Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting
May 1st, 2015
Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.
Het algemene doel van deze procedure is om hoge zuiverheidsgraad lymfatische endotheelcellen te isoleren die de lymfatische vaten van humane lymfatische malformaties en voorhuiden bekleden met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering. Dit wordt eerst bereikt door een monster van patiëntweefsel enzymatisch te verteren. In de tweede stap wordt de single cel suspensie gekweekt om het aantal lymfatische endotheelcellen te verrijken.
In het monster. De cellen worden vervolgens gelabeld met antilichamen voor de celoppervlaktemarkers van belang en gesorteerd met behulp van multi-parameter fluorescentie geactiveerde celsortering. Uiteindelijk kunnen de lymfatische endotheelcellen van de voorhuid en lymfatische malformatie in celcultuur worden uitgebreid voor verdere downstream analyse.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat fluorescentie geactiveerde celsortering cellen oplevert met een zuiverheidsgraad van meer dan 99%, waardoor de problemen die gepaard gaan met het verlies van lymfatische endotheelcellen als gevolg van overgroei door besmettende cellen worden vermeden. Begin met het wegen van een buis van 50 milliliter die 10 milliliter medium bevat, aangevuld met een antibiotische antimycotische oplossing. Breng vervolgens de lymfatische malformatie of vier huidmonsters over in de buis en weeg de buis opnieuw om het gewicht van het weefsel te bepalen.
Vervolgens, in een bioveiligheidskast van klasse twee, gebruik steriele pincetten om het weefsel en medium over te brengen in een weefselkweekschaal van 100 millimeter met behulp van steriele schaar. Snip ten slotte het weefsel in stukjes van één kubieke millimeter. Breng vervolgens de stukjes over in een buis van 50 milliliter met 10 milliliter vers antibioticum antimycotisch.Medium.
Slinger de buis een paar keer om het weefsel opnieuw te suspenderen en draai vervolgens de steekproef omlaag. Na het verwijderen van het supernatant, voegt u één milliliter voorverwarmde verteringsoplossing toe per 100 milligram gesneden weefsel en incubeert u het weefsel in een incubator van 37 graden Celsius met constant schudden bij 200 RPM Voor een succesvolle verrijking van de lymfatische endotheelcellen. Het is van cruciaal belang om te herkennen wanneer de cellen voldoende zijn blootgesteld aan de collageenase en dys ruimte reactie, zodat ze de isolatie overleven.
Dit wordt bereikt door zorgvuldige monitoring van het weefsel verteringsproces en het stoppen van de reactie wanneer het meeste weefsel is verteerd tot fijne fragmenten. Aan het einde van de incubatie, bevestigt u dat bijna al het weefsel is verteerd tot kleine fragmenten en filtert u de weefselslurry door een zeef van 70 micron in een steriele buis van 50 milliliter. Gebruik nu een zuigerpomp van drie milliliter met rubberen zuiger om het resterende weefsel te malen totdat er slechts kleine sporen van extracellulair matrix worden waargenomen.
Was vervolgens de celzeef met een volume endotheelcel medium gelijk aan het volume van het dissociërende enzym medium en draai de cellen omlaag. Breng de pellet in slaap in maximaal 20 milliliter endotheelcel medium, afhankelijk van de grootte van het monster. Tel vervolgens de gezaaide cellen, twee keer 10 tot de zes cellen in een fles van 150 vierkante centimeter vooraf gecodeerd met fibronectine in een eindvolume van 20 milliliter endotheelcel medium voor overnachtelijke kweek.
De volgende ochtend, was de ongebonden cellen weg met drie spoelingen van PBS aangevuld met antibiotische antimycotische oplossing. Voeg vervolgens vers endotheelcel medium toe aan de cellen en incubeer de cultuur gedurende vijf tot zeven dagen totdat de cultuur ongeveer 80%confluent is. Om de cellen te kleuren voor sortering door multi-parameter fluorescentie geactiveerde celsortering.
Verwijder eerst het celmedium, was de cellen drie keer in PBS. Voeg vervolgens zeven milliliter detacheringsoplossing toe na vijf tot zeven minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Oogst de gedissocieerde cellen, inactiveer de enzymen met drie volumes endotheelcel medium en breng de celsuspensie over in een steriele buis.
Centrifugeer de cellen drie keer en was de pellet bij de tweede en derde draai in vijf milliliter PBS na de laatste wasbeurt. Breng de pellet opnieuw in slaap in vijf milliliter vers PBS en tel het aantal levensvatbare cellen door trian blauwe uitsluiting. Na celtelling.
Breng de cellen aseptisch over in flowcytometrie kleuring buizen en draai de cellen omlaag om niet-specifieke binding te blokkeren. Breng de cellen opnieuw in slaap in 5%F-B-S-P-B-S, en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Na het blokkeren centrifugeren verwijdert u de supernatant en brengt u de cellen opnieuw in slaap.
