Name: Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Leer een geoptimaliseerde negatieve geotaxis-assay in Drosophila melanogaster om klimdefecten te kwantificeren. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers genetische interacties en potentiële geneesmiddeldoelen voor neurodegeneratieve aandoeningen te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een Team Grant van het Canadian Health Research Institute (CIHR) aan Dr. Bolduc (co-PI) en Dr. Guy Rouleau (PI). We willen Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, de leden van de University of Alberta fly club en Dr. Clayton Dickson bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling van de methode en statistische analyse.

Onderzoek naar Drosophila melanogaster in overeenstemming was met de Universiteit van Alberta onderzoek richtlijnen. 1. Fly Collection <ol><li> Verzamel 20 vliegen met behulp van CO 2 (g) verdoving en plaats in een 25 mm x 95 mm verzameling flacon met voedsel. </li><li> Store flesjes met vliegt horizontaal om te voorkomen dat het vangen van vliegen in alle vloeistoffen die kunnen zich ophopen in de bodem van de flacon. </li><li> Incubeer vliegen gedurende ten minste 21 uur bij 22 ° C bij 45% vochtigheid in een incubator gedurende ongeveer 15 uur. Stel de incubator met een 12 uur licht: donker cyclus. </li></ol> 2. Climbing Assay <ol><li> De volgende ochtend, transfer 20 vliegt van één ampul in een 250 ml glazen maatcilinder. Markeer de positie van de cilinder te houden constant dagelijks. Gebruik een glazen cilinder per genotype om kruisbesmetting tussen de genotypen voorkomen. Wassen bij elke proef en rotate hen tussen genotypen. <ol><li> Het gedrag van de experimenten in omgevingslicht (of rood licht als er een potentieel defect in zicht) bij een temperatuur en vochtigheid van 22 ° C en 40% respectievelijk. Circadiane ritme verwarren voorkomen, altijd experimenten uit te voeren op hetzelfde tijdstip. </li></ol></li><li> Dicht de bovenste cilinder met een barrièrefilm (waslaag) om het ontsnappen van vliegen te voorkomen (Figuur 2). </li><li> Stel de video camera op een statief. Focus camera op de 190 ml regel van de 250 ml maatcilinder (17,5 cm). </li><li> Tel het aantal dode vliegen op de bodem van de cilinder en in het voedsel flesjes. Noteer dit nummer als de sterfte. </li><li> Zeer licht tik op de cilinder tegen een gesloten cel foam pad herhaaldelijk met genoeg kracht om de vliegen te verplaatsen naar het binnenste onderste oppervlak. Tik 5-10 keer terwijl met de andere hand te drukken record op de camera. </li><li> Druk op de &quot;Record&quot; knop op de camera. </li><li> Start de video camera opnemen en tik op de cilinder zes keer in een uitgesproken niet-ritmisch patroon. </li><li> Voer elke proef gedurende 2 minuten vanaf het moment dat de laatste vliegen worden afgetapt en registreer het aantal vliegen die de hoogte van 17,5 cm (190 ml) op elk tijdstip gekozen (kwantificeren iedere 10 sec). Opmerking: Het ml merkteken op de cilinder varieert van één cilinder model naar het andere afhankelijk van de diameter. Om fouten te voorkomen, meet de hoogte op elke cilinder gebruikt. </li><li> Nadat de proef is beëindigd, gooi vliegen in 95% ethanol. </li><li> Herhaal stap 2,1-2,9 totdat alle replicaten werden getest met verse vliegen elke keer. Noot: Hoewel 5 replicaten genoeg met een mutatie die een sterk effect op beweging kan zijn, 10 biologische replicaten van 20 vliegen (200 vliegen) aanbevolen om kleinere verschillen te detecteren. </li><li> Na voltooiing van het experiment, was de cilinders in het lab vaatwasser en droge O / N te worden hergebruikt. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> AnalyZe video&#39;s van elk vliegen proef. Elke 10 sec, nemen het totale aantal vliegen dat de doellijn passeert. <ol><li> Als een vlieg klimt terug naar beneden of daalt, record dat vliegen als -1 en tel de volgende vlieg op de doellijn te steken als het hetzelfde nummer als de vlieg die weer naar beneden geklommen of gedaald. Als bijvoorbeeld de 15 ste fly beneden de doellijn, de volgende vliegen de lijn (de 16 ste fly) wordt beschouwd als de 15 ste vliegen en niet de 16 ste steken. </li></ol></li><li> Trek de sterfte van het totale aantal vliegen (20) om het aantal vliegen die nog in het proces te verkrijgen. Op elk tijdstip, verkrijgen de fractie vliegen boven de doellijn. </li><li> Plot elk percentage op elk tijdstip (zie figuur 3). </li><li> Analyseer de prestaties op de 120 sec gegevenspunt en het uitvoeren student t-test bij 2 groepen aanwezig zijn of ANOVA en post-test voor meervoudige vergelijkingen (met Bonferroni aanpassing van geplande en ongeplande Tukey comparisons). De Kolmogorov-Smirnov test 17 ​​wordt ook uitgevoerd om normaliteit en gelijke verdeling bepalen maar ook om de verdelingen van de mutant groep te vergelijken met de controle. </li><li> Om data over veroudering presenteren plot het percentage vliegen klimmen bij 120 sec met vliegen van verschillende leeftijden (2 dagen, 1 week, 2 weken) om te zien of er een progressieve tekort (figuur 4). </li></ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li>
<li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity%2C+courtship+behavior%2C+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li>
<li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+persistent+Na%2B+current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis%2C+a+complex+behavioral+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li>
<li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer%27s+disease+model%3A+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799(2011).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li>
<li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Nonparametrics+%3A+statistical+methods+based+on+ranks%22">Nonparametrics : statistical methods based on ranks</a>. , 1st edn, Springer. (2006).</li>
<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Drosophila reeds bewezen een uitstekend model van de ziekte 14 en andere neurodegeneratieve aandoeningen Parkinson 1,2 zijn. Naast de genetische gereedschap in Drosophila, is het genoom in hoge mate geconserveerde genen die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen 19. De komst van genoomwijde genetische screening methoden (met inbegrip van exoom sequencing) is waarschijnlijk blijven een grotere lijst van kandidaat-genen geassocieerd met menselijke bewegingsstoornis...

