Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Het algemene doel van deze procedure is om de maximale isometrische krachtgenererende capaciteit van individuele vezels van chemisch doorlaatbare skeletsystelmonsters te meten. Dit wordt bereikt door eerst de spiervezelmembranen bloot te stellen aan een chemisch detergent, waardoor de barrière tussen extracellulaire en intracellulaire inhoud wordt verwijderd. De tweede stap is om een individuele vezel uit een klein bundeltje vezels te extraheren en deze aan het experimentele apparaat te bevestigen.

Vervolgens worden laserinterferentiepatronen gebruikt om de optimale sarcomeerlengte voor de individuele vezel in te stellen. Ten slotte wordt calcium toegediend om maximale isometrische contractiekracht op te roepen. Uiteindelijk biedt de doorlaatbare enkele vezeltechniek een beoordeling van de contractiele eigenschappen van skeletspier zonder de complexiteiten die gepaard gaan met de hele spierarchitectuur.

Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat de belangrijkste stappen voor het succesvol uitvoeren van het protocol moeilijk te leren kunnen zijn. Begin met het voorbereiden van de dissectie-, opslag- en testoplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik vervolgens pincetten om sutuurlussen voor te bereiden uit strengen USP 10 nul monofilament nylonsutuur.

Gebruik de dubbele overhandse knooptechniek om vier lussen voor te bereiden voor elke vezel die getest moet worden. Eenmaal gevormd, plaats de knoop onder een microscoop en verkleint u deze tot ongeveer 750 micrometer diameter. Gebruik de IPS GTI-markeringen als richtlijn.

Trim vervolgens eventuele overtollige sutuur, waardoor alleen de lus en kleine 500 micrometer staarten aan weerszijden overblijven. Breng een kleine massa spierweefsel verkregen via open of naaldbiopsie over naar een schaal met gekoelde dissectieoplossing en voeg meer dissectieoplossing toe om ervoor te zorgen dat het weefsel ondergedompeld blijft. Inspecteer het monster onder de microscoop en manipuleer om de longitudinale as van de vezels naar de rechterschouder van de onderzoeker uit te lijnen.

Vervolgens verankert u het monster aan de schaal door het op de hoeken te prikken met de pincetten in de linkerhand en de microdissectiescharen in de rechterhand. Begin voorzichtig een bundel te dissecteren langs de longitudinale randen tussen vezels. Verwijder en gooi eventueel beschadigd weefsel weg dat beschadigd is door de pincetten of pinnen.

Als resultaat van het dissectieproces, breng de bundels over van de dissectieoplossing in een drie milliliter flesje met 2,5 milliliter verse gekoelde dissectieoplossing met een niet-ionische detergent toegevoegd. Incubeer het monster 30 minuten op ijs met occasionele zachte agitatie en zorg ervoor dat de bundels gedurende de gehele incubatie ondergedompeld blijven. Breng vervolgens de bundels over naar een flesje met verse dissectieoplossing en agiteer kort en lichtjes om eventueel resterend detergent te verwijderen.

Eenmaal gespoeld, breng de bundels over naar een flesje met gekoelde opslagoplossing en incubeer een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag verwijdert u de fles uit de opslag bij vier graden Celsius en brengt u alle bundels over naar een medicijnbeker of dissectieschaal. Ter voorbereiding op opslag, brengt u de bundels over in afzonderlijk gelabelde cryobuisjes, gevuld met 200 tot 400 microliter verse opslagoplossing, en zorg ervoor dat de bundel niet aan de zijkant van de buis blijft plakken of op het oppervlak drijft.

Sluit vervolgens de buis en bewaar het monster bij min 80 graden Celsius. Stel een experimenteel apparaat in zoals hier getoond en beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Vul vervolgens de eerste experimentele kamer met ontspanningsoplossing, de tweede kamer met pre-reactiveringsoplossing en de derde met activeringsoplossing.

Stel de temperatuur in de kamer in totdat deze stabiel is op 15 graden Celsius met het apparaat in de ontspanningsoplossing. Draad twee van de voorbereide sutuurlussen op de roestvrijstalen bevestigingsoppervlakken die zich uitstrekken van zowel de krachttransducer als de lengteregelaar. Ontdooi vervolgens een bundel vezels van belang op ijs gedurende ongeveer 15 minuten en breng het vervolgens over naar een siliconen elastomeer geplateerde petrischaal gevuld met verse, gekoelde ontspanningsoplossing.

Bevestig de bundel op zijn plaats met pinnen aan beide uiteinden en zorg ervoor dat deze ondergedompeld is met behulp van de pincetten. Pak een vezel aan het ene uiteinde vast en begin deze soepel langs de longitudinale as te extraheren. Wees voorzichtig bij het extraheren van vezels uit de bundel, aangezien hechtingen tussen de vezels en de extracellulaire matrix kunnen resulteren in overmatige spanning, wat uiteindelijk kan leiden tot door stretch veroorzaakte schade.

Eenmaal geëxtraheerd, breng de vezel samen met een kleine hoeveelheid ontspanningsoplossing in een gemodificeerde pijptip en breng deze over naar de experimentele kamer die de ontspanningsoplossing bevat door voorzichtig te geleiden met de pincetten. Verwijder de vezel van de pijptip en bevestig deze aan de lengteregelaar. Gebruik de eerste sutuurlus om het andere uiteinde van de vezel naar de krachttransducer te manipuleren en bevestig de vezel met behulp van dezelfde procedure.

Verwijder eventuele overtollige sutuur met behulp van de microdissectiescharen. Draai vervolgens de tweede lus over de eerste en bevestig de vezel op een punt binnen 0,2 millimeter van het uiteinde van de lengteregelaar bevestigingsoppervlak. Herhaal met de tweede lus aan het krachttransducer uiteinde van de vezel.

Stel de positie van de lengteregelaar in de richting van de Y-as in om de vezel parallel aan de zijwanden van de experimentele kamer uit te lijnen. Beoordeel vervolgens de vezel met behulp van de prisma zijkantweergave en stel de positie van de lengteregelaar in de richting van de Z-as in totdat de vezel parallel is aan de vloer van de kamer. Als de vezel op enigerlei wijze beschadigd is, moet de vezel worden weggegooid en moet een nieuwe vezel worden bevestigd.

Schakel de laser in en stel de positie van de tafel zo in dat de laser door het midden van de vezel passeert. Stel vervolgens de sarcomeerlengte in door de spanning op de vezel te verhogen of te verlagen met behulp van de lengte