Name: Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer de isolatie van muizen peritoneale macrofagen voor genexpressie-analyse bij Toll-like receptor-stimulatie. Deze methode verhoogt de opbrengst door monocytmigratie en omvat karakterisatie via flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC verlenen geen 298515-2011). AL is de ontvanger van een Ph.D. beurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC), en MS werd gesteund uit een subsidie ​​van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR, verlenen geen. MOP123246).

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen na goedkeuring door de institutionele Animal Care Committee van het Centre de recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM). 1. Isolatie, identificatie, en cultuur van muizen peritoneale macrofagen <ol><li> Bereid 3,8% brouwer thioglycollaat medium. Om dit te doen, op te schorten 38 g thioglycollaat medium in 1000 ml gedestilleerd water. Breng de oplossing neerkomen op het medium volledig op te lossen. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. Sla tot 3 maanden in het donker, bij RT 18. OPMERKING: Gooi als troebelheid ontwikkelt die een bacteriële besmetting aangeeft. De oplossing kan voor maximaal een jaar worden bewaard in het donker als steriel gehouden. </li><li> Met 1 ml injectiespuiten verbonden met 23 G naalden, spuiten 1 ml 3,8% Brewer thioglycollaat medium in de peritoneale holte van elke mouse en wacht 3 dagen. Gebruik nieuwe spuit en naald voor elke muis. </li><li> Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (100 mg / kg) en euthanaseren muizen door cervicale dislocatie. Bevestig de juiste verdoving door het controleren van de ademhaling. Gewoonlijk snelle ademhaling geven dat de muis niet diep verdoofd. </li><li> Was de buik van elke muis met 70% ethanol. Met behulp van een schaar, voert een laterale insnijding langs de onderkant middellijn van het peritoneum. </li><li> Met behulp van een tang, trek de buik huid om de transparante peritoneale huid bloot. Met 5 ml spuit verbonden 20 G naalden, spuiten 5 ml koud DPBS in de peritoneale holte van elke muis. </li><li> Voer een zachte massage op de buikholte en dan zuigen de vloeistof zorgvuldig zonder aanprikken van een orgaan. Verwijder de naald en afzien van de peritoneale vloeistof in 50 ml conische centrifugebuizen. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 xg in een gekoelde centrifuge.Cellen moeten koud blijven tijdens de hele procedure. Gooi supernatant en resuspendeer celpellet in RPMI medium 1640. </li><li> Met behulp van een hemocytometer tellen cellen en breng de celdichtheid 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Karakteriseren het fenotype van geïsoleerde cellen door flowcytometrie gebruik 1 x 10 6 cellen per muis en antibodie tegen F4 / 80 (a oppervlakteantigeen tot expressie op macrofagen). </li></ol> 2. Cell Behandelingen <ol><li> Direct, na isolatie, voeg 1 x 10 6 cellen in elk putje. Laat het muizen peritoneale macrofagen te houden in de 6-well platen door ze te kweken gedurende 1-2 uur bij 37 ° C. Verwijder niet-hechtende cellen door voorzichtig wassen 3 maal met warm PBS. </li><li> Vervolgens kweekcellen in 900 ul serumvrij DMEM gedurende 24 uur in aanwezigheid van de volgende TLR liganden: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml), poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) , LPS-TLR4 (100 ng / ml), flagelline-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM). OPMERKING: Bereid je voor elk ligand een 10x voorraad-oplossing. Voeg 100 ul van deze laatste aan elk putje, waardoor het uitvoeren van een 10-voudige verdunning. </li></ol> 3. RNA Isolation <ol><li> Verwijderen medium en lyseren cellen rechtstreeks in de platen met zes putjes door het toevoegen van 1 ml TRIzol aan elk putje en het afleggen van cellysaat meermaals door een pipet. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5-10 min bij kamertemperatuur, om de volledige dissociatie van nucleoproteïne complexen mogelijk maken. </li><li> Transfer lysaat in 1,5 ml RNase- en DNase-vrij microcentrifugebuizen. Voeg 0,2 ml chloroform per 1 ml TRIzol. Schud buizen krachtig met de hand gedurende 15 seconden en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 min. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Observeer het mengsel scheiden in een lagere rode fase (fenol-chloroform), een tussenfase en een kleurloze bovenste waterige fase. RNA blijft exclusief in de waterige fase. </li><li> TranSfer voorzichtig de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis zonder de interfase. Neerslaan van het RNA door het te mengen met 0,5 ml isopropylalcohol. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Het RNA precipitaten vormt een witte pellet aan de zijkant en onderkant van de buis. </li><li> Verwijder supernatant. Was de RNA pellet één keer met 1 ml 75% ethanol. Meng de monsters door vortexen en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Kort droog de RNA (lucht drogen 10 min). Los RNA in 0,1 ml DEPC (RNAse vrij water) en incubeer gedurende 10 minuten bij 55 ° C. </li><li> Kwantificeren RNA met behulp van een spectrofotometer. Om dit te doen, te verdunnen monsters 100 keer in DEPC water en te lezen op golflengten van 260 nm. De RNA-concentratie wordt dan: OD 260 x 40 ng / ul x verdunningsfactor. </li><li> Equalize RNA concentraties en synthetiseren cDNA volgens instructies van de fabrikant gebruikt RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis Kit. Alsinstructies van de fabrikant, meet-gen mRNA levels door real-time PCR (45 cycli) in een Real-Time DNA detectiesysteem. Normaliseren genexpressie niveaus met twee huishoudgen bijvoorbeeld β-actine en GAPDH. OPMERKING: Normaliseer RNA concentratie 500 ug / ml en 0,5 ug gebruik voor cDNA-synthese. </li></ol>