Verwoestende neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, en erfelijke spastische paraplegie worden steeds meer erkend. Helaas zijn de meeste van deze neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds geen behandeling. Het wijdverspreide klinische toepassing van genoom-brede, onpartijdige genetische tests zoals exoom sequencing heeft geleid tot een toenemend aantal genen spelen een rol in humane reumatische ziektes. Ondanks deze vooruitgang, de pathologische voortgang van vroeg tot laat stadium, blijft ongrijpbaar in deze aandoeningen. Drosophila biedt een met de genetische tools voor het bestuderen van gen vereiste in een gecontroleerde ruimtelijke en temporele manier. Daarnaast heeft Drosophila nuttig bij het ​​screenen van drugs voor neurologische aandoeningen zoals Parkinson 1, Alzheimer 2, verstandelijke beperking 3,4- en 5,6 epilepsie oa bewezen. Ons doel was om een ​​rendabele ontwikkelingen betrouwbare test die zou hoge doorvoer analyse die nog steeds gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in de motorische prestaties op te sporen zou zijn mogelijk te maken. Er zijn verschillende assays gebruikt om de effecten van genetische mutatie en / of milieu vast op Drosophila klimgedrag kwantificeren. Het merendeel van de testen te profiteren van de natuurlijke neiging van vliegen te beklimmen, die bekend staat als negatief geotaxis, of het klimmen test. Benzer 7 voorgesteld in 1967 dat de tegenstroom apparaat voor de studie van phototaxis ook kan worden gebruikt om gravitaxis bestuderen. Sindsdien Ganetsky 8 en vele anderen 9 -12 hebben gebouwd op de eerste test. Het principe is om een ​​bekend aantal vliegen te plaatsen in een flesje en tik het flesje sterk tegen een hard oppervlak, waardoor de vliegen naar de bodem van de flacon te vallen. Aangezien het een aangeboren gedrag, zal de vliegen proberen te klimmen naar de top van de flacon, tegen de zwaartekracht. Deze test is kwantitatief en measures hoeveel vliegen hebben beklommen langs een marker op de flacon tijdens een toegewezen periode. Meting van de snelheid in plaats van het totale aantal vliegen klimmen is een betrouwbare parameter en getoond defecten wanneer het aantal vliegen criteria was niet significant 13. The climbing assay is nuttig gebleken bij het ​​bestuderen van vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson 14. Echter, we opgemerkt dat locomotief gebreken niet detecteerbaar kan worden op tijd waar neurodegeneratie al wordt gezien in pathologische studies 14. Aldus kan het gebruik van de traditionele test de mogelijkheid om de vroege stadia van pathogenese te bestuderen beperken. Het uiterlijk van de locomotief defecten tijdens de latere stadia van de pathologie kan een ziekte waarvan de progressie is te geavanceerd voor volledige redding weerspiegelen. Dit brengt het probleem met de gevoeligheid van de traditionele klimmen assay. De potentiële onvermogen van de tranele klimmen assay milde loc defecten detecteren te wijten aan de hoogte waarop de vliegen moeten klimmen. De traditionele assay 15,16 meet het aantal vliegen met succes klimmen over een hoogte van 2-5 cm in 10-20 sec.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td>De stocks worden geselecteerd afhankelijk van de experimenten. De temperatuur en luchtvochtigheid in de kamer en in de incubator moeten worden gecontroleerd en consistent zijn om te voorkomen dat de vliegen te statisch of te nat zijn.</td></tr><tr><td>Videocamera</td><td></td><td></td><td>Elke digitale camcorder is voldoende. Zorg ervoor dat ze zich kunnen richten op nabije objecten.</td></tr><tr><td>Gradueerde cilinder</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Verschillende modellen van een gradueercilinder kunnen een andere diameter hebben. Het is daarom belangrijk om de hoogte te meten.</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Elk model is voldoende. We gebruikten de computer om het klimmen van de vliegen te monitoren en het aantal vliegen op elk tijdstip vast te leggen.</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van klimmen defecten in een drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotief defecten als gevolg van neurodegeneratieve aandoeningen kan een late onset symptoom van de ziekte zijn, na jaren van subklinische degeneratie, en dus de huidige therapeutische behandeling strategieën zijn niet curatief. Door het gebruik van exoom sequencing, een groeiend aantal genen geïdentificeerd die een rol spelen bij menselijke voortbeweging. Ondanks de identificatie van deze genen, is het niet bekend hoe deze genen cruciaal zijn voor normale werking loc. Daarom is een betrouwbare test, die modelorganismen gebruikt om de rol van deze genen te helderen om nieuwe targets te identificeren van therapeutisch belang, is meer dan ooit nodig. We hebben een gesensibiliseerd versie van de negatieve geotaxis test die het mogelijk maakt voor de detectie van mildere gebreken eerder en heeft de mogelijkheid om deze gebreken te evalueren in de tijd gemaakt. De test wordt uitgevoerd in een glazen maatcilinder, die is afgedicht met een was barrièrefilm. Door het verhogen van de drempel afstand te klom naar 17,5 cm en het verhogen van de duur van het experiment tot 2 min hebben we een grotere gevoeligheid bij het opsporen van milde disfuncties mobiliteit waargenomen. De test is kostenbesparend en vereist geen uitgebreide training op zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit maakt het een uitstekende techniek voor het screenen van kandidaat-medicijnen in Drosophila mutanten met motoriek gebreken.

