Verwijdering van Trace Elements van Cupric Oxide Nanodeeltjes van Uranium In Situ Herstel Bleed Water en het effect op levensvatbaarheid van de cellen
21 juni 2015
Productie afvalwater (PBW) werd behandeld met cuprisch oxide nanodeeltjes (CuO-NP's) en cellulaire toxiciteit werd beoordeeld in gekweekte menselijke cellen. Het doel van dit protocol was om het native milieumonster te integreren in een celkweekformaat waarbij de veranderingen in toxiciteit als gevolg van CuO-NP behandeling werden beoordeeld.
Het algemene doel van deze procedure is om de behandeling met koperoxide nanodeeltjes te onderzoeken als een proces voor het verwijderen van verontreinigingen in productie-, afvoerwater en om de cytotoxiciteit ervan te evalueren met behulp van gekweekte menselijke cellen. Dit wordt bereikt door eerst productie-afvoerwater te behandelen met koperoxide nanodeeltjes. De concentratieveranderingen van individuele elementen worden voor en na de behandeling geëvalueerd.
Vervolgens wordt geconcentreerd celkweekmedium verdund met onbehandeld productie-afvoerwater of koperoxide. Nanodeeltje-behandeld productie-afvoerwater wordt in aanvulling op standaard celkweeksupplementen gebruikt om het testmedium te bereiden: onbehandeld productie-afvoerwater, watermedium en koperoxide, nanodeeltje-behandeld productie-afvoerwater. Het watermedium wordt vervolgens toegepast op menselijke nier- en levercellen en gekweekt, en de levensvatbaarheid wordt gedurende zeven dagen gemeten.
Uiteindelijk toont de M-T-T-S-A de verwijdering van arseen, selenium, vanadium en uranium uit productie. Het afvoeren van water door koperoxide nanodeeltjes wordt geassocieerd met een verhoogde levensvatbaarheid van menselijke nier- en levercellen. Dit is de eerste studie die de verwijdering van specifieke verontreinigingen onderzoekt met behulp van koperoxide nanodeeltjes terwijl de veranderingen in cytotoxiciteit geassocieerd met de verwijdering in een celkweekformaat worden beoordeeld.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het milieumonster zoals het in de natuur voorkomt, wordt getest naast de nanodeeltjes in een goedkope hydro-put-formaat. Koperoxide nanodeeltjes die in deze studie zijn getest, kunnen worden toegepast op andere grondwatersystemen, zoals drinkwater dat geassocieerd is met kleine gemeenschappen. De regeneratie van koperoxide nanodeeltjes veroorzaakt minder afval en minimaliseert afvalverwijderingsproblemen.
Om deze procedure te starten, bereidt u koperoxide nanodeeltjes voor en verzamelt u het productie-afvoerwater of PBW zoals beschreven in het tekstprotocol om PBW te behandelen met koperoxide nanodeeltjes bij 50 milligram van de bereide nanodeeltjes in een 50 milliliter conische buis, gevolgd door 50 milliliter PBW. Sluit de buis en reageer gedurende 30 minuten op een draaitafel orbitale shaker bij 250 RPM. Centrifugeer de monsterbuisjes bij 250 keer G gedurende 30 minuten. Pas de centrifugeersnelheid en tijd aan afhankelijk van het nanodeeltje om ervoor te zorgen dat de nanodeeltjes compact worden in de centrifugeerbuis. Na centrifugatie filtert u het supernatant met behulp van een 0,45 micron spuit. Filtermonsters worden vervolgens verzonden voor elementenanalyse. Om celkweekmedium te bereiden. Gebruik eerst RO-water vanuit het laboratorium.
Deze omvatten 100%75%50%en 25%onbehandeld PBW of CIC-oxide nanodeeltje-behandeld PBW. Vervolgens 25 milliliter geconcentreerd 10 X-E-M-E-M tot 190 milliliter van de ro. Evenals elk van de behandelde en onbehandelde PBW-concentraties. Pas de pH van elke oplossing aan op 7,4 met natriumhydroxide of zoutzuur.
Vervolgens suppleeert u elke concentratie onbehandeld en behandeld PBW plus medium, evenals het RO-controlemedium met standaardcomponenten die in het tekstprotocol zijn vermeld. Nadat elke concentratie onbehandeld, onbehandeld PBW plus medium, evenals RO-controlewater plus medium is gemaakt, wordt de osmolaliteit aangepast. Een druppel van elke oplossing wordt aangebracht op een oplossingsvrije papieren schijf en de schijf wordt geplaatst in een dampdruk OSM-ter.
