Name: Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Leer de maximale isometrische krachtmeting van gepermeabiliseerde skeletspiervezels met behulp van laserinterferentie en calciumstimulatie. Deze methode biedt inzicht in spiercontractie zonder de complexiteit van intacte spieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de volgende financieringsbronnen: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
</ol>

De productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Aurora Scientific

Evaluaties van de contractiele eigenschappen van gepermeabiliseerde enkele skeletspier vezels worden gebruikt om spierfunctie onderzoeken een zeer verschillende omstandigheden. Voorbeelden zijn studies die de gevolgen van de vergrijzing 12 geëvalueerd, oefenen 10,13,14, ruimtevaart 15, letsel 2,3,16, medicamenteuze behandelingen 17,18, de ziekte van 19 en genetische manipulatie 20,21 op glasvezel structuur en functie. Door de mogelijkheid om de contractiliteit van myofibrillen rechtstreeks beoordelen hun eigen configuratie, verschaft deze techniek een aantrekkelijk platform om een ​​begrip van myofibrillaire functie afwezigheid van potentieel verstorende effecten die aanwezig zijn vormen wanneer neuromusculaire signaaloverdracht en excitatie-geïnduceerde calciumafgifte zijn in het bestudeerde systeem. Bovendien kunnen functionele testen van afzonderlijke vezels worden gebruikt om contractiele eiwitten identificatie results zoals aanvullingverkregen door middel van immunohistochemie of gelelectroforese + western blot 22. Een van de belangrijkste functies van skeletspier te dwingen te genereren. Bijgevolg sF o, een maat voor de intrinsieke kracht genererende capaciteit van een contractiele systeem, is van groot belang voor de spieren fysiologen. Betrouwbare schattingen van sF o vereisen nauwkeurige metingen van zowel vezels CSA en F o. Sinds vezels zijn, in het algemeen, noch cirkelvormig in doorsnede, noch uniform in CSA langs hun lengte, grote zorg moeten worden genomen bij de schatting van CSA. Hiertoe zijn metingen op verschillende plaatsen over de lengte van de vezel en op elke locatie, vanuit twee perspectieven gescheiden door 90 °. Betrouwbare maatregelen van F o vereisen aandacht voor verschillende gegevens, waaronder boekhouding voor passieve kracht, het aanpassen van sarcomeer lengte overlap van dikke en dunne filamenten te maximaliseren, het gebruik van een activerende oplossing met een calciumconcentratie that resulteert in maximale activering, het handhaven van de gewenste experimentele temperatuur, altijd optimaal opslagomstandigheden (temperatuur en duur) van de vezels voorafgaande aan de dag van het experiment. Terwijl de hier geschetste stappen beschreven procedure voor het evalueren maximale isometrische kracht, is het vaak wenselijk om andere belangrijke functionele eigenschappen van de skeletspier vezels evalueren. Dit kan worden bereikt door uitbreiding van het experimentele protocol om extra mechanische manipulaties van de vezel omvatten. Bijvoorbeeld, het meten van de snelheid waarmee de vezel verkort tegen een reeks van verschillende ladingen basis hiervan kunnen de kracht-lengte relatie, waaruit kracht-snelheid-vermogen en vermogen relaties kunnen worden berekend 10,23,24. Bovendien kan de snelheid van verkorting onbelaste worden vastgesteld met behulp van de &quot;slack test&quot; 25, die bestaan ​​uit het aanbrengen van een reeks van speling inducerende verkorting stappen en measuring van de tijd die de fiber to the strak te trekken. Een andere kinetische parameter die vaak wordt gemeld is k tr, de snelheidsconstante voor kracht herontwikkeling na een mechanische storing die tijdelijk alles los crossbridges 26. Ten slotte is de relatie tussen calciumconcentratie en werkzame kracht genereren (de &quot;force-pCa verhouding&quot;) vaak plaats 18 en kan worden bepaald door het blootstellen van de vezel een aantal oplossingen met calcium concentraties van beneden de drempel voor de contractiele systeem die voldoende is om een maximale activatie en bijgevolg maximumkracht (Fo) wekken. Hoewel veel van de genoemde apparatuur nodig voor het beoordelen enkele vezel contractiliteit, andere uitrusting is niet absoluut noodzakelijk. De lengte-controller, bijvoorbeeld, is onmisbaar voor de experimentele protocol dat snelle en exacte verlenging of verkorting van de vezels vereist,maar is niet absoluut noodzakelijk voor het evalueren maximale isometrische kracht (hoewel een zero-krachtniveau van de kracht stilstaande worden geïdentificeerd met een middel). De prisma&#39;s de waarneming van de vezels van opzij toe, hoewel nuttig voor de beoordeling doorsnede, niet absoluut noodzakelijk zijn bij het positioneren van de vezel in de experimentele kamer. Verder alternatief middel voor