activated cell sorting of magnetic activated cell sorting.Gebruik een LS-kolom om de CD 44-positieve cellen positief te selecteren. Aangezien de gewenste cellen aan de wanden van de LS-kolom hechten, wordt de doorstroom verworpen, waarna de cellen uit de kolom worden verwijderd. Breng vijf milliliters buffer aan en gebruik de bij de kolom geleverde zuiger om de gewenste cellen uit te spoelen.Gebruik vervolgens een LD-kolom om de populatie verder te zuiveren door middel van negatieve selectie. Hierbij hechten de CD 24-positieve cellen zich aan de LD-kolommen. Verzamel de doorstroomfractie, welke de CD 24-negatieve cellen bevat.Bevestig vervolgens met behulp van flowcytometrie de fenotypen van alle geïsoleerde cellen. Bereken met de trypanblauw-uitsluitingsmethode de dichtheid van levensvatbare cellen nadat de celsuspensie op de juiste wijze is verdund. Zaai in elk putje van een zes-wells ultralow attachment-plaat 500 tot 4 000 cellen per vierkante centimeter in twee milliliter compleet mammosfeer-medium.Incubeer de platen vijf tot 10 dagen, waarbij u er zorg voor draagt ze niet te verstoren, totdat er sferoïden waarneembaar zijn. Zet de kweek voort totdat de sferoïden een diameter van ten minste 40 microns hebben bereikt, maar nog niet apoptotisch zijn geworden. Verkrijg humaan borstkankerweefsel van patiënten die een chirurgische ingreep ondergaan voor de verwijdering van borsttumoren.Bewaar het weefsel tot 24 uur op ijs in steriele buizen van 50 milliliters met DMEM dat 100 units per milliliter penicilline en 100 units per milliliter streptomycine bevat, terwijl u werkt in een steriele weefselkweekkap.Breng het monster met een steriele schaar, een scalpel en pincetten over naar een weefselkweekschaal van 100 millimeter die een klein volume medium bevat. Verwijder het vetweefsel. Voeg twee tot drie milliliters D-M-E-M-F 12 toe en hak het monster met een steriele scalpel of een scheermesje fijn totdat er geen grote stukken meer overblijven.Plaats de weefselstukjes in 10 milliliters voorverwarmd DMEM dat proteolytische enzymen bevat en incubeer dit bij 37 degrees Celsius in een rotatieschudder gedurende één tot drie uur. Bij het isoleren van levensvatbare primaten tumorcellen met behulp van digestieve enzymen is er een kritieke afweging tussen celsterfte en voldoende extractie uit de cellulaire matrix. Om succes te garanderen, is het essentieel om deze digestie regelmatig te monitoren. Pipetteer elke halve uur 20 microliters van de suspensie op een hemocytometer en gebruik een microscoop om de graad van digestie te beoordelen.Zodra de digestie voltooid is, laat u de fragmenten vijf minuten bezinken. Draag vervolgens het supernatant over naar een conische polypropyleen buis van 15 milliliter.Centrifugeer uw monster 200 ×g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer na het centrifugeren voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in één tot vijf milliliter mammosferemedium. Bereid vervolgens enkelcel-suspensies en plate deze zoals beschreven in de vorige sectie.Resuspendeer in deze video de cellen door ze maximaal twee keer door een spuit met een 25 gauge naald te pipetteren om de cellen indien nodig te dispergeren. Observeer de cellen na de kweekperiode bij een 40-voudige vergroting onder een microscoop die is uitgerust met een digitale camera. Leg beelden vast van vijf willekeurige velden.Zodra alle afbeeldingen zijn genomen, gebruikt u de acquisitiesoftware om het aantal microsferen te bepalen dat een diameter van meer dan 40 microns heeft. Bereken tot slot de efficiëntie van de metasfeer-vorming door het aantal mamos-sferen in elke well te delen door het aantal gezaaide cellen in elke well en dit te vermenigvuldigen met 100. Pipetteer het medium met de mamos-sferen uit elke well in een buisje van 15 milliliter. Was elke well met PBS en voeg dit toe aan het verzamelde medium.Centrifugeer de cellen vervolgens 10 minuten bij 115 ×g op kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg. Resuspendeer het pellet in 500 µL voorverwarmde trypsine-EDTA en incubeer dit gedurende twee tot drie minuten.Voeg na de incubatie 500 µL FBS toe om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 500 ×g. Zodra het centrifugeren is voltooid, wordt het supernatant weggegooid en wordt de pellet geresuspendeerd in 100 µL mammosfeer-medium; pipetteer dit op en neer om eventuele sferen te disaggregeren. Tel vervolgens met een hemocytometer de cellen en bepaal of deze zijn gedispergeerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen.Indien dit niet het geval is, worden ze maximaal twee keer door een spuit met een 25 gauge naald geperst om enkelvoudige cellen te verkrijgen. Zaai de cellen uit in een nieuwe ultralow attachment six-well plaat met dezelfde dichtheid als gebruikt bij de primaire generatie. Tel na vijf tot 10 dagen de sferen die groter zijn dan 40 microns en bereken de efficiëntie van sfeervorming zoals eerder beschreven om de sfeervormingsefficiëntie te schatten. Mammosferen werden gekweekt uit een epitheliale oestrogeen-positieve CF7- en een mesenchymale triple-negatieve MDA 2 3 1-cellijn zoals beschreven in deze video; aantallen mammosferen groter dan 40 microns geven een schatting van de sfeervormingsefficiëntie voor elke cellijn.Let op dat de minimale aggregatie van celfusie die hier te zien is, werd bereikt door uitplaten bij een lage dichtheid van 500 cellen per vierkante centimeter voor MCF 7 en 1000 cellen per vierkante centimeter voor MDA 2 3 1. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mammosferen, afgeleid van verschillende cellijnen of van chirurgische tumorstalen, kunt kweken en tellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat cellen bij lage dichtheden moeten worden gezaaid om clonaliteit te waarborgen, en om ervoor te zorgen dat een hoog percentage cellen levensvatbaar is bij het extraheren van cellen uit chirurgische stalen.Naast deze procedure moeten andere methoden, zoals het transplanteren van xenograft-celpopulaties in immuungecompromitteerde muizen, worden uitgevoerd om de in vivo tumorgeniciteit van de betreffende weefsels te bepalen.

