Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen
June 13th, 2015
We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.
Het algemene doel van deze procedure is om het klimvermogen van wilde vliegen en vliegen die gemutaeerd zijn voor de genen die betrokken zijn bij de voortbeweging te kwantificeren. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst over te brengen naar een glazen meetcilinder. De tweede stap is om de vliegen naar de bodem van de cilinder te verplaatsen door lichtjes tegen de cilinder te tikken op een schuimkussen.
Vervolgens worden vliegen die de doellijn oversteken gedurende twee minuten opgenomen met een videocamera. De laatste stap is het analyseren van de video's en het plotten van het aantal vliegen boven de doellijn elke 10 seconden. Uiteindelijk wordt de klimtest gebruikt om defecten in het klimvermogen van mutante lijnen van fruitvliegen te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek, of bestaande technieken, zoals de wilde methode, is dat het de mogelijkheid heeft om kleine verschillen in klimvermogen te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de rol van specifieke genen op erfelijke spastische paraplegie op progressieve loopbeperking. De implicatie van deze techniek is gericht op de ontwikkeling van therapie.
IP voor neurologische aandoeningen omdat het een eenvoudige kwantitatieve test biedt voor het testen van medicijnrespons en mutanten voor kandidaat-neurodegeneratieve genen. Begin door 20 vliegen te verdoven met behulp van kooldioxide en plaats alle vliegen in een verzamelbuisje van 25 millimeter bij 95 millimeter dat voedsel bevat. Bewaar vervolgens het buisje met de vliegen horizontaal in een kartonnen bakje om te voorkomen dat ze worden gevangen in vloeistof die zich in de bodem van het buisje kan ophopen. Plaats de vliegen minimaal 21 uur in een incubator onder een 12-uurs licht-donkercyclus. De volgende ochtend, zet de klimtest op door de vliegen vanuit het buisje over te brengen naar een glazen meetcilinder van 250 milliliter en verzegel de bovenkant met wasfilm om te voorkomen dat vliegen ontsnappen.
Voer het experiment uit bij omgevingslicht van 22 graden Celsius en 40% luchtvochtigheid. Voer altijd experimenten uit op hetzelfde tijdstip van de dag om verwarring met slaapcycli te voorkomen. Markeer ook de locatie van de cilinder op de werktafel om deze elke dag constant te houden.
Tel het aantal dode vliegen op de bodem van de cilinder en in de voedingsbuisjes, noteer dit aantal als de mortaliteit. Zet vervolgens de videocamera op een statief. Richt de camera heel licht op de lijn van 190 milliliter van de meetcilinder van 250 milliliter.
Tik de cilinder vijf tot tien keer tegen een gesloten schuimkussen met voldoende kracht om de vliegen naar het binnenste onderoppervlak te verplaatsen. Gebruik vervolgens de andere hand om op de camera te drukken op opnemen. Tik vervolgens zes keer op de cilinder in een duidelijk niet-ritmisch patroon terwijl de camera aan het opnemen is.
Voer elke proef gedurende twee minuten uit vanaf het moment dat de vliegen voor het laatst zijn getikt. Gooi de vliegen uiteindelijk weg in 95% ethanol. Zodra de proef is voltooid, herhaal deze klimtest 10 keer met elk 20 verse vliegen om kleine verschillen in voortbeweging tussen groepen te detecteren.
Was de cilinders in een vaatwasser en laat ze een nacht drogen om ze opnieuw te gebruiken nadat het experiment is voltooid. Om de prestaties van de vliegen te analyseren, begin met het bekijken van video's van elk vliegproefrecord. Het totaal aantal vliegen dat elke 10 seconden de doellijn passeert. Als een vlieg terugklimt of valt, tel dan die vlieg als min één en tel de volgende vlieg die de doellijn oversteekt als hetzelfde aantal als de vlieg die terugklom of viel.
Bijvoorbeeld, als de 15e vlieg onder de doellijn valt, wordt de volgende vlieg die de lijn oversteekt beschouwd als de 15e vlieg en niet de 16e. Trek vervolgens de mortaliteit af van het totale aantal vliegen om het aantal vliegen dat in de proef aanwezig blijft, te verkrijgen. Het percentage vliegen boven de doellijn op elk tijdstip wanneer gewerkt wordt met ernstige mutaties, kunnen verschillende graden van klimdefect worden gezien met behulp van verschillende klimtests.