het belichten van de vezel over de verschillende experimentele oplossingen kunnen worden gebruikt, waaronder ontwerpen een handbediende stelsel van kamers of een enkele kamer die het mogelijk maakt om snel vullen en legen van oplossingen. Tenslotte, terwijl de sub-fysiologische experimentele temperaturen zoals 15 ° C gewoonlijk gebruikt om de reproduceerbaarheid van de mechanische metingen 1,2,3,5,8,12,17,27 verbeteren, is het mogelijk om geldige gegevens bij andere temperaturen 23 genereren , 28 zolang de effecten van temperatuur op oplossingseigenschappen (calciumconcentratie, pH, etc.) worden in aanmerking genomen. </p&gt; De samenstellingen van de testoplossingen tot de meest kritische aspecten van de gepermeabiliseerde glasvezeltechnieken beschreven. Overwegingen met betrekking tot oplossing samenstelling zijn complex en buiten het bestek van dit artikel. De in stap 5 van het gedeelte protocol beschreven oplossingen zijn ontwikkeld met de nadruk op snelle activering van de gepermeabiliseerde vezel bij de overdracht van pre-activerende activerende oplossingen terwijl een constante ionsterkte, kationische samenstelling en osmolariteit 6,29. Andere benaderingen om de oplossing samenstelling zijn gebruikt met opmerkelijk succes door andere onderzoeksgroepen en maken doorgaans gebruik van gepubliceerde bindingsconstanten en computationele gereedschappen 27,30,31. De concentratie van calciumionen in de verschillende activerende oplossing is bijzonder belangrijk in studies met submaximale activatie zoals geforceerd pCa evaluaties. Voor experimenten waarbij vezels volledig zijn geactiveerd, zoals beschrevend hier, de calciumconcentratie in de activerende oplossing meestal overschrijdt door een comfortabele marge die nodig zijn om maximale kracht te bereiken, waardoor de precieze kennis minder kritisch. Toevoeging van creatinefosfaat is belangrijk voor het bufferen van de intramyofibrillar ATP en ADP schommelingen die anders zouden worden gekoppeld contractiele activiteit. Creatine kinase is vereist om de overdracht van fosfaat creatinefosfaat ADP tot katalyseren. Onder experimentele omstandigheden die leiden tot hoge turnover ATP, waaronder het werken bij hoge temperaturen of meten high-speed verkorting in snelle vezels 32 moeten creatine kinase worden toegevoegd aan de oplossing van het endogene creatine kinase die gebonden aan de vezel blijft vullen. Voor minder veeleisende experimentele omstandigheden, de ATP regeneratiesysteem minder kritisch 27. Beperkingen van de gepermeabiliseerde enkele vezel techniek zijn de volgende. De door deze testen data hier decontractiele eigenschappen van de specifieke myofibrillar gedeelte dat is bevestigd aan de experimentele apparatuur. Bijgevolg is dit slechts een relatief klein deel van de gehele veelkernige vezel waaruit het segment werd verkregen die op zijn beurt slechts een klein deel van het totale aantal vezels in de spier. Onderzoekers moeten dus zorgvuldig overwegen de vereiste bemonstering om conclusies getrokken uit de experimenten te ondersteunen. Bovendien, het evalueren van de impact van een oefening training tussenkomst fiber functie veronderstelt dat de geëvalueerde vezels inderdaad werden geworven tijdens de training. Hoewel het protocol probeert de natuurlijke intracellulaire milieu van de vezels na te bootsen, het sarcolemma permeabilisatie werkwijze non-specifiek en noodzakelijk maakt oplosbare intracellulaire bestanddelen vrij diffunderen in de badende oplossing. Een ander gevolg van het membraan permeabiliteit is een verandering in de osmotische balans blijkt uit een zwelling vezelvolume 33. Defiber zwelling vergroot de afstand tussen actine en myosine filamenten resulteert in verminderde calcium gevoeligheid van het systeem myofilament 34,35, maar kan door de invoering van grote, osmotisch actieve verbindingen 34. Een laatste beperking te onderzoeken is het gevolg van de gebruikte techniek om vezels hechten aan de experimentele apparatuur. Dit vereist steevast verstoring van de ruimtelijke relatie binnen het filament systeem en in de buurt van de bevestigingspunten, met het bijwonen van functionele tekorten. Specifiek worden de gebieden van de vezel op en nabij de bevestigingspunten functioneel aangetast en daardoor bijdragen kunstmatig series elasticiteit van het meetsysteem. Samengevat, hebben we een middel om de kracht genererende capaciteit van chemisch permeabel skeletspier vezels in vitro evalueren beschreven. Hoewel de focus van dit artikel is op de beoordeling van de maximale isometrische kracht generating capaciteit van humane skeletspier vezels, kan de experimentele benadering worden aangepast en uitgebreid tot verschillende kinetische parameters en relaties vaststellen tussen verschillende species, zoogdier- of anderszins.

