Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van het klimvermogen van wild-type vliegen en vliegen met mutaties in de genen die betrokken zijn bij voortbeweging. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst over te brengen naar een glazen maatcilinder. De tweede stap is om de vliegen naar de bodem van de cilinder te verplaatsen door lichtjes op de cilinder te tikken tegen een schuimrubberen ondergrond.

De vliegen die vervolgens de doellijn passeren, worden gedurende twee minuten vastgelegd met een videocamera. De laatste stap is het analyseren van de video's en het uitzetten van het aantal vliegen boven de doellijn elke 10 seconden. Uiteindelijk wordt de klimtest gebruikt om defecten in het klimvermogen van mutante lijnen van fruitvliegen te identificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek, of bestaande technieken, zoals de wild-methode, is het vermogen om kleine verschillen in het klimvermogen te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de rol van specifieke genen bij hereditaire spastische paraparese bij progressieve loopstoornissen. De implicatie van deze techniek is gericht op de ontwikkeling van therapieën.

IP voor neurologische aandoeningen, omdat het een eenvoudige kwantitatieve analyse biedt voor het testen van medicijnrespons en mutanten van kandidaatgenen voor neurodegeneratie. Begin met het anesthetiseren van 20 vliegen met koolstofdioxide en plaats alle vliegen in een verzamelbuis van 25 millimeter bij 95 millimeter die voedsel bevat. Bewaar de buis met de vliegen vervolgens horizontaal in een kartonnen tray om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in vloeistof die zich onderin de buis kan ophopen. Plaats de vliegen gedurende ten minste 21 uur in een incubator onder een licht-donkercyclus van 12 uur. Richt de volgende ochtend de klimtest in door de vliegen vanuit de buis over te brengen naar een glazen maatcilinder van 250 milliliter en sluit de bovenkant af met waxfolie om te voorkomen dat er vliegen ontsnappen.

Voer het experiment uit bij omgevingslicht, 22 °C en 40% luchtvochtigheid. Voer experimenten altijd op hetzelfde tijdstip van de dag uit om verstorende variabelen door slaapcycli te vermijden. Markeer daarnaast de positie van de cilinder op het werkblad om deze elke dag constant te houden.

Tel het aantal dode vliegen onderin de cilinder en in de voedingsbuisjes en noteer dit aantal als de mortaliteit. Plaats vervolgens de videocamera op een statief. Focus de camera zeer voorzichtig op de lijn van 190 milliliter van de maatcilinder van 250 milliliter.

Tik vijf tot 10 keer met de cilinder tegen een gesloten celfoamkussen met voldoende kracht om de vliegen naar het binnenoppervlak van de bodem te verplaatsen. Gebruik vervolgens de andere hand om de opnameknop van de camera in te drukken. Tik daarna zes keer tegen de cilinder in een duidelijk niet-ritmisch patroon terwijl de camera opneemt.

Voer elke test twee minuten lang uit, gerekend vanaf het moment dat de vliegen voor het laatst zijn getikt. Voeg tenslotte de vliegen toe aan 95% ethanol voor verwijdering. Zodra de test is voltooid, wordt deze klimtest 10 keer herhaald met telkens 20 nieuwe vliegen om kleine verschillen in locomotie tussen de groepen vast te stellen.

Was de cilinders in een vaatwasser en laat ze een nacht drogen, zodat ze kunnen worden hergebruikt. Om de prestaties van de vliegen te analyseren zodra het experiment is voltooid, begint u met het bekijken van de video-opnamen van elke vliegtest. Noteer het totale aantal vliegen dat elke 10 seconden de doellijn passeert. Als een vlieg weer naar beneden klimt of valt, noteert u deze vlieg als min één en telt u de volgende vlieg die de doellijn passeert als hetzelfde nummer als de vlieg die naar beneden klom of viel.

Als bijvoorbeeld de 15e vlieg onder de doellijn valt, wordt de volgende vlieg die de lijn passeert beschouwd als de 15e vlieg en niet als de 16e. Trek vervolgens de mortaliteit af van het totaal aantal vliegen om het aantal vliegen te bepalen dat in het proefperceel overblijft. Bij het werken met ernstige mutaties kan het percentage vliegen boven de doellijn op elk tijdstip verschillende graden van klimdefecten laten zien via verschillende klimtests.

Hier werd het aantal acht dagen oude vliegen dat na 18 seconden naar de bovenkant van een leeg voedingsbuisje klom geregistreerd, waaruit bleek dat er geen significant verschil in klimgedrag bestond tussen de twee groepen. Aan de andere kant vertoonden de Bastin 17 dash seven over TM three mutante vliegen bij gebruik van de klimtest uit dit protocol een tekort in de prestaties vergeleken met de controles. Aangezien veel locomotie-stoornissen progressief zijn, is het belangrijk om de evolutie van de vliegen in de loop van de tijd te observeren.

Op twee dagen oude leeftijd is er een significant verschil in het aantal vliegen dat boven de doellijn klimt, in vergelijking met de controles. Deze klimprestatie blijft afnemen naarmate de mutante vliegen ouder worden van twee naar meerdere dagen.

Zodra de methode onder de knie is, kunnen dit experiment en de analyse in drie uur worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe locomotiedefecten kunnen worden gekwantificeerd in dola-mutante modellen voor neurologische aandoeningen.