Klimmen is een sterke en reproduceerbaar gedrag. Inderdaad, een dag oud wild-type vliegt bereikt de doelgroep afstand klimmen prestaties snel (25 - 30 sec). Mutant vliegen presenteren een reeks van prestaties van mild (of vertraagd) onvermogen te klimmen naar het doel te voltooien. We illustreren dit hier met twee verschillende mutante allelen. De eerste is een ernstig allel van het gen spastin veroorzaakt door een deletie van het volledige spastin gen (spa 5,75) 18. In deze lijn (spas 5.75 met TM6...

We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van het klimvermogen van wild-type vliegen en vliegen met mutaties in de genen die betrokken zijn bij voortbeweging. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst over te brengen naar een glazen maatcilinder. De tweede stap is om de vliegen naar de bodem van de cilinder te verplaatsen door lichtjes op de cilinder te tikken tegen een schuimrubberen ondergrond.De vliegen die vervolgens de doellijn passeren, worden gedurende twee minuten vastgelegd met een videocamera. De laatste stap is het analyseren van de video's en het uitzetten van het aantal vliegen boven de doellijn elke 10 seconden. Uiteindelijk wordt de klimtest gebruikt om defecten in het klimvermogen van mutante lijnen van fruitvliegen te identificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek, of bestaande technieken, zoals de wild-methode, is het vermogen om kleine verschillen in het klimvermogen te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de rol van specifieke genen bij hereditaire spastische paraparese bij progressieve loopstoornissen. De implicatie van deze techniek is gericht op de ontwikkeling van therapieën.IP voor neurologische aandoeningen, omdat het een eenvoudige kwantitatieve analyse biedt voor het testen van medicijnrespons en mutanten van kandidaatgenen voor neurodegeneratie. Begin met het anesthetiseren van 20 vliegen met koolstofdioxide en plaats alle vliegen in een verzamelbuis van 25 millimeter bij 95 millimeter die voedsel bevat. Bewaar de buis met de vliegen vervolgens horizontaal in een kartonnen tray om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in vloeistof die zich onderin de buis kan ophopen. Plaats de vliegen gedurende ten minste 21 uur in een incubator onder een licht-donkercyclus van 12 uur. Richt de volgende ochtend de klimtest in door de vliegen vanuit de buis over te brengen naar een glazen maatcilinder van 250 milliliter en sluit de bovenkant af met waxfolie om te voorkomen dat er vliegen ontsnappen.Voer het experiment uit bij omgevingslicht, 22 °C en 40% luchtvochtigheid. Voer experimenten altijd op hetzelfde tijdstip van de dag uit om verstorende variabelen door slaapcycli te vermijden. Markeer daarnaast de positie van de cilinder op het werkblad om deze elke dag constant te houden.Tel het aantal dode vliegen onderin de cilinder en in de voedingsbuisjes en noteer dit aantal als de mortaliteit. Plaats vervolgens de videocamera op een statief. Focus de camera zeer voorzichtig op de lijn van 190 milliliter van de maatcilinder van 250 milliliter.Tik vijf tot 10 keer met de cilinder tegen een gesloten celfoamkussen met voldoende kracht om de vliegen naar het binnenoppervlak van de bodem te verplaatsen. Gebruik vervolgens de andere hand om de opnameknop van de camera in te drukken. Tik daarna zes keer tegen de cilinder in een duidelijk niet-ritmisch patroon terwijl de camera opneemt.Voer elke test twee minuten lang uit, gerekend vanaf het moment dat de vliegen voor het laatst zijn getikt. Voeg tenslotte de vliegen toe aan 95% ethanol voor verwijdering. Zodra de test is voltooid, wordt deze klimtest 10 keer herhaald met telkens 20 nieuwe vliegen om kleine verschillen in locomotie tussen de groepen vast te stellen.Was de cilinders in een vaatwasser en laat ze een nacht drogen, zodat ze kunnen worden hergebruikt. Om de prestaties van de vliegen te analyseren zodra het experiment is voltooid, begint u met het bekijken van de video-opnamen van elke vliegtest. Noteer het totale aantal vliegen dat elke 10 seconden de doellijn passeert. Als een vlieg weer naar beneden klimt of valt, noteert u deze vlieg als min één en telt u de volgende vlieg die de doellijn passeert als hetzelfde nummer als de vlieg die naar beneden klom of viel.Als bijvoorbeeld de 15e vlieg onder de doellijn valt, wordt de volgende vlieg die de lijn passeert beschouwd als de 15e vlieg en niet als de 16e. Trek vervolgens de mortaliteit af van het totaal aantal vliegen om het aantal vliegen te bepalen dat in het proefperceel overblijft. Bij het werken met ernstige mutaties kan het percentage vliegen boven de doellijn op elk tijdstip verschillende graden van klimdefecten laten zien via verschillende klimtests.Hier werd het aantal acht dagen oude vliegen dat na 18 seconden naar de bovenkant van een leeg voedingsbuisje klom geregistreerd, waaruit bleek dat er geen significant verschil in klimgedrag bestond tussen de twee groepen. Aan de andere kant vertoonden de Bastin 17 dash seven over TM three mutante vliegen bij gebruik van de klimtest uit dit protocol een tekort in de prestaties vergeleken met de controles. Aangezien veel locomotie-stoornissen progressief zijn, is het belangrijk om de evolutie van de vliegen in de loop van de tijd te observeren.Op twee dagen oude leeftijd is er een significant verschil in het aantal vliegen dat boven de doellijn klimt, in vergelijking met de controles. Deze klimprestatie blijft afnemen naarmate de mutante vliegen ouder worden van twee naar meerdere dagen.Zodra de methode onder de knie is, kunnen dit experiment en de analyse in drie uur worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe locomotiedefecten kunnen worden gekwantificeerd in dola-mutante modellen voor neurologische aandoeningen.