De primaire functie van skeletspier te dwingen te genereren. Spierkracht wordt opgewekt in vivo door middel van een complexe opeenvolging van gebeurtenissen die motorische zenuw actiepotentialen, neuromusculaire transmissie, spiervezels actiepotentialen, vrijkomen van intracellulaire calcium, en activering van het systeem van regelgeving en contractiele eiwitten bevat. Omdat force generation is het eindresultaat van deze sequentie kan een tekort kracht veroorzaakt door het falen van een of meer van de stappen. Een belangrijk kenmerk van de gepermeabiliseerde vezel voorbereiding is dat het elimineert de meeste van de stappen die nodig zijn voor de troepenmacht in vivo, met alleen de regelgeving en contractiele functies in verband met de myofibrillaire apparaat resterende. De onderzoeker neemt controle over de levering van het activeren van calcium en energie (ATP), en wordt beloond met een vereenvoudigd systeem dat de beoordeling van de geïsoleerde regulerende en contractiele structuren mogelijk in hun eigen configuration. Metingen van kracht met behulp van gepermeabiliseerde skeletspieren vezels zijn dus waardevol bij de beoordeling van veranderingen in spierfunctie waargenomen in vivo. Zo hebben we deze techniek gebruikt om de kracht vermogen van vezels karakteriseren van myostatine deficiënte muizen 1 en de oorzaak van aanhoudende spierzwakte vertoonden na chronische rotator cuff 2,3 beoordelen. Modern gepermeabiliseerd fiber methodologie kan worden herleid tot de vroege invloedrijke studies 4,5 en is momenteel in gebruik door een aantal onderzoeksgroepen. Hoewel de technieken beschreven in de literatuur, maar nog niet voorgesteld als video. Het doel van dit artikel is een bijgewerkte, valide en betrouwbare techniek illustreren voor het meten van de maximale kracht genererende capaciteit van enkele vezels van chemisch gepermeabiliseerde skeletspieren monsters. Om deze, een individuele vezels segment (hierin als aangeduid bereiken ̶0, fiber &#39;) wordt gewonnen uit een pre-gepermeabiliseerde bundel vezels en in een experimentele kamer die een ontspannen oplossing te kenmerken waarvan een calciumconcentratie die &lt;10 nM. De vezel wordt dan aan één einde aan een kracht-transducer en aan het andere uiteinde een lengte-controller bevestigd. Met de vezel gehouden op een optimale sarcomeerlengte, wordt overgebracht naar een activerende oplossing die een calciumconcentratie voldoende is om een ​​maximale activatie en hiermee maximale isometrische contractie kracht opwekken heeft. Force gegevens worden verkregen, opgeslagen en met behulp van een personal computer geanalyseerd.

<table><tbody><tr><td>Polystyreen kweekbuisje met dop</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml microcentrifuge met schroefdop</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml microcentrifuge doppen met o-ring</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox voor microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Niet-steriele hechtdraad 10-0 monofilament</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Insectenpins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectie schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Micrometeraandrijvingen</td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Waterbadcirculator&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Series 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW-software</td><td>National Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Gevarieerd</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kamersysteem</td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Lengte-regelaar</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Kracht-transducer</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>K-proprionaat</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull;6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (zuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull;0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (zuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (zuur)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCl (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull;4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 standaard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 standaard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd skeletal muscle vezels