<ol><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+macrophages+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trophic macrophages in development and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Koury, M. J., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%3A+the+roles+of+folate%2C+vitamin+B12%2C+and+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron.</a> Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).</li>
<li>Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-heme+induction+of+heme+oxygenase-1+does+not+alter+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism.</a> J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).</li>
<li>Hershko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+iron+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Hematol%22%5BJournal%5D)">Storage iron regulation.</a> Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).</li>
<li>Collins, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Withholding+iron+as+a+cellular+defence+mechanism--friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe.</a> Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).</li>
<li>Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+reticulo-endothelial+cell+in+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism.</a> Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).</li>
<li>Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signal+adaptor+protein+MyD88+is+required+for+sustained+endotoxin-induced+acute+hypoferremic+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).</li>
<li>Zumerle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+hepcidin+in+the+liver+recapitulates+the+hemochromatotic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype.</a> Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).</li>
<li>Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+expression+and+iron+transport+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin%2C+a+putative+mediator+of+anemia+of+inflammation%2C+is+a+type+II+acute-phase+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein.</a> Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+regulates+cellular+iron+efflux+by+binding+to+ferroportin+and+inducing+its+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization.</a> Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).</li>
<li>Constante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+Hfe+in+basal+and+induced+hepcidin+levels+in+iron+overload+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycolate+on+phagocytic+and+microbicidal+activities+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages.</a> Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).</li>
<li>Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycollate+on+macrophage+lysosomal+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes.</a> Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).</li>
<li>Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+products+in+aged+thioglycollate+medium+enhance+the+elicitation+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).</li>
<li>Layoun, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+wall+constituents+induce+hepcidin+expression+in+macrophages+through+MyD88+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling.</a> Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).</li>
<li>Oppenheim, J. J., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarmins%3A+chemotactic+activators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alarmins: chemotactic activators of immune responses.</a> Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).</li>
<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+gene+expression+in+activated+and+resting+primary+macrophages+by+IL-10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10.</a> J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+macrophages+from+bone+marrow%2C+spleen+and+peritoneum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum.</a> BMC Immunol. 14 (6), (2013).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Cannon, G. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+capacity+for+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The macrophage capacity for phagocytosis.</a> J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).</li>
<li>Wang, Y., Harris, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in renal disease.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).</li>
<li>Schleicher, U., Bogdan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+culture+and+flow-cytometric+characterization+of+primary+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages.</a> Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Macrofagen zijn cruciaal om te overleven en zorgen voor een verleidelijk doelwit aan de gastheer voor immunologische doelstellingen te manipuleren. De ontdekking van TLRs en andere herkenningsmoleculen zijn de macrofagen uitgevoerd om het centrum van immunologische behandeling. Macrofagen reageren op diverse stimuli, waaronder cytokinen, beschadiging geassocieerde moleculaire patroon molecules (gedempt) 20 en moleculen geassocieerd met groepen pathogenen (PAMPs) 21. Deze verschillende stimuli respo...

