Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van lymfatische endotheelcellen met een hoge zuiverheid, die de lymfevaten van menselijke lymfatische malformaties en voorhuiden bekleden, middels fluorescerend geactiveerde cel sortering. Dit wordt eerst bereikt door een weefselmonster van een patiënt enzymatisch te verteren. In de tweede stap wordt de single-cell suspensie gekweekt om het aantal lymfatische endotheelcellen te verhogen.

In het monster. De cellen worden vervolgens gelabeld met antilichamen tegen de celoppervlaktemarkers van belang en gesorteerd met behulp van multiparametrische fluorescentie-geactiveerde celsortering. Uiteindelijk kunnen de lymfatische endotheelcellen uit de voorhuid en de lymfatische malformatie worden uitgebreid in celkweek voor verdere downstream-analyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat fluorescentie-geactiveerde cel sortering cellen oplevert met een zuiverheid van meer dan 99%, waardoor problemen die gepaard gaan met het verlies van lymfatische endotheelcellen door overgroei van contaminerende cellen worden vermeden. Begin met het wegen van een buis van 50 milliliter die 10 milliliter medium bevat, aangevuld met een antibioticum-antimycotica-oplossing. Breng vervolgens de lymfatische malformatie of het huidmonster over in de buis en weeg de buis opnieuw om het gewicht van het weefsel te bepalen.

Gebruik vervolgens in een biosafety cabinet klasse II steriele pincetten om het weefsel en medium met een steriele schaar over te brengen naar een kweekschaal van 100 millimeter. Hak het weefsel tot slot in stukjes van één kubieke millimeter. Breng de stukjes daarna over in een buis van 50 milliliter met 10 milliliter vers antibioticum-antimycoticum-medium.

Wervel de buis een paar keer om het weefsel opnieuw te suspenderen en centrifugeer vervolgens het monster. Verwijder het supernatant en voeg één milliliter voorverwarmde digestiesolutie toe per 100 milligram fijngehakt weefsel. Incubeer het weefsel in een incubator bij 37 °C met constant schudden op 200 RPM. Voor een succesvolle verrijking van de lymfatische endotheelcellen is het cruciaal om te herkennen wanneer de cellen voldoende zijn blootgesteld aan de collagenase- en dyspase-reactie, zodat ze de isolatie overleven.

Dit wordt bereikt door zorgvuldige monitoring van het weefselverteringsproces en door de reactie te stoppen wanneer het grootste deel van het weefsel is verteerd tot fijne fragmenten. Bevestig aan het einde van de incubatie dat bijna al het weefsel is verteerd tot kleine fragmenten en filtreer het weefselsuspensie door een 70 micron zeef in een steriele 50 milliliter buis. Gebruik nu een zuiger van een drie milliliter spuit met rubberen dop om het resterende weefsel fijn te malen totdat er slechts kleine sporen van de extracellulaire matrix zichtbaar zijn.

Was vervolgens de celzeef met een volume endotheelcelmedium dat gelijk is aan het volume van het medium met het dissociatie-enzym en centrifugeer de cellen opnieuw. Suspendeer de pellet in maximaal 20 milliliters endotheelcelmedium, afhankelijk van de grootte van het specimen. Zaai vervolgens, na het tellen, 2 × 10⁶ cellen in een 150 vierkante centimeter kolf die vooraf is gecoat met fibronectine in een eindvolume van 20 milliliters endotheelcelmedium voor cultivering gedurende één nacht.

Was de volgende ochtend de niet-gebonden cellen weg met drie spoelingen van PBS aangevuld met antibioticum-antimycoticumoplossing. Voeg vervolgens vers endotheliaal celmedium toe aan de cellen om het aantal lymfatische endotheelcellen te vergroten en incubeer de cultuur vijf tot zeven dagen totdat de cultuur ongeveer 80% confluent is. Kleur de cellen vervolgens voor sortering via multi-parameter fluorescence activated cell sorting.

Verwijder eerst het celmedium en was de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens zeven milliliter losmakingsoplossing toe na een incubatie van vijf tot zeven minuten bij 37 °C. Oogst de gedissocieerde cellen, inactiveer de enzymen met drie volumes endotheelcelmedium en breng de celsuspensie over in een steriele buis.

Centrifugeer de cellen drie keer en was het pellet bij de tweede en derde centrifugeerbeurt in vijf milliliter PBS na de laatste wasstap. Resuspendeer het pellet in vijf milliliter verse PBS en tel het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-exclusie. Na het tellen van de cellen.

Breng de cellen aseptisch over naar flowcytometrie-kleuringbuisjes en centrifugeer de cellen om aspecifieke binding te blokkeren. Resuspendeer de cellen in 5%F-B-S-P-B-S en incubeer deze gedurende 20 minuten op ijs. Na het blokkeren centrifugeert u de cellen, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de cellen.

Resuspendeer het pellet in een antilichaamcocktail tegen CD 34, CD 31 en VEGF-receptor drie. Was de cellen na 20 minuten op ijs drie keer in twee milliliter F-B-S-P-B-S om ongebonden antilichamen te verwijderen en resuspendeer. Resuspendeer het pellet op ijs in 300 µL propidiumjodide in F-B-S-P-B-S-oplossing.

Sorteer ten slotte de gezuiverde humane lymfatische endotheelcellen met een multi-parameter fluorescence-activated cell sorting-instrument. Centrifugeer vervolgens de gesorteerde cellen en resuspendeer de pellets in het juiste medium voor het uitplaten van de celcultuur. Hier worden normale humane lymfatische vaten en vaten uit een lymfatische malformatie getoond die gelabeld zijn met een antilichaam tegen podoplanine; let op de uitgesproken dilatatie en de aanzienlijke variatie in lumenomvang binnen de vaten van de humane lymfatische malformatie.

Inderdaad bevatten de meeste lymfatische malformaties zowel kleine of microcystische als grote of macrocystische abnormale cystische structuren na de initiële weefseldigestie en 24 uur kweek in de ongefractioneerde monsters. Na sortering en een verdere 24 uur in celkweek kunnen er, naast de fibroblast-achtige cellen en gladde spiercellen, duidelijke endotheelcelkolonies worden waargenomen. De CD 34, laag CD 31 positieve VEGF receptor drie positieve podoplane en positieve cellen hechten echter aan de kweekcontainer en vertonen de typische cobblestone-morfologie die in deze afbeeldingen te zien is.

Na het bekijken van deze video zou u een goede basiskennis hebben van hoe u met een hoge zuiverheid lymfatische endotheelcellen kunt isoleren die de wand vormen van humane lymfatische malformaties en dermale lymfevaten met behulp van fluorescence-activated cell sorting. Vergeet niet dat werken met primair menselijk weefsel gevaarlijk kan zijn, omdat het infectieuze agentia kan bevatten die schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid. Standaard voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, een beschermbril en een laboratoriumjas, moeten altijd worden in acht genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.