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch ontdaan, of gepermeabiliseerde, skeletspiervezels biedt een krachtig middel om spierfunctie op het niveau van de enkele spiercel te beoordelen. Onderzoeken van enkele spiervezels zijn nuttig in zowel fundamentele wetenschap als klinische studies. Voor fundamentele studies maken contractiliteitsmetingen van enkele spiervezels onderzoek naar fundamentele mechanismen van krachtproductie mogelijk, en analyse van spierfunctie in de context van genetische manipulaties. Klinisch gezien bieden studies van enkele spiervezels nuttige inzichten in de impact van letsel en ziekte op spierfunctie, en kunnen ze worden gebruikt om het begrip van spierpathologieën te begeleiden. In dit videoartikel zetten we de stappen uiteen die nodig zijn om een individueel segment van een skeletspiervezel voor te bereiden en te isoleren, het te bevestigen aan een krachtmeetapparaat, het te activeren om maximale isometrische kracht te produceren, en de doorsnede ervan te schatten voor het normaliseren van de geproduceerde kracht.

Gezond, chemisch gepermeabiliseerd enkele vezels moet uniform verschijnen in vorm en hebben consistente strepen tussenruimte wanneer bekeken onder hoge vergroting. Vezels die niet flexibel zijn wanneer gemanipuleerd met de tang of hebben duidelijke structurele schade moet worden weggegooid. Sterke vergroting digitale beelden die in stap 15 geanalyseerd op 5 gepaarde metingen diameter over de buik van de vezel. Fiber CSA wordt geschat uitgaande van een elliptische dwarsdoorsnede en gemiddeld 5 afzonderlijke CSA metingen zoals in figuur 7A. Figuur 7B dient ook om te illustreren hoe vezels afmetingen in één oog significant verschillend kunnen zijn in vergelijking met gekoppelde afmetingen in de andere weergave (bijvoorbeeld, cross secties zijn in het algemeen niet, ronde). Representatieve force sporen van menselijk langzame en snelle vezels worden getoond in Figuren 8A en 8B respectievelijk. Voltage uitgang van de kracht- transducer wordt verkregen tijdens een test en omgezet kracht (mN) via data acquisitie en analyse software (LabVIEW). Figuur 9 illustreert de aanpak om maximale actieve kracht (Fo) bepalen, die wordt berekend door de kracht die nodig is om de vezel op optimale sarcomeer lengte te handhaven, terwijl in een ontspannen toestand (passieve kracht, F P), van de grootste isometrische kracht ontwikkeld tijdens maximale fiber activering (totale kracht, F T). Aangezien de uitgang van de kracht-transducer die overeenkomt met nul kracht, in het algemeen verschillend voor elk van de verschillende baden kamers we kort draai de vezel zowel in de pre-activering en activerende oplossingen voor de nul-krachtniveau in het vangen experimentele record. Normalisatie van maximale werkelijke kracht door CSA vezel wordt gebruikt om de meer informatieve waarde van de specifieke werking (SF o) te genereren. Omdat het rekening houdt met de CSA van de vezel, sF o </sub&gt; een maat voor de kracht intrinsieke vermogen van de vezel contractiele apparaat, waardoor functionele vergelijkingen tussen vezels van uiteenlopende afmetingen. Er zij evenwel op gewezen dat SMK metingen niet in staat de verhouding van de vezel bezet door contractiele filamenten versus het aandeel ingenomen door andere subcellulaire structuren onderscheiden. Typische kenmerken van gezonde volwassen vezels uit Claflin et al. 2011 10 menselijke, Mendias et al. 2011 1 voor muizen en Gumucio et al. 2012 2 van rat worden aangegeven in tabel 3. Alle gegevens in Tabel 3 werden gegenereerd door het gebruik technieken beschreven in dit artikel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Menselijk (Vastus lateralis) </strong&gt; </td><td> Muis (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rat (Infraspinatus) </td></tr><tr><td colspan="2"> Mannelijk </td><td colspan="2"> Vrouwelijk </td><td> Mannelijk </td><td> Mannelijk </td></tr><tr><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> (Niet getypt) </td><td> (Niet getypt) </td></tr><tr><td> CSA (2 pm) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (MN) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Typische kenmerken van een gezonde, volwassen vezels uit menselijke vastus lateralis 10, muis extensor digitorum longus 1 en rat infraspinatus 2 spieren. Optimal sarcomeer lengtes werden vastgesteld op 2,7 micrometer voor menselijke vezels 7,8 en 2,5 micrometer voor zowel de muis (36, 37) en rat vezels (38). Experimentele L f reeksen (25 ste en 75 ste kwartielen) waren 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm en 1,32-1,59 mm voor respectievelijk mens, muis en rat. Ranges getoond wijzen op de 25 de en 75 ste kwartiel en n is het aantal geteste vezels. De meest voorkomende problemen tijdens de test omvatten een hechtdraadlus slip, waardoor een kracht response een &quot;vangen&quot;, zoals afgebeeld in figuur 10A, en een gedeeltelijke of volledige dikte scheuren van de vezels, hetgeen resulteert in een kracht die terugkeert reactie abrupt naar of om (break) nul, terwijl de vezel wordt gedompeld in nog activerende oplossing (Figuur 