Het reticuloendotheliaal fagocytaire systeem bestaat uit cellen in diverse weefsels en organen zoals beenmerg, bloed, lever en milt. Macrofagen worden uitgebreid verdeeld rond het lichaam, met name wanneer zij deelnemen aan aangeboren en adaptieve immuunreacties op controle en duidelijke infecties. Naast hun rol bij de afweer, macrofagen een belangrijke rol bij wondheling en ter handhaving weefselhomeostase 1,2 spelen. Bovendien macrofagen niet alleen belangrijk voor immuunfunctie maar ook actief deelnemen aan ijzer homeostase 3. In het lichaam ongeveer 80% ijzer aanwezig in hemoglobine in erytrocyten, die bij senescent gefagocyteerd door macrofagen 4. Dagelijks zijn deze macrofagen recyclen 25 mg-erytrocyten afgeleid ijzer en bieden het transport in het plasma 5. Bovendien, tijdens infectie en inflammatie, pro-inflammatoire macrofagen sekwestreren serumijzer ijzer- availabili verminderenty om ziekteverwekkers, zowel op systemische en lokale niveaus 6-8. Als goed, hebben studies aangetoond dat macrofagen en vooral levercellen produceren een antimicrobiële peptiden genaamd hepcidin die wordt beschouwd als de meester regulator van ijzer metabolisme 9, 10. Hepcidin wordt vooral vergroot door inflammatoire stimuli en is gedeeltelijk verantwoordelijk voor ijzer opslag in macrofagen na chronische ontsteking 11-13. Zoals hepcidin expressie in macrofagen is niet erg goed begrepen, hebben we de mogelijke rol van Toll-like receptoren (TLR) in deze regeling. De TLRs zijn vooral te vinden op macrofagen en spelen een centrale rol in hun activering. Bovendien LPS geïnduceerde hepcidin expressie in de lever is afhankelijk van TLR4 13. Derhalve ons onderzoek uitgevoerd, gebruikten we een methode waarbij de isolatie van muizen peritoneale macrofagen. Macrofaag cellijnen worden breed gebruikt in macrofaag studies; niettemin uitgebreide cultuur kan gen verlies provoceren en verminderde immuunfuncties in deze cellijnen. Aldus isolatie van macrofagen uit buikholte cruciaal. De muis peritoneale holte weer een ideale plaats om macrofagen 13-15 oogsten. Geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen zijn handig voor verschillende studies met betrekking tot hun immunologische functie. Echter, het aantal macrofagen in het buikvlies onvoldoende voor uitgebreide studies en wordt geschat ongeveer 1 x 10 6 macrofagen per muis. Aldus macrofagen uitgang verhogen, een steriele opwekken middel zoals thioglycollaat werd geïnjecteerd in de peritoneale holte voorafgaande aan de celoogst. Na thioglycollaat injectie werd de opbrengst aan macrofagen per muis verhoogd 10-voudig. Ondanks de toename in macrofagen opbrengst thioglycollaat medium fungeert Brewer&#39;s als irritant dat een ontstekingsreactie induceert, resulterend in de rekrutering van macrofagen, waarvan may maar niet noodzakelijk van invloed op de genexpressie. Daarom moet een controlegroep bestaande uit niet behandelde macrofagen Bij elk experiment. In onze handen werd hepcidin uitdrukking die sterk bevorderd door ontsteking niet gedetecteerd in onbehandelde thioglycollaat opgewekte peritoneale macrofagen. Bovendien hebben studies aangetoond dat Brewer thioglycollaat werft tal van macrofagen, maar hen niet activeren 16. Anderzijds, Brewer thioglycollaat opgewekte macrofagen werd een verhoogde lysosomale enzym maar een daling doden ingenomen organismen 17. Echter, de fagocytische capaciteit niet beïnvloed in vergelijking met niet- 16 opgewekte macrofagen. Wanneer gekweekt in schotels, de peritoneale macrofagen worden adherent, waardoor deze hun scheiding van andere soorten cellen geïsoleerd uit de peritoneale holte. Vervolgens werden de geïsoleerde macrofagen blootgesteld aan verschillende TLRs agonisten.Tenslotte werd mRNA geëxtraheerd uit de gekweekte cellen en genexpressie werd geanalyseerd met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (qRT-PCR).