Hier werd het aantal 8 dagen oude vliegen dat in 18 seconden naar de bovenkant van een lege voedingsbuis klom, opgetekend en toonde geen significant verschil in klimgedrag tussen de twee groepen. Aan de andere kant, door gebruik te maken van de klimtest van dit protocol, vertonen de Bastin 17 dash zeven over TM drie mutante vliegen een tekort aan prestaties in vergelijking met de controles. Aangezien veel voortbewegingsstoornissen progressief zijn, is het belangrijk om de ontwikkeling van de vliegen in de loop van de tijd te observeren.
Op twee dagen oud is er een significant verschil in het aantal vliegen dat boven de doellijn klimt. Vergeleken met controles. Deze klimprestatie blijft afnemen naarmate de mutante vliegen ouder worden van twee tot dagen.
Eenmaal onder de knie, kan dit experiment en de analyse in drie uur worden voltooid. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben over hoe u voortbewegingsdefecten kunt kwantificeren in dola mutante modellen voor neurologische aandoeningen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxis-test in Drosophila melanogaster, die dient als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. De test is ontworpen om gevoeliger te zijn voor lichte locomotieve defecten, wat helpt bij het screenen voor mogelijke genetische interacties en doelwitten voor medicijnen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Gedragstests
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een veel gebruikt modelorganisme in de neurobiologie.
- Negatieve geotaxis-tests meten het klimmende vermogen van fruitvliegen.
- Het identificeren van locomotieve defecten kan inzichten bieden in neurodegeneratieve aandoeningen.
- Genetische mutaties kunnen de locomotie beïnvloeden, waardoor deze test waardevol is voor onderzoek.
Doel van de studie
- Om het klimmende vermogen van wild type en mutant Drosophila te kwantificeren.
- Om defecten in het klimmende vermogen te identificeren die geassocieerd zijn met specifieke genetische mutaties.
- Om te screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor medicijnen gerelateerd aan locomotie.
Gebruikte methoden
- Vliegjes overbrengen naar een glazen graduatiecilinder.
- Vliegjes naar de bodem verplaatsen door op de cilinder te tikken.
- Vliegjes die een doellijn oversteken opnemen met een videocamera gedurende twee minuten.
- Video's analyseren om het aantal vliegjes boven de doellijn elke 10 seconden te plotten.
Belangrijkste resultaten
- De test kwantificeert met succes het klimmende vermogen bij zowel wild type als mutante vliegjes.
- Het toont gevoeligheid voor lichte locomotieve defecten.
- Resultaten kunnen mogelijke genetische interacties en doelwitten voor medicijnen informeren.
- De methode is betrouwbaar en kosteneffectief voor screeningdoeleinden.
Conclusies
- De negatieve geotaxis-test is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van locomotie bij Drosophila.
- Het kan helpen bij het identificeren van genetische factoren die neurodegeneratieve aandoeningen beïnvloeden.
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om te screenen op therapeutische doelwitten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This assay provides a sensitive, cost-effective method for detecting early locomotor defects in Drosophila models of neurodegenerative disorders, enabling earlier identification of genetic modifiers and therapeutic candidates. By quantifying climbing performance over time, it supports mechanistic de-risking of target hypotheses in discovery pipelines. The method’s reproducibility and scalability make it suitable for screening campaigns aimed at validating disease-relevant mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in locomotion pathways relevant to neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, time-resolved phenotypic readouts for assessing mutant or drug-treated fly performance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects mild climbing defects that may be missed in standard assays, increasing sensitivity for early-stage screening.
- Operational Value: Uses inexpensive, reusable glass cylinders and minimal training, supporting high-throughput compatibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks age-dependent decline in climbing ability, modeling progressive locomotor dysfunction seen in human neurodegeneration.
- Operational Value: Generates longitudinal data to evaluate therapeutic intervention effects over time in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by linking genetic perturbations to quantifiable behavioral phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal integrity.
- Screening: Enables reproducible quantification of fly climbing to assess compound or genetic modifier effects.
- Analytics: Generates time-series data on fly position, allowing calculation of climbing velocity and endurance metrics.
- Translational Research: Models progressive decline in motor function, aligning with preclinical evaluation of disease-modifying candidates.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows reuse across multiple mutant lines and screening campaigns with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to quantifiable locomotor phenotype.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tapping, video capture, and blind analysis protocols.
- Strategic Value: Reduces false negatives in early screening by detecting subtle defects, improving hit-to-lead efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and progression.
Implementation Considerations
- Requires basic fly handling and anesthesia skills using CO2.
- Needs a 250 mL glass graduated cylinder, wax film seal, foam pad, tripod, and video recording device.
- Demands consistent environmental conditions (22°C, 40% humidity, same time of day) to minimize variability.
- Requires training in video analysis to score fly crossings and handle falls or reversals correctly.
- Limited to measuring negative geotaxis; does not assess other motor behaviors like flight or gait coordination.