10B). Als er tijdens een experiment een slip, scheur of breuk optreedt, moet de vezel worden weggegooid en uitgesloten van de gegevens, hoewel het handhaven van een record van vezels mislukkingen kunnen ook informatieve 11 zijn. Een andere negatieve uitkomst kunnen doorstaan ​​is de voortijdige activering van de vezel terwijl de pre-activerende oplossing (figuur 10C). Gedeeltelijke activering in de pre-activerende oplossing suggereert significante kruis-well contaminatie (dwz een onbedoelde toename van de calciumconcentratie in het pre-activerende well). In dit geval moeten alle baden worden opgezogen en goed gespoeld met gedemineraliseerd water. Het drogen van de delen oppervlakken tussen de kamers is ook recommended vocht of condens in deze gebieden kan leiden tot opzuigen van de oplossing tussen de baden. De beslissing te nemen of uit te sluiten data zal uiteindelijk afhangen van de experimentele focus en moet dus rekening worden gehouden bij het ontwerpen van de studie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figuur 1: Hechting lus (10-0 monofilament nylon hechtdraad). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figuur 2:. Bundle dissectie Forceps zijn in de linkerhand, microdissectie schaar zijn rechterhand. Rode lijn geeft de gunstige richting van de pols en schaar met de lengteassen van de vezels. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figuur 3: </strong&gt; (A) Testing apparaat met gelabelde onderdelen. (A) Experimentele kamers met transparante bodems. (B) Lengte-controller. (C) Force-transducer. (D) Lichtbron. (E) Lengte-controller xyz micrometer rijden met digitaal display. (F) Stage micrometer rijden met digitaal display. (G) Force-transducer xyz micrometer rijden. (H) Platform voor gekalibreerde laser-diffractie doelwit scherm. (I) Trillingsisolatie tafel. (B) Close-up van de experimentele kamers. (J) RVS bevestiging oppervlak dat zich uitstrekt van de lengte-controller. (K) Edelstaal bevestigingsoppervlak uitstrekt vanaf de kracht-transducer. (L) Side-view prisma. (M) Behuizing voor thermo-elektrische koeling modules. (N) thermokoppel voor het melden van kamer temperature. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figuur 4: Gewijzigde 100 ul pipet tip gebruikt om vezels uit dissectie gerecht over te dragen aan de experimentele kamer. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figuur 5:. Montage enkele vezel op experimentele apparaten (A) Prepared hechtdraad lussen geregen op roestvrij stalen bevestiging oppervlakken. (B) Fiber overgebracht naar experimentele kamer. (C) Fiber verankerd roestvaststalen bevestigingsvlakken door eerste paar hechtdraad lussen met overmaat hechtingen verwijderd. (D) Tweede paar lussen hechtdraad geregen over de bovenkant van eerste hechting loops en bond plaats. <img alt="Figuur 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figuur 6: sarcomeer lengte wordt bepaald door de projectie van een laser interferentiepatroon op een geijkte doelwit scherm (a) Laser bron.. (B) Spiegel. (C) Target scherm. (D) Laser interferentiepatroon. <img alt="Figuur 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figuur 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figuur 7: (A) Bepaling van de vezel dwarsdoorsnede met optimale sarcomeerlengte (humaan = 2,7 pm). Uitgaande van een elliptische doorsnede, CSA wordt berekend voor elke vijf plaatsen langs de vezel middensectie en het gemiddelde van de vijf individuele metingen wordt gerapporteerd als vezel CSA. 2a vertegenwoordigt bovenaanzicht diameter en is<html> een as van de ellips, 2b zijaanzicht diameter en de andere as van de ellips. (B) Representatieve vezel beelden illustreren elk van de vijf genoemde metingen diameter die in de boven- en zijaanzicht. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figuur 8: Vertegenwoordiger van kracht sporen uit gezonde menselijke vastus lateralis spiervezels (A) Type 1 vezel (CSA: 5710 um 2, F o: 0,89 mN en SF o: 156 kPa).. (B) Type 2a vezel (CSA: 9510 um 2, F o: 1,66 mN en SF o: 174 kPa). Fiber myosine zware keten soort werd bepaald door middel van elektroforetische scheiding en zilver-kleuring technieken 22. OAD / 52.695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figuur 9: Berekening van maximale actieve kracht (F o) (a) uitgebreide weergave van vezels kracht respons tijdens slappe-inducerende beweging van lengte-controller gestart in pre-activerende oplossing.. F P is de vereiste kracht sarcomeer lengte van 2,7 urn met de vezel in rust houden. (B) uitgebreide weergave van de lengte-controller-slap inducerende beweging. Merk op dat F o = F T - F P. <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figuur 10: (A) hechtdraadlus slip, blijkt uit een &quot;vangen&quot; van kracht trace tijdens de opkomst van geweld. Controleer of loops veilig zijn voor het activeren van de vezel. (B) Fiber pauze tijdens activering. Kan als gevolg van slechte fiber integriteit of agressieve vezels behandeling tijdens hechtdraadlus plaatsment. (C) Premature partiële vezels geactiveerd door een besmetting van pre-activeringskamer met Ca2 +.

