Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Het algemene doel van deze procedure is om de maximale isometrische krachtgenererende capaciteit van individuele vezels uit chemisch permeabiliseerde skeletspierstalen te meten. Dit wordt bereikt door de membranen van de spiervezels eerst bloot te stellen aan een chemisch detergent, waardoor de barrière tussen de extracellulaire en intracellulaire inhoud wordt verwijderd. De tweede stap is het extraheren van een individuele vezel uit een klein vezelbundeltje en het bevestigen hiervan aan de experimentele opstelling.

Vervolgens worden laserinterferentiepatronen gebruikt om de optimale sarcomeerlengte voor de individuele vezel in te stellen. Ten slotte wordt calcium toegediend om de maximale isometrische contractiekracht op te wekken. Uiteindelijk maakt de perme-single-fiber-techniek een beoordeling mogelijk van de contractiele eigenschappen van skeletspieren zonder de complexiteit die gepaard gaat met de architectuur van de gehele spier.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de belangrijkste stappen voor het succesvol uitvoeren van het protocol moeilijk aan te leren kunnen zijn. Begin met het bereiden van de dissectie-, bewaar- en testoplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik vervolgens een pincet om hechttussenlussen te maken van draden USP 10 zero monofilament nylon hechtdraad.

Bereid met de double overhand knot-techniek vier lussen voor voor elke vezel die getest zal worden. Plaats de knoop na vorming onder een microscoop en verklein deze tot een diameter van ongeveer 750 micrometer, waarbij de IPS GTI-markeringen als leidraad dienen.

Trim vervolgens het overtollige hechtmateriaal weg, zodat alleen de lus en kleine staartjes van 500 micrometer aan weerszijden overblijven. Breng een kleine hoeveelheid spierweefsel, verkregen via een open of naaldbiopsie, over naar een schaaltje met gekoelde dissectie-oplossing en voeg meer dissectie-oplossing toe om te zorgen dat het weefsel ondergedompeld blijft. Inspecteer het monster onder de microscoop en manipuleer het zodat de longitudinale as van de vezels is uitgelijnd in de richting van de rechterschouder van de onderzoeker.

Veranker vervolgens het monster aan de schaal door het in de hoeken vast te zetten met de pincet in de linkerhand en de microschaar in de rechterhand. Begin voorzichtig met het dissekeren van een bundel langs de longitudinale randen tussen de vezels. Verwijder en gooi al het weefsel weg dat beschadigd is door de pincet of spelden.

Breng na het dissectieproces de bundels over van de dissectie-oplossing naar een flacon van drie milliliter die 2,5 milliliter verse, gekoelde dissectie-oplossing bevat waaraan een niet-ionisch detergent is toegevoegd. Incubeer het monster 30 minuten op ijs onder af en toe voorzichtig schudden en zorg ervoor dat de bundels gedurende de gehele incubatie ondergedompeld blijven. Breng de bundels vervolgens over naar een flacon met verse dissectie-oplossing en schud voorzichtig en kort om alle resterende detergent te verwijderen.

Nadat ze zijn gespoeld, brengt u de bundels over naar een vial met gekoelde bewaaroplossing en incubeert u deze een nacht bij vier graden Celsius. Haal de volgende dag de vial uit de bewaarruimte bij vier graden Celsius en breng alle bundels over naar een medicijnbekertje of een dissectieschaaltje. Ter voorbereiding op de opslag brengt u de bundels over naar individueel gelabelde cryovials, gevuld met 200 tot 400 µL verse bewaaroplossing, en zorgt u ervoor dat de bundel niet aan de wand van de buis kleeft of op het oppervlak drijft.

Sluit de buis vervolgens af met een dop en bewaar het monster bij -80 °C. Stel een experimentele opstelling in zoals hier getoond en beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Vul vervolgens de eerste experimentele kamer met relaxeeroplossing, de tweede kamer met pre-reactiveringsoplossing en de derde met activeringsoplossing.

Stel de temperatuur in de kamer in tot deze stabiel is op 15 graden Celsius terwijl de apparatuur zich in de relaxerende oplossing bevindt. Rijg twee van de voorbereide hechtinglussen door de roestvrijstalen bevestigingsvlakken die uitsteken vanuit zowel de krachttransducer als de lengtecontroller. Ontdooi vervolgens een vezelbundel van belang gedurende ongeveer 15 minuten op ijs en breng deze daarna over naar een met silicone elastomeer gecoate Petrischaal gevuld met verse, gekoelde relaxerende oplossing.

Zet het bundeltje vast met pinnen aan beide uiteinden en zorg ervoor dat het ondergedompeld is met behulp van de pincet. Pak aan één uiteinde een vezel vast en begin deze geleidelijk langs de longitudinale as uit te trekken. Er moet voorzichtig worden gewerkt bij het extraheren van vezels uit het bundeltje, aangezien adhesies tussen de vezels en de extracellulaire matrix kunnen leiden tot overmatige spanning, wat uiteindelijk kan resulteren in rekgerelateerde schade.