Breng de pellet opnieuw in slaap in CD 34, CD 31 potanin en VEGF receptor drie antilichaamcocktail. Was de cellen na 20 minuten op ijs drie keer in twee milliliter F-B-S-P-B-S om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen en breng de cellen opnieuw in slaap. Breng de pellet opnieuw in slaap in 300 microliter propidiumjodide in F-B-S-P-B-S oplossing op ijs.
Sorteer tenslotte de gezuiverde humane lymfatische endotheelcellen op een multi-parameter fluorescentie geactiveerde celsorteringsinstrument. Draai vervolgens de gesorteerd cellen omlaag en breng de pellets opnieuw in slaap in het juiste medium voor celcultuur zaaien. Hier zijn normale humane lymfatische en lymfatische malformatie vaten getoond die zijn gelabeld met antilichaam tegen pot deplane in, merk de duidelijke dilatatie en aanzienlijke lumengrootte variatie binnen de humane lymfatische malformatie vaten op.
Inderdaad, de meeste lymfatische malformaties bevatten zowel kleine of microcystische als grote of macrocystische abnormale cystische structuren na de initiële weefselvertering en 24 uur kweek in de ongefractioneerde monsters. Naast fibroblast-achtige cellen en gladde spiercellen kunnen duidelijke endotheelcelkolonies worden waargenomen na sortering en een verdere 24 uur in celcultuur. De CD 34, lage CD 31 positieve VEGF receptor drie positieve podo plane en positieve cellen die aan het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol heeft tot doel hoge zuiverheid lymfatische endotheelcellen te isoleren uit menselijke lymfatische malformaties en voorhuiden met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Het proces omvat enzymatische vertering van weefselmonsters en daaropvolgende celcultuur om lymfatische endotheelcellen aan te rijken voor verdere analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Lymfatische endotheelcellen zijn cruciaal voor het begrijpen van lymfatische malformaties.
- Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) maakt de isolatie van specifieke celtypen mogelijk.
- Celcultuurtechnieken maken de expansie van geïsoleerde cellen voor onderzoek mogelijk.
- Het begrijpen van deze cellen kan leiden tot inzichten in verschillende ziekten.
Doel van de studie
- Om lymfatische endotheelcellen uit menselijk weefsel te isoleren.
- Om experimentele benaderingen voor het bestuderen van genetische en proteomische kenmerken te verbeteren.
- Om functionele studies en celdifferentiatieonderzoek te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Enzymatische vertering van weefselmonsters om een enkele celsuspensie te maken.
- Cultiveren van de enkele celsuspensie om lymfatische endotheelcellen te verrijken.
- Cellen labelen met antilichamen die zich richten op specifieke oppervlaktemarkers.
- Cellen sorteren met behulp van multi-parameter fluorescentie-geactiveerde celsortering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogzuivere lymfatische endotheelcellen.
- Verrijking van lymfatische endotheelcellen door cultuurtechnieken.
- Voorbereiding van cellen voor downstream analyse.
- Mogelijkheden voor verder onderzoek naar lymfatische malformaties.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het isoleren van lymfatische endotheelcellen.
- Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende experimentele studies.
- Deze aanpak verbetert het begrip van aandoeningen van het lymfestelsel.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells enables mechanistic de-risking of lymphatic malformation targets and supports predictive confidence in early discovery. This method provides a disease-relevant system for target validation and assay development in vascular biology. The high-purity output facilitates translational biomarker screening and preclinical model generation for rare lymphatic disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lymphatic endothelial phenotype in diseased and healthy human tissue.
- Operational Value: Provides a purified cellular substrate for target engagement and pathway analysis.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation in rare vascular disorders with limited biological insight.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lymphatic endothelial cells for reproducible assay formats.
- Operational Value: Yields >99% pure cells, reducing variability in downstream compound screening.
- Strategic Value: Enables scalable production of disease-relevant cells for high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of lymphatic malformation pathophysiology.
- Operational Value: Provides expanded cells for functional validation and biomarker discovery.
- Strategic Value: Facilitates preclinical de-risking of lymphatic-targeted therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated lymphatic endothelial cells serve as a discovery biology tool that enables target validation and pathway clarification in vascular therapeutics.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by providing pure human lymphatic endothelial cells for target interrogation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-purity cell production for compound evaluation.
- Analytics: Facilitates quantitative readouts via flow cytometry and functional assays on sorted populations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through expanded cells for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for lymphatic endothelial cell sourcing across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through disease-relevant human cellular models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via FACS-based isolation with >99% purity.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk through early mechanistic de-risking of lymphatic targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of lymphatic malformation therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation and multi-parameter flow cytometry.
- Dependent on access to FACS instrumentation and antibody panels for CD34, CD31, VEGFR-3, and PODOPLANIN.
- Necessitates sterile tissue handling and biosafety cabinet protocols for primary human samples.
- Requires optimization of digestion times to balance cell yield and viability across tissue types.
- Dependent on fibronectin-coated culture surfaces for lymphatic endothelial cell adhesion and expansion.