De osmolaliteit wordt vervolgens aangepast tot tussen 290 en 310 milli osmolen per kilogram door RO-water toe te voegen. Filtreer tenslotte elke oplossing met behulp van een nulpunt 22 micron vacuümfilterunit en bewaar bij vier graden Celsius. Bereid een kweek van menselijke embryonale niercellen en menselijke hepatocellulair carcinoomcellen twee tot drie dagen voordat ze worden geplaatst.
In 96. Wel platen volgens de fabrikant en instructies nadat de cellen uit hun kweekschotel zijn verwijderd, gebruik trypsine, centrifugeer bij 1000 keer G gedurende vijf minuten en decanteer de trypsine. Voeg vijf milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS toe en meng de cellen om een enkele celoplossing te verkrijgen.
Breng vervolgens 20 microliter van de enkele celoplossing aan op een hemo cytometer om een celtelling per milliliter oplossing te verkrijgen na centrifugatie. Opnieuw, zoals eerder en decanteren, wordt de PBS gebruikt om de cellen te spoelen bij de juiste hoeveelheid van één X-E-M-E-M om de concentratie cellen aan te passen tot 500 cellen per 100 microliter per putje. Vul vervolgens de perimeterputjes van de plaat met 200 microliter PBS om te controleren op verdamping.
Plaats de cellen op een dichtheid van 500 cellen per putje, door 100 microliter toe te voegen aan elke putje, behalve de perimeterputjes. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius, zodat ze zich kunnen herstellen voordat baseline MTT-metingen van celdichtheid worden uitgevoerd.
Voer baseline MTT-metingen van celdichtheid uit door het zaaimedium uit de eerste kolom te verwijderen en 100 microliter MTT toe te voegen aan de putjes gedurende één uur. Na een uur. Verwijder de MTT en voeg 100 microliter dimethylsulfoxide toe om de MTT Informason op te lossen die door levensvatbare cellen wordt geproduceerd.
Lees vervolgens de optische dichtheid van de eerste kolom bij een absorptiegolflengte van 570 nanometer. Om een baseline-meting te verkrijgen, voegt u één oplossing per plaat toe. Vervang het zaaimedium met 100 microliter van één X-E-M-E-M RO-controlemedium, evenals elk van de behandelde en onbehandelde PPW plus mediaconcentraties.
Incubeer de cellen in hun testconcentraties of controleoplossingen gedurende een totaal van zeven dagen per dag. Na de baseline MTT-meting verwijdert u de controle- en testoplossingen uit de volgende kolom van hun respectieve plaat en herhaalt u het MTT-protocol. Herhaal het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de behandeling van productiebloedwater met behulp van koper(II)oxide-nanodeeltjes (CuO-NPs) en beoordeelt de cytotoxische effecten ervan op gekweekte menselijke cellen. Het onderzoek heeft tot doel de veranderingen in toxiciteit te evalueren die voortvloeien uit de behandeling met nanodeeltjes.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Milieuwetenschappen
- Celbiologie
- Nanotechnologie
Achtergrond
- Afvalwater uit de productie kan verontreinigingen bevatten die schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid.
- Koper(II)oxide-nanodeeltjes hebben potentiële toepassingen bij het verwijderen van verontreinigingen.
- Het beoordelen van de cytotoxiciteit is essentieel om de veiligheid van het gezuiverde water te begrijpen.
- Celcultuurmodellen bieden een gecontroleerde omgeving voor toxiciteitstesten.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van de behandeling met CuO-NP bij het verminderen van de toxiciteit in productie-spoelwater te evalueren.
- Om de cytotoxische effecten van het behandelde water op menselijke nier- en levercellen te beoordelen.
- Om concentratieveranderingen van elementen voor en na de behandeling te analyseren.
Gebruikte methoden
- Behandeling van productie-proceswater met CuO-NP's.
- Bereiding van testmedia met behulp van behandeld en onbehandeld water.
- Toepassing van media op gekweekte menselijke nier- en levercellen.
- Meting van de cellevensvatbaarheid over een periode van zeven dagen.
Belangrijkste resultaten
- Veranderingen in elementaire concentraties werden na de behandeling waargenomen.
- De celviabiliteit werd beoordeeld om cytotoxische effecten te bepalen.
- Behandeling met CuO-NP vertoonde uiteenlopende effecten op verschillende celtypen.
- De resultaten wijzen op het potentieel voor het gebruik van CuO-NP in toepassingen voor waterzuivering.
Conclusies
- Koper(II)oxide-nanodeeltjes kunnen de toxiciteit in productie-afvalwater effectief verminderen.
- De studie benadrukt het belang van het evalueren van de cytotoxiciteit in behandelde monsters.