Zodra de vezel is geëxtraheerd, wordt deze samen met een kleine hoeveelheid relaxeeroplossing in een aangepaste pipetpunt geplaatst en voorzichtig met de pincet overgebracht naar de experimentele kamer die de relaxeeroplossing bevat. Verwijder de vezel uit de pipetpunt en bevestig deze aan de lengtecontroller. Manipuleer met de eerste hechtnadenlus het andere uiteinde van de vezel richting de krachttransducer en zet de vezel vast met dezelfde procedure.

Verwijder overtollig hechtdraad met de micro-dissectieschaar. Rijg vervolgens de tweede lus over de eerste en veranker de vezel op een punt binnen 0,2 millimeters van het uiteinde van het bevestigingsoppervlak van de lengtecontroller. Herhaal dit met de tweede lus aan het uiteinde van de vezel bij de krachttransducer.

Pas de positie van de lengtecontroller aan in de richting van de Y-as om de vezel parallel aan de zijwanden van de experimentele kamer te richten. Controleer vervolgens de vezel via het zijzicht van het prisma en pas de positie van de lengtecontroller aan in de richting van de Z-as totdat de vezel parallel aan de bodem van de kamer ligt. Als de vezel op enige wijze beschadigd is, moet deze worden weggegooid en een nieuwe vezel worden bevestigd.

Zet de laser aan en stel de positie van de tafel zodanig in dat de laser door het midden van de vezel gaat. Stel vervolgens de sarcomeerlengte in door de spanning op de vezel te verhogen of te verlagen met de micrometerdriver van de x-as van de lengtecontroller, totdat de gewenste afstand tussen het afgebogen licht op het doelscherm wordt waargenomen. Nadat de optimale sarcomeerlengte is ingesteld, wordt de afstand tussen de twee binnenste hechtingen gemeten.

Positioneer de kamer zodanig dat het verticale kruisdraad van het oculair is uitgelijnd met de binnenste rand van één interne hechting en zet deze op nul. De digitale readout op de micrometeraandrijving verplaatst de tafel langs de x-as ten opzichte van de microscoop totdat het verticale kruisdraad van het oculair is uitgelijnd met de binnenste hechting. Het digitale display geeft de lengte van de vezel aan; houd de vezel op de gemeten lengte en gebruik de op de microscoop gemonteerde camera om een afbeelding met hoge vergroting van het centrale deel van de vezel te maken, zowel vanuit bovenaanzicht als zijaanzicht.

Gebruik deze afbeeldingen om de dwarsdoorsnede van de vezel te berekenen. Gebruik de software voor de kamerbesturing om de vezel naar de kamer met de pre-activerende oplossing te verplaatsen en incubeer deze daar gedurende drie minuten. Terwijl de vezel zich in de inactiverende oplossing bevindt, wordt de passieve spanning gemeten; verplaats de vezel vervolgens naar de kamer met de activerende oplossing en laat de maximale isometrische kracht zich ontwikkelen, wat blijkt uit een plateau in de kracht dat wordt voorafgegaan door een snelle stijging.

Gebruik vervolgens de lengtecontroller om een grote, snelle en korte afname van de afstand tussen de bevestigingspunten van de vezel toe te passen, gevolgd door een snelle terugkeer naar de oorspronkelijke lengte om de output van de krachttransducer te identificeren die overeenkomt met nul. De getoonde kracht is zowel het bovenaanzicht als het zijaanzicht van een elliptisch gevormde vezel vanuit deze perspectieven. De dwarsdoorsnede werd bepaald door de diameters op vijf punten langs de lengte van de vezel te meten en vervolgens het gemiddelde van de vijf resulterende oppervlakten te berekenen.

Krachtmetingen van menselijke, langzame en snelle spiervezels illustreren, met behulp van de in deze video getoonde techniek, dat snelle vezels kracht genereren met een hogere snelheid dan langzame vezels. De typische kenmerken van menselijke, muis- en ratspiervezels zijn gemeten en worden hier gepresenteerd. Het getoonde bereik geeft het 25ste tot 75ste kwartiel aan en de N is het aantal geteste vezels.

Let op de grote variatie in specifieke kracht tussen de verschillende soorten. De hier beschreven procedures maken het mogelijk om de maximale intrinsieke krachtgenererende capaciteit van een enkele skeletspiervezel te beoordelen door aanvullende interventies toe te voegen, wat belangrijke aspecten van de skeletspierfysiologie onthult, waaronder onder andere de relaties tussen lengte-kracht, kracht-snelheid en kracht-calcium.