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

HC11 lactogenic differentiatie kan worden gekenmerkt door de vorming van overkoepelde bedoelde structuren als mammospheres. De structuren kunnen worden opgesomd door de fase-contrast-microscopie om te helpen bij het kwantificeren van lactogenic differentiatie.

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

Deze video beschrijft het isoleren van kankerstamcellen van borstkankercellijnen. We kweeken deze kankerstamcellen om primaire mammosfeer te genereren voor het beoordelen van zelfvernieuwing en het berekenen van sfeervormende efficiëntie, waardoor vergelijking tussen verschillende zaaidichtheden mogelijk is.

Generatie van primaire mammosfeer: een techniek om celpotentie te bepalen

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Hier beschrijven we de uitvoering en interpretatie van de resultaten van een in vitro mammosphere zelf vernieuwing kwantitatieve assay.

Kwantificering van zelf vernieuwing in Muriene Mammosphere culturen

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Dit protocol beschrijft de methode voor het opzetten van de mammosfeervormingstest om Apoptosis Inhibitor 5 (Api5)-geïnduceerde kankerstam in niet-tumorogene borstepitheelcellen te bestuderen. Lysaten die uit mammosferen van de primaire generatie worden verzameld, worden geanalyseerd op verschillende stammarkeringen om de inductie van stamcelachtige eigenschappen te beoordelen.

Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen

Leer de mammosfeerformatie-assay om stamcelachtige cellen in borstkanker te kwantificeren en hun zelfvernieuwingscapaciteit te beoordelen. Deze methode gebruikt CD44+/CD24- sortering en laaghechtingsplaten.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Meer video's verkennen