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch huid of doorlaatbaar gemaakt, skeletspier vezels een krachtig middel om spierfunctie beoordeeld op het niveau van de interne spiercel. In dit artikel schetsen we een valide en betrouwbare techniek bereid en getest doorlaatbaar skeletspier vezels in vitro.

Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Het algemene doel van deze procedure is om de maximale isometrische krachtgenererende capaciteit van individuele vezels uit chemisch permeabiliseerde skeletspierstalen te meten. Dit wordt bereikt door de membranen van de spiervezels eerst bloot te stellen aan een chemisch detergent, waardoor de barrière tussen de extracellulaire en intracellulaire inhoud wordt verwijderd. De tweede stap is het extraheren van een individuele vezel uit een klein vezelbundeltje en het bevestigen hiervan aan de experimentele opstelling.Vervolgens worden laserinterferentiepatronen gebruikt om de optimale sarcomeerlengte voor de individuele vezel in te stellen. Ten slotte wordt calcium toegediend om de maximale isometrische contractiekracht op te wekken. Uiteindelijk maakt de perme-single-fiber-techniek een beoordeling mogelijk van de contractiele eigenschappen van skeletspieren zonder de complexiteit die gepaard gaat met de architectuur van de gehele spier.Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de belangrijkste stappen voor het succesvol uitvoeren van het protocol moeilijk aan te leren kunnen zijn. Begin met het bereiden van de dissectie-, bewaar- en testoplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik vervolgens een pincet om hechttussenlussen te maken van draden USP 10 zero monofilament nylon hechtdraad.Bereid met de double overhand knot-techniek vier lussen voor voor elke vezel die getest zal worden. Plaats de knoop na vorming onder een microscoop en verklein deze tot een diameter van ongeveer 750 micrometer, waarbij de IPS GTI-markeringen als leidraad dienen.Trim vervolgens het overtollige hechtmateriaal weg, zodat alleen de lus en kleine staartjes van 500 micrometer aan weerszijden overblijven. Breng een kleine hoeveelheid spierweefsel, verkregen via een open of naaldbiopsie, over naar een schaaltje met gekoelde dissectie-oplossing en voeg meer dissectie-oplossing toe om te zorgen dat het weefsel ondergedompeld blijft. Inspecteer het monster onder de microscoop en manipuleer het zodat de longitudinale as van de vezels is uitgelijnd in de richting van de rechterschouder van de onderzoeker.Veranker vervolgens het monster aan de schaal door het in de hoeken vast te zetten met de pincet in de linkerhand en de microschaar in de rechterhand. Begin voorzichtig met het dissekeren van een bundel langs de longitudinale randen tussen de vezels. Verwijder en gooi al het weefsel weg dat beschadigd is door de pincet of spelden.Breng na het dissectieproces de bundels over van de dissectie-oplossing naar een flacon van drie milliliter die 2,5 milliliter verse, gekoelde dissectie-oplossing bevat waaraan een niet-ionisch detergent is toegevoegd. Incubeer het monster 30 minuten op ijs onder af en toe voorzichtig schudden en zorg ervoor dat de bundels gedurende de gehele incubatie ondergedompeld blijven. Breng de bundels vervolgens over naar een flacon met verse dissectie-oplossing en schud voorzichtig en kort om alle resterende detergent te verwijderen.Nadat ze zijn gespoeld, brengt u de bundels over naar een vial met gekoelde bewaaroplossing en incubeert u deze een nacht bij vier graden Celsius. Haal de volgende dag de vial uit de bewaarruimte bij vier graden Celsius en breng alle bundels over naar een medicijnbekertje of een dissectieschaaltje. Ter voorbereiding op de opslag brengt u de bundels over naar individueel gelabelde cryovials, gevuld met 200 tot 400 µL verse bewaaroplossing, en zorgt u ervoor dat de bundel niet aan de wand van de buis kleeft of op het oppervlak drijft.Sluit de buis vervolgens af met een dop en bewaar het monster bij -80 °C. Stel een experimentele opstelling in zoals hier getoond en beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Vul vervolgens de eerste experimentele kamer met relaxeeroplossing, de tweede kamer met pre-reactiveringsoplossing en de derde met activeringsoplossing.Stel de temperatuur in de kamer in tot deze stabiel is op 15 graden Celsius terwijl de apparatuur zich in de relaxerende oplossing bevindt. Rijg twee van de voorbereide hechtinglussen door de roestvrijstalen bevestigingsvlakken die uitsteken vanuit zowel de krachttransducer als de lengtecontroller. Ontdooi vervolgens een vezelbundel van belang gedurende ongeveer 15 minuten op ijs en breng deze daarna over naar een met silicone elastomeer gecoate Petrischaal gevuld met verse, gekoelde relaxerende oplossing.Zet het bundeltje vast met pinnen aan beide uiteinden en zorg ervoor dat het ondergedompeld is met behulp van de pincet. Pak aan één uiteinde een vezel vast en begin deze