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, VS)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycollaat</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% natriumpentobarbital (Gebruikt voor muizenanesthesie (80 mg/kg, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), geplaatst op ijs en zal dienen om macrofagen te verzamelen</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-medium 1640 (Supplement met penicilline, streptomycine, L-glutamine en 10% foetaal runderserum).</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>1 en 5 ml spuiten</td><td>BD USA (NJ)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>Corning Incorporated (NY, VS)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Bacterieel lipoproteïne Pam3CSK4 (0,5 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>Polyionosine&ndash;polycytidylzuur (Poly(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS van Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverde flagelline van Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteïne synthetisch FSL1 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>ssRNA afgeleid van de HIV-1 lange terminale herhaling ssRNA40 (1 &mu;g/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>Type B CpG-oligonucleïde ODN1826 (1 &mu;M)</td><td>InvivoGen (San Diego, VS)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canada)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>20 G en 23 G naalden</td><td>BD USA (NJ)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml kegelvormige buizen geplaatst op ijs</td><td>Sarstedt (Newton, MA, VS)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcellen lyse buffer</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80 antilichaam</td><td>BIO-RAD (CA, VS)</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 antilichamen</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, VS)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf buisjes</td><td>Axygen Scietific (CA, VS)</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific (ON, Canada)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>JT Baker (PA, VS)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>75% ethanol (in DEPC behandeld water)</td><td>Commercial Alchohols (QC, Canada)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>0,01% di-ethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water (laat overnacht staan en autoclaveer)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT-PCR systeem</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect SYBR Green I PCR kits</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie bij toll-like receptoren stimulatie

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Tijdens infectie en inflammatie, circulerende monocyten verlaat de bloedbaan en migreren naar de weefsels, waar ze differentiëren tot macrofagen. Macrofagen uiten oppervlakte Toll-like receptoren (TLRs), die moleculaire patronen geconserveerd door evolutie in een breed scala van micro-organismen te herkennen. TLRs spelen een centrale rol bij de activering van macrofagen die meestal geassocieerd met gen expressie verandering. Macrofagen zijn van cruciaal belang bij vele ziekten en hebben zich ontwikkeld tot een aantrekkelijk doelwit voor therapie. In de onderstaande voorschriften beschrijven we een werkwijze voor peritoneale murine macrofagen middels Brewer&#39;s thioglycollaat medium te isoleren. De laatste zal monocyten migratie stimuleren in het buikvlies, dus dit zal macrofaag opbrengst te verhogen met 10-voudig. Verschillende studies zijn uitgevoerd met behulp van het beenmerg, milt of peritoneale macrofagen afgeleid. Echter, werden peritoneale macrofagen getoond rijper wanneer de cellen zijn en zijn stabieler in hun functioneleteit en fenotype. Aldus macrofagen geïsoleerd uit muizen peritoneale holte tijdens een rit aanzienlijk celpopulatie die kan dienen verschillende immunologische en metabolische studies. Eenmaal geïsoleerd, werden macrofagen gestimuleerd met verschillende TLR liganden en bijgevolg genexpressie werd geëvalueerd.

We hebben eerst gekenmerkt de geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen door flowcytometrie. Hiervoor gebruikten we (F4 / 80) antilichamen die specifiek markers alleen macrofagen tot expressie. Deze karakterisering is vereist om het percentage van geïsoleerde macrofagen bepalen en het onderscheiden tussen cellen verkregen tijdens de isolatiewerkwijze. Zoals getoond in (figuur 1), het percentage van cellen die het antigeen F4 / 80 werd consistent gevonden dat boven 95%. Vervolgens, om genexpressie in mac...