- Verder onderzoek is nodig om de behandelingsprocessen te optimaliseren en de langetermijneffecten te beoordelen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze studie demonstreert een op nanodeeltjes gebaseerde benadering om de hoeveelheid verontreinigingen in industrieel afvalwater te verminderen, wat direct relevant is voor vroege targetvalidatie bij toxicologische screening. Door milieusanering te koppelen aan cellulaire uitkomsten, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie bij de selectie van preklinische modellen. De methode maakt voorspellende zekerheid mogelijk bij het beoordelen van de waterveiligheid voordat er blootstelling aan verbindingen plaatsvindt in celgebaseerde assays.
Strategische toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Evalueert de effectiviteit van de verwijdering van verontreinigingen met behulp van koperoxide-nanodeeltjes om arseen, selenium, uranium en vanadium in productiespoelwater te reduceren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van de MTT-assay in HEK 293- en Hep G2-cellen om veranderingen in de levensvatbaarheid te kwantificeren, wat een gestandaardiseerde uitlezing van de cytotoxiciteit oplevert.
- Voorspellende waarde: Koppelt een verbeterde cellevensvatbaarheid na behandeling aan een verminderde toxicastlast, wat hypothesetestings in pathways van milieu-toxines ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt testmedia voor met behandelde en onbehandelde bloedwater als vloeistofcomponenten in celkweek, waardoor screeningcondities voor specifieke verontreinigingen mogelijk worden.
- Operationele waarde: Stelt de pH in op 7.4 en de osmolaliteit op 290–310 mOsm/kg, wat de fysiologische compatibiliteit over assay-replica's waarborgt.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van orbital shaking op de werkbank en centrifugatie voor de behandeling van nanodeeltjes, wat de medium-throughput preparatie van testcondities ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Maakt gebruik van menselijke nier- en levercellijnen om orgaanspecifieke toxiciteit te modelleren, in overeenstemming met preklinische veiligheidsbeoordelingen.
- Mechanische risicoreductie: Toont aan dat behandeling met nanodeeltjes de verslechtering van de levensvatbaarheid die wordt gezien in onbehandeld bleed water omkeert, wat causale inferentie in het toxine-mechanisme ondersteunt.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Toont een concentratie-afhankelijke verbetering van de levensvatbaarheid aan, waardoor dosis-responsmodellering mogelijk wordt voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij milieuverontreinigingen verwijderd of gecontroleerd moeten worden vóór de screening van verbindingen, in het bijzonder bij toxiciteitsmodellen voor de lever en nieren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door het effect van de verwijdering van specifieke contaminanten op de celviabiliteit te isoleren, waardoor storende variabelen bij targetvalidatie worden verminderd.
- Screening: Genereert reproduceerbare testmedia met een gekwantificeerde reductie van contaminanten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen onder gestandaardiseerde omstandigheden mogelijk maakt.
- Analytics: Meet elementconcentraties (arseen, selenium, uranium, vanadium) vóór en na de behandeling, wat kwantitatieve input levert voor structuur-activiteits- of toxiciteitsmodellering.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt milieubehandeling met resultaten in menselijke cellen, wat de continuïteit ondersteunt van blootstellingsmodellering naar preklinische validatie.
- Enterprise Hergebruik: Het raamwerk kan worden aangepast aan andere grondwatersystemen, waardoor cross-project toepassing in toxicologische screeningplatforms mogelijk is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door de verwijdering van verontreinigingen te koppelen aan een verbeterde cellulaire functie in relevante menselijke cellijnen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van goedkope, regenereerbare koperoxide-nanodeeltjes, waardoor de reagenskosten en afvalproductie bij de bereiding van screeningsmedia worden verlaagd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door milieumatrices vooraf te screenen op cytotoxisch potentieel, waardoor uitval in een laat stadium door niet-gemodelleerde toxine-interacties wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen door ervoor te zorgen dat assaycondities niet worden beïnvloed door residuele toxicanten in verdunners.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in nanodeeltjessynthese, colloïdale stabiliteit en centrifugatiegebaseerde scheiding.
- Toegang tot elementanalyse (bijv. ICP-MS) is noodzakelijk om de efficiëntie van de verwijdering van verontreinigingen te valideren.
- Standaardisatie van de pH- en osmolaliteitsaanpassing over verschillende batches is vereist om de consistentie van de assay te behouden.
- Beperkt door verdunningseffecten wanneer bleed-water wordt gemengd met mediacomponenten, wat optimalisatie van de water-mediatratio's vereist.
- De effectiviteit is afhankelijk van de pH; de methode presteert het best in neutraal water, wat de directe toepassing op zuur bleed-water zonder voorbehandeling beperkt.