geleidelijk langs de longitudinale as uit te trekken. Er moet voorzichtig worden gewerkt bij het extraheren van vezels uit het bundeltje, aangezien adhesies tussen de vezels en de extracellulaire matrix kunnen leiden tot overmatige spanning, wat uiteindelijk kan resulteren in rekgerelateerde schade.Zodra de vezel is geëxtraheerd, wordt deze samen met een kleine hoeveelheid relaxeeroplossing in een aangepaste pipetpunt geplaatst en voorzichtig met de pincet overgebracht naar de experimentele kamer die de relaxeeroplossing bevat. Verwijder de vezel uit de pipetpunt en bevestig deze aan de lengtecontroller. Manipuleer met de eerste hechtnadenlus het andere uiteinde van de vezel richting de krachttransducer en zet de vezel vast met dezelfde procedure.Verwijder overtollig hechtdraad met de micro-dissectieschaar. Rijg vervolgens de tweede lus over de eerste en veranker de vezel op een punt binnen 0,2 millimeters van het uiteinde van het bevestigingsoppervlak van de lengtecontroller. Herhaal dit met de tweede lus aan het uiteinde van de vezel bij de krachttransducer.Pas de positie van de lengtecontroller aan in de richting van de Y-as om de vezel parallel aan de zijwanden van de experimentele kamer te richten. Controleer vervolgens de vezel via het zijzicht van het prisma en pas de positie van de lengtecontroller aan in de richting van de Z-as totdat de vezel parallel aan de bodem van de kamer ligt. Als de vezel op enige wijze beschadigd is, moet deze worden weggegooid en een nieuwe vezel worden bevestigd.Zet de laser aan en stel de positie van de tafel zodanig in dat de laser door het midden van de vezel gaat. Stel vervolgens de sarcomeerlengte in door de spanning op de vezel te verhogen of te verlagen met de micrometerdriver van de x-as van de lengtecontroller, totdat de gewenste afstand tussen het afgebogen licht op het doelscherm wordt waargenomen. Nadat de optimale sarcomeerlengte is ingesteld, wordt de afstand tussen de twee binnenste hechtingen gemeten.Positioneer de kamer zodanig dat het verticale kruisdraad van het oculair is uitgelijnd met de binnenste rand van één interne hechting en zet deze op nul. De digitale readout op de micrometeraandrijving verplaatst de tafel langs de x-as ten opzichte van de microscoop totdat het verticale kruisdraad van het oculair is uitgelijnd met de binnenste hechting. Het digitale display geeft de lengte van de vezel aan; houd de vezel op de gemeten lengte en gebruik de op de microscoop gemonteerde camera om een afbeelding met hoge vergroting van het centrale deel van de vezel te maken, zowel vanuit bovenaanzicht als zijaanzicht.Gebruik deze afbeeldingen om de dwarsdoorsnede van de vezel te berekenen. Gebruik de software voor de kamerbesturing om de vezel naar de kamer met de pre-activerende oplossing te verplaatsen en incubeer deze daar gedurende drie minuten. Terwijl de vezel zich in de inactiverende oplossing bevindt, wordt de passieve spanning gemeten; verplaats de vezel vervolgens naar de kamer met de activerende oplossing en laat de maximale isometrische kracht zich ontwikkelen, wat blijkt uit een plateau in de kracht dat wordt voorafgegaan door een snelle stijging.Gebruik vervolgens de lengtecontroller om een grote, snelle en korte afname van de afstand tussen de bevestigingspunten van de vezel toe te passen, gevolgd door een snelle terugkeer naar de oorspronkelijke lengte om de output van de krachttransducer te identificeren die overeenkomt met nul. De getoonde kracht is zowel het bovenaanzicht als het zijaanzicht van een elliptisch gevormde vezel vanuit deze perspectieven. De dwarsdoorsnede werd bepaald door de diameters op vijf punten langs de lengte van de vezel te meten en vervolgens het gemiddelde van de vijf resulterende oppervlakten te berekenen.Krachtmetingen van menselijke, langzame en snelle spiervezels illustreren, met behulp van de in deze video getoonde techniek, dat snelle vezels kracht genereren met een hogere snelheid dan langzame vezels. De typische kenmerken van menselijke, muis- en ratspiervezels zijn gemeten en worden hier gepresenteerd. Het getoonde bereik geeft het 25ste tot 75ste kwartiel aan en de N is het aantal geteste vezels.Let op de grote variatie in specifieke kracht tussen de verschillende soorten. De hier beschreven procedures maken het mogelijk om de maximale intrinsieke krachtgenererende capaciteit van een enkele skeletspiervezel te beoordelen door aanvullende interventies toe te voegen, wat belangrijke aspecten van de skeletspierfysiologie onthult, waaronder onder andere de relaties tussen lengte-kracht, kracht-snelheid en kracht-calcium.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze video toont modulatie van de reflex-activiteit, volitionele kracht en het lopen door middel van klinische en kwantitatieve beoordeling bij personen met motorische incomplete dwarslaesie als gevolg van een acute orale toediening van een serotonine heropname remmers (SSRI's).