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van peritoneale macrofagen van muizen en het uitvoeren van genexpressieanalyse na stimulatie van toll-like receptoren. Dit wordt bereikt door eerst 3,8% brewer's thioglycolate medium in de peritoneale holte van de muis te injecteren om de migratie van monocyten naar het peritoneum te verhogen en daarmee de opbrengst aan macrofagen te vergroten; na drie dagen wordt de muis geëuthanaseerd en wordt koud ECCOs fosfaatgebufferde zoutoplossing in de peritoneale holte geïnjecteerd om de cellen te oogsten.Na een zachte massage van de peritoneale holte wordt het peritoneale vocht voorzichtig geaspireerd. Vervolgens worden de verkregen cellen gekweekt en worden de opgewekte peritoneale macrofagen gekarakteriseerd middels flowcytometrie. De laatste stap is om deze macrofagen te stimuleren met verschillende toll-like receptor- of TLR-liganden en het RNA uit de monsters te isoleren.Uiteindelijk wordt kwantitatieve reverse transcriptase polymeraseketenreactie gebruikt om de expressie van het gen van belang te meten. Het doel van de volgende procedure is het isoleren van peritoneale macrofagen met behulp van brewer's TIO glycol medium. Dit medium zal de migratie van monocyten naar het peritoneum verhogen en daarmee de opbrengst aan macrofagen vergroten.Zodra de microfagen zijn geïsoleerd, worden ze gestimuleerd met verschillende toll-like receptor-liganden om de moleculaire regulatie van hepcidin als ons gen van belang te bestuderen. Bereid eerst 3,8% brewer's bio glyco eight-medium voor zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikmakend van spuiten van één milliliter voorzien van naalden met een maat van 23 gauge. Injecteer één milliliter 3,8% brewer's bio glycol eight-medium in de peritoneale holte van elke muis en wacht drie dagen.Gebruik voor elke muis een nieuwe spuit en naald na het anesthetiseren en euthanaseren van de muizen zoals beschreven in het tekstprotocol en bevochtig de buik van elke muis met 70% ethanol. Maak met een schaar een laterale incisie langs de onderste middellijn van het peritoneum. Gebruik een pincet om de buikhuid terug te trekken en het transparante peritoneale vlies bloot te leggen.Inject vervolgens vijf milliliter koud ECCOs fosfaatgebufferde zoutoplossing in de peritoneale holte van elke muis met vijf milliliter spuiten voorzien van naalden met een maat van 20 gauge. Masseer de peritoneale holte voorzichtig en aspireer daarna de vloeistof zorgvuldig zonder een orgaan te doorprikken. Verwijder de naald en breng het peritoneale vocht over in conische centrifugebuizen van 50 milliliter.Centrifuge vervolgens het verzamelde peritoneale vocht gedurende 10 minuten bij 400 ×g of 1500 RPM in een gekoelde centrifuge; de cellen moeten gedurende de gehele procedure koud worden gehouden. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in RPMI 1640-medium. Tel de cellen met een hemocytometer en pas de monsters aan tot een celdichtheid van 1 miljoen cellen per milliliter.Karakteriseer het fenotype van de geïsoleerde cellen via flowcytometrie om de verrijking van macrofagen te bevestigen. Gebruik 1 miljoen cellen per muis en antilichamen tegen F4/80, een oppervlakteantigeen dat direct op macrofagen tot expressie komt. Voeg na isolatie 1 miljoen cellen toe aan elke put van een zeswellplaat.Wellplaat. Laat de murine peritoneale macrofagen hechten aan de wells door ze één tot twee uur lang te cultiveren bij 37 °C. Verwijder na incubatie de niet-hechtende cellen door drie keer voorzichtig te wassen met warme fosfaatgebufferde zoutoplossing.Voeg vervolgens 900 µL serumvrij DMEM toe aan de cellen. Bereid 10 x stockoplossingen voor van elke toll-like receptor of TLR-ligand, zoals vermeld in het tekstprotocol. Voeg daarna 100 µL van de stockoplossingen toe aan elke put, waardoor een tienvoudige verdunningscultuur wordt gerealiseerd.Houd de cellen 24 uur lang in aanwezigheid van de TLR-liganden. Om de RNA-isolatie uit te voeren, verwijdert u eerst al het medium en lyseert u de cellen direct in de zeswells-platen door één milliliter triol-reagens aan elke well toe te voegen en het cellysaat meerdere keren door een pipet te halen.Incubeer de gehomogeniseerde monsters vervolgens vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur om de volledige dissociatie van nucleaire proteïnecomplexen mogelijk te maken. Breng na incubatie het lysaat over in 1,5 milliliter RNA- en DNA-vrije microcentrifugebuisjes en voeg 0,2 milliliters chloroform toe per één milliliter triol-reagens. Schud de buisjes 15 seconden krachtig met de hand voordat ze vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd.Centrifuge vervolgens bij 12.000 ×g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Observeer dat het mengsel zich scheidt in een onderste rode fenol-chloroformfase, een interfase en een kleurloze bovenste waterfase. Het RNA blijft uitsluitend in de waterfase.Overbreng de bovenste waterige fase voorzichtig naar een nieuwe buis zonder de interfase te verstoren. Precipiteer het RNA door de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur te laten incuberen en vervolgens te mengen met 0,5 milliliter isopropylalcohol. Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 ×g bij vier graden Celsius.Het RNA slaat neer en vormt een wit pellet aan de zijkant en bodem van de buis. Verwijder het supernatant en was het RNA-pellet één keer met één milliliter 75% ethanol. Meng de monsters door middel van vortexen en centrifugeer vervolgens op 7.500 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en laat het RNA kortstondig 10 minuten aan de lucht drogen. Los het RNA vervolgens op in 100 µL RNA-vrij water en incubeer dit 10 minuten bij 55 °C. Kwantificeer daarna het RNA met behulp van een spectrofotometer.Verdun de monsters 100 keer in RNA-vrij water en lees bij golflengten van 260 nanometer om de RNA-concentraties gelijk te maken, en synthetiseer cDNA volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik hiervoor de R-T-P-C-R-kit voor de synthese van de eerste cDNA-streng. Meet vervolgens de gen-mRNA-niveaus via real-time PCR in een real-time DNA-detectiesysteem, waarbij de genexpressieniveaus worden genormaliseerd met twee housekeeping-genen.De geïsoleerde peritoneale macrofagen werden gekarakteriseerd via flowcytometrie om het percentage geïsoleerde macrofagen te bepalen en deze te onderscheiden van andere cellen die tijdens het isolatieproces zijn verkregen. Het percentage cellen dat het antigeen F4/80 tot expressie bracht, bleek consistent boven de 95% te liggen. De geïsoleerde cellen werden vervolgens behandeld met verschillende TLR-liganden en mRNA. De hepcidine-spiegels werden gemeten via RT-PCR voor tollike receptor 1 en 2, en tollike receptor 4.Een olic receptor zes en twee liganden waren in staat om hepcidine mRNA te stimuleren in spiegelende macrofagen. Samen tonen deze resultaten het nut van dit protocol aan om succesvol spiegelende peritoneale macrofagen te isoleren en de moleculaire regulatie van genexpressie nauwkeurig te onderzoeken. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u spiegelende peritoneale macrofagen kunt isoleren, identificeren en kweken.