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Deze video beschrijft een eenvoudige methode om vliegbeweging te kwantificeren en toont de uitgevoerde klimtest.  De vliegklimtest is een algemene test van de motorische functie die afhankelijk is van een negatieve geotaxis-respons.

Fly Climbing Assay: een methode om algemene voortbeweging in Drosophila melanogaster te testen

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em&gt; Drosophila</em

Dit stapsgewijze protocol analyseert Drosophila negatieve geotaxis gedrag met behulp van een geautomatiseerd systeem van meerdere cilinders die honderden vliegen en synchroniseert hun optreden door een elektromotor. Bij synchronisatie, is vliegen negatieve geotaxis gedrag vehiculumcontrolegroep, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van de zelf ontworpen RflyDetection software.

Een geautomatiseerde snelle iteratieve negatieve Geotaxis Assay voor het analyseren van volwassen klimmen gedrag in een Drosophila Model van neurodegeneratie

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Het doel van deze procedure is om het dorsale longitudinale spierweefsel (DLM) te ontleden om de structurele integriteit van DLM neuromusculaire knooppunten (NMJs) in neurodegeneratieve ziektemodellen te beoordelen met behulp van Drosophila melanogaster.

Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Dit protocol presenteert een test voor het modelleren van constipatie in een op alfa-synucleïne gebaseerd Drosophila-model van de ziekte van Parkinson.

Constipatie meten in een Drosophila-model van de ziekte van Parkinson

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer een geoptimaliseerde negatieve geotaxis-assay in Drosophila melanogaster om klimdefecten te kwantificeren. Deze gevoelige methode helpt onderzoekers genetische interacties en potentiële geneesmiddeldoelen voor neurodegeneratieve aandoeningen te identificeren.

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Meer video's verkennen