Methoden om Farmacologisch geïnduceerde veranderingen in Motor Function te kwantificeren in Human Incomplete SCI

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Deze video toont de chirurgische voorbereiding en procedures die nodig zijn om de contractiele responsen van de rat mediale gastrocnemius spier voorbereiding...

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype...

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

We presenteren een protocol om veranderingen in de neuromusculaire functie te beoordelen. Percutane elektrische zenuwstimulatie is een niet-invasieve methode die spierreacties veroorzaakt. Elektrofysiologische en mechanische eigenschappen van deze reacties maken de evaluatie van de neuromusculaire functie mogelijk, van hersenen tot spier (supra-spinaal, spinaal en perifeer niveau).

Bepaling van neuromusculaire functie gebruiken percutane elektrische zenuwstimulatie

We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Evaluatie van motorisch herstel blijft de benchmark uitkomstmaat in experimentele perifere zenuwstudies. De isometrische tetanische krachtmeting van de tibialis voorste spier in de rat is een onschatbaar hulpmiddel om functionele resultaten na reconstructie van ischiaszenuwdefecten te beoordelen. De methoden en nuances worden in dit artikel beschreven.

Maximale isometrische tetanische krachtmeting van de Tibialis-voorste spier in de rat

Het huidige protocol beschrijft beknopte experimentele details over de evaluatie en interpretatie van in vivo koppelgegevens verkregen via elektrische stimulatie van de gemeenschappelijke peroneuszenuw bij verdoofde varkens.

In vivo Meting van Hindlimb Dorsiflexor Isometrisch koppel van varken

Leer de maximale isometrische krachtmeting van gepermeabiliseerde skeletspiervezels met behulp van laserinterferentie en calciumstimulatie. Deze methode biedt inzicht in spiercontractie zonder de complexiteit van intacte spieren.

Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Meer video's verkennen