isolation-murine-peritoneal-macrophages-to-carry-out-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De peritoneale holte in zoogdieren bevat verschillende immuun cel populaties cruciaal voor de aangeboren immuunrespons. Een efficiënte isolatie methode is vereist voor biochemische en functionele analyse van deze cellen. Hier bieden wij een uitgebreide methode voor de isolatie van de peritoneale holte cellen in de muis.

Isolatie van Mouse buikholte Cellen

This video demonstrates the activation of a mouse's peritoneal macrophages using intravenous immunoglobulin and bacterial lipopolysaccharide. The co-stimulation activates the peritoneal macrophages into anti-inflammatory macrophages possessing immune regulatory activity.

In Vivo Activation of Peritoneal Macrophages in Response to Antibodies in a Murine Model

This video demonstrates a procedure for analyzing peritoneal macrophage-mediated efferocytosis of apoptotic mouse thymocytes by fluorescence microscopy.

Analysis of Efferocytosis of Apoptotic Thymocytes by Peritoneal Macrophages

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Leer de isolatie van muizen peritoneale macrofagen voor genexpressie-analyse bij Toll-like receptor-stimulatie. Deze methode verhoogt de opbrengst door monocytmigratie en omvat karakterisatie via flowcytometrie.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

Meer video's verkennen